AK wird von der Oppenheim-Stiftung und RH unterstützt wird von der Velux-Stiftung. Wir danken I. Krumbein für technische und K. Buder für histologische Unterstützung, und J. Goldschmidt (Leibniz-Institut für Neurobiologie, Magdeburg, Deutschland) für technische Beratung bezüglich TIMM Färbung.

Alle Tier Eingriffe werden in Übereinstimmung mit der Europäischen Konvention zum Tierpflege und Verwendung von Labortieren und dem ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt. Alle Versuche werden von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Das Verfahren von der Schädigung bei Mäusen anderswo 9 beschrieben. 1. Intravitreale Injektion Mangan <ol><li> Führen Sie die Mn 2 +-Injektion 24 Stunden vor der MR-Scan mit Hilfe eines Assistenten. Anesthetize die Tiere durch intraperitoneale Injektion einer 5% Chloralhydrat-Lösung (420-450 mg / kg Körpergewicht in sterile PBS). Weitere Lokalanästhesie, einen Tropfen Flüssigkeit conjuncain (0,4% Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut vor Augen Punktion. Um injizieren 15 nmol Mn 2 + pro Auge bereiten eine 7,5 mM MnCl 2-Lösung, z. B. durch Verdünnen von 1 L 1 M MnCl2 Stammlösung in 132 LH 2 &lt;/ Sub&gt; O. Last 5 ul der Endlösung in eine 5 ul-Hamilton-Spritze mit einem 34 G kleinen Hub abnehmbare Nadel (RN Nadel) verbunden ist. </li><li> Beim Start mit dem rechten Auge, positionieren Sie die Maus nach links seitig unter einem Binokular und sanft öffnen und fixieren das rechte Auge zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Nehmen Sie die Spritze mit der rechten Hand und fassen Sie die Nadel in der Nähe der Spitze. Atraumatische Punktion des Augapfels, die Nadel vorsichtig in den Glaskörpereinsatz am infero-zeitlichen Umfang von etwa 1 mm distal des Limbus, dadurch Schonung skleralen Gefäße. </li><li> Als nächstes wendet der Assistent langsam das Gesamtvolumen von 2 ul, während die Skala des Hamilton-Spritze. Während dieses Vorgangs überwachen die optimale Platzierung der Nadel unter dem Mikroskop und Punktion der Linse oder Verschütten der Flüssigkeit zu vermeiden. Halten Sie die Nadel statisch für weitere 30 Sekunden eingefügt, dann langsam zurückziehen, um Flüssigkeit zu minimierenLeckage aus der Injektionsstelle. </li><li> Während des gesamten Verfahrens, sollte besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, um Druck auf das Auge zu vermeiden. Ebenso vermeiden harsche oder zahlreiche Versuche, um das Auge Glühbirne durchstechen. Da Mn 2 +-Aufnahme in RGZ und Transport entlang der ON ist bereits bei 15 nmol MnCl2 gesättigten minimiert diese Signalschwankungen um etwas ungenau Injektionsvolumina. Für bilaterale Signalverstärkung der visuellen Projektion, wiederholen Sie den Einspritzvorgang für das linke Auge. </li><li> Gelten Ofloxacin enthaltenden (3 mg / ml) Augentropfen und Panthenol haltige Salbe einmal nach dem Verfahren, Augeninfektionen und Trocknen des Auges zu verhindern. Liefert die Mäuse in ihre Käfige unter normalen Wohnbedingungen bis zum Beginn der MR-Scan. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere für die MRT <ol><li> Betäuben die Maus durch die Verabreichung von 2% / 98% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch. Montieren Sie die Maus auf eine Maushalterung in einem fast horizontal, aufgedreht Position. Insert es in den MR-Spule, die dann innerhalb des MR-Scanners angepasst. Überwachung der Atmung und der Herzfrequenz durch geeignete Systeme. Für technische Details siehe Herrmann et al 20. </li><li> Während der MRT-, Liefer-Anästhesie durch kontinuierliche Insufflation einer zunächst 1,5% / 98,5% Isofluran / Sauerstoff-Gasgemisch über einen Verdampfer zur Maus Kopfhalter durch eine integrierte Rohr verbunden. Während der Abtastung nach der aufgezeichneten Vitalparameter (dh Ziel für eine stabile Atmungsrate von etwa 40 Atemzüge pro Minute) Einstellen der Tiefe der Anästhesie. Verwendung einer Heizvorrichtung halten den Körper Oberflächentemperatur stabil zwischen 35 und 37 ° C, wie durch einen Temperatursensor an der Bauchfalte des Maus positioniert gemessen. Für technische Details siehe Herrmann et al 17. </li><li> Nach dem Scan, befreien Sie die Maus aus der Halterung und mit reinem Sauerstoff zu versorgen, um aus der Narkose zu beschleunigen. Darüber hinaus stabil zu halten, die Körpertemperatur durch die Verwendungein rotes Licht Wärmequelle. </li></ol> 3. MRT-Protokoll <ol><li> Das Protokoll für ein 3-Tesla-Scanner mit einer dedizierten, SNR-effiziente, Kleintier Spule (linear polarisierten Litz Spule) ausgestattet mit einer effektiven Sichtfeld von 35 mm × 38 mm Durchmesser geprüft. Betreiben Sie die Spule in Sende-Empfangs-Modus. </li><li> Mit dem Tier in seiner endgültigen Position, stellen Sie die Melodie und Spiel der Spule mit Hilfe einer Frequenzanalyse. Manuelle Einstellung der Sender Referenzspannung und die Shimströme zu Bildhomogenität und Qualität zu optimieren. </li><li> Erwerben T 1 gewichtet 2D-TSE-Bilder mit einer Auflösung von 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm in sagittaler und transversaler Ansicht für die Planung. Mit Hilfe der Planung MR-Scans, die MEMR Bilder in koronalen Messrichtung zu erwerben, gedreht parallel zum Kopf des Tieres mit Phasenkodierung entlang der Links-Rechts-Richtung sein. Um Erfassungszeit zu minimieren, verwenden eine rechteckige Sichtfeld, um die eingestelltetatsächlichen Kopfabmessungen. Verwenden Sie ein verwöhntes 3D FLASH-Sequenz (VIBE 3D) mit folgenden Parametern: Grundmatrix 256, Sichtfeld 54 mm x 50,65 mm x 14,08 mm, mit 93,8% rechteckigen Sichtfeld in Phasencodierrichtung und 128 Scheiben von 0,11-mm- Schichtdicke mit Scheibe Auflösung auf 61% festgelegt. </li><li> Aktivieren Sie die in-plane-Interpolation, um die endgültigen Bilder mit 512 × 480 × 128 schaffen, bietet eine effektive Auflösung von 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm interpoliert), Echozeit T E = 6,51 ms, Wiederholungszeit T R = 16 ms, Bandbreite = 160 Hz / Pixel, Flip-Winkel = 22 °. Tragen Sie zwei Durchschnitte und drei Wiederholungen, um eine Gesamtaufnahmezeit (T A) von ca. 30 min zu erreichen. </li></ol> 4. MRI Data Analysis <ol><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe der Software syngo Fastview. Für die quantitative Signalverstärkung, wählen definierten Regionen of Interesse planaren 2D-MRT-Aufnahmen und Signalintensitäten zu bestimmen (SI) der verstärkten Struktur (SI MEMRI), Gewebehintergrund (SI backgr) und der Standardabweichung des Rauschens (SD N). Falls erforderlich, verwenden Sie eine Maus Hirnatlas zu neuro-anatomische Orientierung für LGN und SC Strukturen erleichtern. Berechnet den Kontrast-Rausch-Verhältnis (CNR) nach der Formel: </li><li> CNR = (SI MEMRI - SI backgr) / SD-N </li><li> Quantifizieren drei aufeinander folgenden Bilder für mittlere CNR Berechnung für jede Probe. In bilateral injizierten Tieren, analysieren jede Hemisphäre unabhängig. </li><li> Für Darstellung von horizontal, koronale und sagittale Bilder, berechnen multiplanare Rekonstruktionen aus dem Original-3D-MRI-Datensatzes. Diese bearbeiteten Bilder werden nicht für die quantitative Analyse empfohlen. Um animierte 3D-Rekonstruktionen (Maximum Intensity Projektionen, MIPs) der retino erstellenTectalen-Projektion, verwenden Sie eine Angiographie Post-Processing-Software-Modul. </li></ol> 5. Mn 2 + Autometallographie (TIMM Färbung) <ol><li> Timm Färbung von Mn 2 + zurückzuführen Hirnstrukturen folgende MEMRI injizieren eine Dosis von 15-150 nmol Mn 2 + ivit 24 Stunden vor der Bilderzeugung. </li><li> Nach der MR-Scan, durchströmen die Tiere mit 30 ml eiskaltem 0,325% Na 2 S in PBS (pH 7,4). Präparieren Sie retinae und gefrier Proben in Gefrierschnitt. </li><li> Schneiden sequentiell, Äquatorial Abschnitte von 15 um Dicke auf einer Kryotom. </li><li> Führen TIMM Färbung 21 in Abwesenheit von Fixiermittel und nach Kryokonservierung Angenstein et al 22. </li></ol> 6. Statistische Analyse Führen Sie statistische Analysen unter Verwendung des Student-t-Test für Einzelvergleiche, gefolgt von Post-hoc-ANOVA. Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Individuelle N Zahlenfür jedes Experiment angegeben. Ergebnisse Erreichen P ≤ 0,05 werden als statistisch signifikant (p ≤ 0,05, *: P ≤ 0,01, **: P ≤ 0,001, ***).

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	<li>Kretz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simvastatin+promotes+heat+shock+protein+27+expression+and+Akt+activation+in+the+rat+retina+and+protects+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Simvastatin promotes heat shock protein 27 expression and Akt activation in the rat retina and protects axotomized retinal ganglion cells in vivo.</a> Neurobiol Dis. 21, 421-430 (2006).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+therapy+stimulates+long-distance+regeneration,+target+reinnervation,+and+partial+recovery+of+vision+after+optic+nerve+injury+in+mice.">Combinatorial therapy stimulates long-distance regeneration, target reinnervation, and partial recovery of vision after optic nerve injury in mice.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 153-172 (2012).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+axon+regeneration+in+the+adult+mouse+optic+nerve+and+partial+recovery+of+simple+visual+behaviors.">Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9149-9154 (2012).</li><li>Goetze, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+and+visual+cortical+maps+in+mice+with+a+photoreceptor+synaptopathy:+reduced+but+robust+visual+capabilities+in+the+absence+of+synaptic+ribbons.">Vision and visual cortical maps in mice with a photoreceptor synaptopathy: reduced but robust visual capabilities in the absence of synaptic ribbons.</a> Neuroimage. 49, 1622-1631 (2010).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Pautler, R. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

MEMRI des visuellen Systems erstreckt herkömmlichen neurobiologische Techniken zur Beurteilung der Funktionalität unter naiven und pathologischen Bedingungen. Neben der einzigartigen Einblick in die Integrität eines isolierten ZNS-Fasertraktes, können MEMRI leicht mit Verhaltenstests, z. B., Optometrie und visuell basierte Wasser Aufgaben ergänzt werden, um die unmittelbaren Folgen eines bestimmten Paradigma für die visuelle Wahrnehmung zu untersuchen. Es verbindet auch elektrophysiologische und histologi...

Aufgrund seiner günstigen neuro-anatomische Struktur das Nagetier visuelle System bietet einzigartige Möglichkeiten, pharmakologische Verbindungen und deren Eignung zur Neuroprotektion 1 oder pro-regenerative Wirkung 2,3 vermitteln. Darüber hinaus ermöglicht es Studien über die funktionalen und neuroanatomischen Merkmale von Mausmutanten, wie kürzlich für die Mäuse, denen der präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon 4 veranschaulicht. Ferner ist ein breites Spektrum von Zusatzwerkzeugen bietet zusätzliche mit der retinalen Ganglienzellen (RGC) und RGC-Axone Nummern RGC-Aktivität, z. B. durch Elektroretinographie und Verhaltenstests und der Bestimmung der kortikalen Umlagerungen durch optische Abbildung der intrinsischen Signalen. Die neuesten technischen Entwicklungen in der Laser-Mikroskopie ermöglicht die in situ-Visualisierung von RGC Regeneration durch tiefe Gewebe Fluoreszenz-Imaging in ganze Berg Exemplare der Sehnerv (ON) und Gehirn. In dieser histologischenschen Ansatz, Tetrahydrofuran basierte Gewebe Clearing in Kombination mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Auflösung von Einzelfasern, die in die deafferentierten ON und Tractus 5 erneut eingeben. Während solche Techniken vielleicht überlegen in der Auflösung und Bestimmung von Wachstumsmustern zu sein, haben sie nicht aktivieren wiederholende und Längsschnittanalysen der einzelnen Wachstums Ereignisse, die besonders erwünscht sind, den Prozess der langfristige Regeneration zu beurteilen. Kontrastmittel-MRT ist für die minimal invasive Visualisierung der retino tectalen-Projektion bei Mäusen und Ratten 6,7 eingesetzt. Dies kann durch direkte intraokulare Lieferung von paramagnetischen Ionen (z. B. Mn 2 +), um Netzhautzellen erreicht werden. Als Calcium-analog, wird Mn 2 + in RGC Somata über spannungsgesteuerte Calcium-Kanäle eingebaut und entlang der axonalen Zytoskeletts der intakten ON und Tractus aktiv transportiert. Während es in der Hirnkerne sammeltder visuellen Vorsprung, dh die Corpus geniculatum laterale (LGN) und Colliculus superior (SC), transsynaptische Ausbreitung in den primären visuellen Kortex erscheint vernachlässigbar 8,9, obwohl es 10,11 auftreten. Unter MR-Sequenzierung, paramagnetische Mn 2 + steigert MR-Kontrast hauptsächlich durch Verkürzen T1-Spin-Gitter-Relaxationszeit 12. Solche Mn 2 + MRT (MEMRI) ist erfolgreich in verschiedenen neuro-anatomische und funktionelle Untersuchungen von Ratten, wie die Bewertung des axonalen Regeneration und Degeneration nach ON Verletzungen 13,14 angewendet, die genaue anatomische Zuordnung der retino-tectalen Vorsprung 15 sowie die Bestimmung des axonalen Transporteigenschaften nach pharmakologischen Behandlung 16. Letzte Verfeinerungen in der Dosierung, Toxizität, und die Kinetik der neuronalen Mn 2 +-Aufnahme und Transport, sowie verbesserte MRI-Protokolle seiner Anwendung auf Studien an transgenen verlängertMäuse 9 mit 3-Tesla-Scanner üblicherweise in der klinischen Praxis 17 verwendet. Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll eignet sich für Längs-in-vivo-Bildgebung der Maus retino tectalen-Projektion und veranschaulichen ihre Anwendbarkeit durch die Beurteilung Mn 2 +-abhängige Signalverstärkung unter naiv und Neurodegeneration verschiedenen Bedingungen. Unser Protokoll legt besondere Betonung auf der MR-Datenerfassung in einem moderaten 3 T Magnetfeld, die allgemein zugänglicher als engagierten Tier-Scanner. In naiven Mäusen veranschaulichen wir, wie Trakt spezifische Signalintensität erhöht werden, nach intravitrealer (ivit) Mn 2 +-Anwendung deutlich und reproduzierbar zu werden. Quantitativ, Mn 2 + Ausbreitung entlang der visuelle Projektion erfolgt unabhängig von den normalen Alterungsprozess (zwischen 3 und 26 Monate alten Mäusen gemessen) und Vergrößerung ist refraktär visuelle Stimulation und die Anpassung an Dunkelheit. Im Gegensatz dazu, Mn <sbis&gt; 2 +-Anreicherung in Mittelhirn und Thalamus-Zentren wird nach akuter ON Quetschverletzung 18 sowie in NFKB1 Knock-out-Mäusen (p50 KO) leiden spontane RGC apoptotischen Tod und ON-Degeneration 19 verringert. So wird in Erweiterung zu herkömmlichen histologischen Analyse Längs MEMRI Analyse der einzelnen Tiere ermöglicht Profilierung der einzigartigen Kinetik von neurodegenerativen Prozessen. Dies sollte nützlich für Studien zur Neuroprotektion und axonalen Regeneration mit pharmakologische oder genetische Eingriffe verbunden beweisen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Manganese (II) chloride solution 1M</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M1787</td>
			<td style="width:184px;">MEMRI contrast reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conjuncain</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7617666</td>
			<td>0.4% oxybuprocaine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Floxal eye drops</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3820927</td>
			<td>3 mg/ml ofloxacin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ointment panthenol</td>
			<td>Jenapharm, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3524531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloral hydrate&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">C8383</td>
			<td>420-450 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis, Munich, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7253744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">7634-01</td>
			<td>SYR 5 &#181;l, 75 RN, no NDL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">34 G&#160; needle (34/35/pst4/tapN)</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">207434/00</td>
			<td>removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Stemi-2000</td>
			<td style="width:269px;">Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3T MRI scanner Magnetom TIM Trio</td>
			<td colspan="2">Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat head coil</td>
			<td>Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse holder</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red light lamp</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Frozen section medium NEG-50</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:119px;">6502</td>
			<td>tissue embedding for cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106346</td>
			<td rowspan="2" style="width:184px;">for sulfide perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sodium sulfide nonahydrate (Na2S &#215; 9 H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">208043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gum arabic</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">4159</td>
			<td rowspan="5">for TIMM staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hydroquinone (C6H6O2)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">3586</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Citric acid (C6H8O7)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">6490</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O)</td>
			<td style="width:269px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106448</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Silver nitrate (AgNO3)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">7908</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of optic nerve fiber integrity by contrast-enhanced mri in mice

Das Nagetier visuelle System umfasst retinalen Ganglienzellen und ihre Axone, die den Sehnerv bilden Thalamus und im Mittelhirn Zentren und postsynaptischen Vorsprünge auf den visuellen Kortex ein. Auf der Grundlage seiner ausgeprägten anatomischen Struktur und bequeme Erreichbarkeit, hat es sich die bevorzugte Struktur für Studien über die neuronale Überleben, axonalen Regeneration und synaptische Plastizität. Jüngste Fortschritte in der MR-Bildgebung haben die in vivo Visualisierung des retino-tectalen Teil dieser Projektion mit Mangan-vermittelten Kontrastverbesserung (MEMRI) aktiviert. Hier präsentieren wir eine MEMRI-Protokoll für die Darstellung der visuellen Projektion in Mäusen, durch die Beschlüsse der (200 um) 3 lassen sich mit üblichen 3-Tesla-Scanner erreicht werden. Wir zeigen, wie intravitreale Injektion einer einzelnen Dosis von 15 nmol MnCl 2 führt zu einer Verbesserung der gesättigten intakt Vorsprung innerhalb von 24 Stunden. Mit Ausnahme der Netzhaut, Änderungen in der Signalstärke sind unabdent von übereinstimm visuelle Stimulation oder physiologische Alterung. Haben wir weiter diese Technik anzuwenden längs überwachen axonalen Degeneration in Reaktion auf akute Verletzung des Sehnervs ein Paradigmen durch die Mn 2 +-Transport vollständig Verhaftungen an der Verletzungsstelle. Umgekehrt ist aktiv Mn 2 +-Transport quantitativ angemessenen Verhältnis zur Rentabilität, Anzahl und elektrische Aktivität der Axon-Fasern. Für eine solche Analyse, veranschaulichen wir Mn 2 +-Transport Kinetik entlang der visuellen Pfad in einem transgenen Mausmodell (NF-kappaB p50 KO) Anzeige spontane Atrophie der sensorischen, visuelle, Projektionen. Bei diesen Mäusen zeigt MEMRI reduziert, sondern Mn 2 +-Transport im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nicht verzögert und zeugen somit Anzeichen für strukturelle und / oder funktionelle Beeinträchtigungen durch NF-kB-Mutationen. Zusammenfassend MEMRI bequem überbrückt in vivo-Tests und Post-mortem-Histologie für die characterizatiauf der Nervenfaserintegrität und Aktivität. Es ist sehr nützlich für Längsschnittstudien zur axonalen Degeneration und Regeneration, und Untersuchungen von mutierten Mäusen für echte oder induzierbare Phänotypen.

Die Fähigkeit dieser Abbildungstechnik, genau zu beurteilen, die Vitalität und Funktionalität des Bildprojektions beruht auf präzise Anwendung eines nicht-toxischen Dosierungs Mn 2 + in den Glaskörper und seine Aufnahme durch RGCs. Diese wichtige Voraussetzung wird in Fig. 1, wobei die Schicht bestimmte Mn 2 +-Aufnahme durch Autometallographie (TIMM Färbung) 21 gezeigt, getestet. Netzhautschnitte wurden bei 24 h nach ivit Anwendung von entweder 15 oder 150...

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In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit einem klinischen 3 T Scanner, für kontrastverstärkte MR-Bildgebung des naiven Maus visuelle Projektion und für sich wiederholende und Längs in-vivo-Studien der Sehnerv-Degeneration mit akuter Sehnerven Quetschverletzung und chronische Degeneration des Sehnervs an assoziierten Knock-out-Mäusen (p50 KO).

In-vivo-Imaging von Optic Nerve Fiber Integrität von Contrast-Enhanced MRI in Mäuse

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

in-vivo-imaging-optic-nerve-fiber-integrity-contrast-enhanced-mri

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

13.3K Aufrufe.  Jena University Hospital.  Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit einem klinischen 3 T Scanner, für kontrastverstärkte MR-Bildgebung des naiven Maus visuelle Projektion und für sich wiederholende und Längs in-vivo-Studien der Sehnerv-Degeneration mit akuter Sehnerven Quetschverletzung und chronische Degeneration des Sehnervs an assoziierten Knock-out-Mäusen (p50 KO). 

Serie: In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.