AK는 벨 룩스 재단에서 지원하는 오펜하임 재단과 RH에 의해 지원됩니다. 우리는 조직 학적 지원을위한 기술 및 K. Buder에 I. Krumbein 감사합니다, TIMM 염색에 대한 기술 자문 J. 골드 슈미트 (신경 생물학, 마그데 부르크, 독일 라이프니츠 연구소).

모든 동물의 개입은 실험 동물의 동물 관리 및 사용에 대한 유럽 협약 및 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 수행된다. 모든 실험은 지역 윤리위원회에 의해 승인됩니다. 마우스에서 ON 부상의 절차는 다른 곳에서 구 설명한다. 1. 유리체 강내 주입 망간 <ol><li> 이전의 MR은 조수의 도움으로 스캔에 미네소타 2 + 주입 24 시간을 수행합니다. (멸균 PBS에서 420-450 ㎎ / kg 체중) 5 % 클로 랄 하이드레이트 용액을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 추가로 국소 마취를 위하여 눈 구멍에 각막에 액체 conjuncain 한 방울 (0.4 % oxybuprocaine 염산염)를 적용한다. 15 nmol의 망간을 주입하는 2 + 아이 당 예를 들면, 132 LH 2 &lt;1 M MnCl 2 원액 1 ℓ를 희석하여, 7.5 mM의 MnCl 2 용액을 제조/ 서브&gt; O. 34 G 작은 허브 이동식 바늘 (RN 바늘)에 연결된 5 μL 해밀턴 주사기에 최종 솔루션의로드 5 μL. </li><li> 오른쪽 눈으로 시작할 때, 쌍안 현미경으로 부드럽게 열려 양면 마우스를 놓고 왼쪽 손의 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 오른쪽 눈을 고정합니다. 오른손으로 주사기를 들고 끝 가까이에 바늘을 잡아. 눈 전구의 atraumatic 천자를 들어,주의하여 공막 혈관을 살려주는 각막 윤부에 약 1mm 원심 infero - 시간 주위에서 유리체에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 해밀턴 주사기의 규모를 제어하면서 다음, 보조 천천히 2 μL의 총 부피를 적용합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 현미경 최적의 바늘 위치를 모니터링하고 액체의 렌즈 또는 유출의 구멍을 피하십시오. 정적으로 추가로 30 초 동안 삽입 된 바늘을 유지하고 액체를 최소화하기 위해 천천히 철회주사 부위에서 누출. </li><li> 절차를 통해, 특별한주의가 눈에 압력을 피하기 위해주의해야한다. 마찬가지로, 눈 전구를 천공 거칠거나 많은 시도를하지 마십시오. 미네소타가 2 + 망막 신경절 및 ON 따라 전송에 통풍 관이 이미 15 nmol의 MnCl 2 포화되어 있기 때문에,이 약간 부정확 사출 볼륨에 의해 신호의 변화를 최소화 할 수 있습니다. 카메라 돌기의 양측 신호 향상을 위해, 왼쪽 눈을위한 주입 절차를 반복한다. </li><li> 적용 플록 사신 함유 (3 ㎎ / ㎖) 안약과 절차는 안구 감염과 눈의 건조를 방지하기 위해 한 후 판테놀 함유 연고. MR 스캔의 시작 때까지 일반 주택 조건에서 자신의 새장에 마우스를 반환합니다. </li></ol> MRI 2. 동물 준비 <ol><li> 2 % / 98 % 이소 플루 란 / 산소 가스 혼합물을 투여하여 마우스를 마취. 거의 수평, 꼬임 위치에 마우스 홀더에 마우스를 장착합니다. 기능다음 MR 스캐너 내부 조정 MR 코일에 ERT 그것. 해당 시스템에 의해 호흡과 심장 박동을 모니터링합니다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 외 (20)를 참조하십시오. </li><li> 동안 MRI, 통합 관에 의해 마우스 헤드 홀더에 연결된 증발기를 통해 초기에 1.5 % / 98.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합 가스의 취입에 의한 연속적인 공급 마취. 스캔하는 동안 기록 된 중요한 매개 변수 (예 : 분당 40 호흡의 안정된 호흡의 비율을 목표)에 따라 마취의 깊이를 조정합니다. 가열 장치를 사용하여 마우스의 복강 사이트에 위치하는 온도 센서에 의해 측정 한, 35 및 37 ° C 사이의 안정적인 신체 표면 온도를 유지한다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 외 17을 참조하십시오. </li><li> 스캔 후, 홀더에서 마우스를 해방하고 마취에서 회복을 가속화하기 위해 순수한 산소를 공급한다. 또한 사용하여 안정된 체온을 유지붉은 빛이 가열 원. </li></ol> 3. MRI 프로토콜 <ol><li> 프로토콜은 35mm × 38 mm 직경의 뷰의 효과적인 필드 전용, SNR 효율, 작은 동물 코일 (선형 편광 리츠 코일)를 장착 한 3 테슬라 스캐너에 대해 유효성이 검사됩니다. 송수신 모드에서 코일을 사용하십시오. </li><li> 최종 위치에있는 동물로, 주파수 분석기의 도움으로 코일의 튜닝 및 매치를 조정한다. 수동 이미지 균질성과 품질을 최적화하는 송신기 기준 전압과 전류를 조정 심. </li><li> T에게 계획에 대한 시상 및 횡단 뷰에서 0.5 mm × 2mm × 0.5 mm의 해상도를 가진 1 차원 가중 TSE 이미지를 획득. 계획 MR 스캔을 사용하여 코로나 둘레 방향 MEMR 화상을 취득, 좌우 방향의 위상 인코딩을 가진 동물의 머리 평행하게 회전된다. 획득 시간을 최소화하기 위해 조정 보이는 직사각형 필드를 사용실제 머리 크기. 위상 인코딩 방향으로 뷰의 93.8 % 직사각형 필드를 사용하여, 기본 매트릭스 256, 시야 14.08 mm × 50.65 mm × 54mm, 0.11-mm의 128 조각 : 다음 매개 변수를 사용하여 버릇 3D 플래시 시퀀스 (VIBE 3D)를 사용 슬라이스 해상도 슬라이스 두께는 61 %로 설정합니다. </li><li> 0.18 mm × 0.21 mm × 0.21 mm의 유효 해상도 (0.1 mm × 0.1 mm × 0.09 mm 보간), 에코 시간 (T) E = 6.51 밀리를 제공하고, 512 × 480 × 128으로 최종 이미지를 만들 수있는 평면 보간을 활성화, 반복 시간 T의 R = 16 밀리 초, 대역폭 = 160 Hz에서 / PX, 플립 각도 = 22 °. 약 30 분의 총 획득 시간 (T)를 달성하기 위해 두 개의 평균과 세 개의 반복을 적용합니다. </li></ol> 4. MRI 데이터 분석 <ol><li> 소프트웨어 syngo의 fastView를 사용하여 데이터를 분석한다. 정량적 인 신호 향상을 위해, O를 정의 영역을 선택F 2 차원 평면 MRI 레코딩에 대한 관심과 개선 된 구조 (SI MEMRI), 조직 배경 (SI의 배경,), 소음 (SD의 N)의 표준 편차의 신호 강도 (SI)를 결정합니다. 필요한 경우, LGN 및 SC 구조에 대한 신경 해부학 적 방향을 용이하게하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 사용합니다. : 수식을 이용한 콘트라스트 - 대 - 잡음비 (CNR)를 계산 </li><li> CNR = (SI MEMRI - SI의 배경,) / SD N </li><li> 각 샘플에 대한 평균 CNR 계산을위한 세 개의 연속 이미지를 정량화. 양측 주입 동물에서, 각각 독립적으로 반구를 분석합니다. </li><li> 수평 관상 및 시상 이미지의 묘사를 들어, 원래 3D MRI 데이터 세트에서 다 평면 재구성을 계산합니다. 이러한 처리 된 이미지는 정량 분석​​을하지 않는 것이 좋습니다. 레티노의 애니메이션 3D 재구성 (최대 강도 예측, MIPS의)를 만들려면- tectal 투사, 혈관 조영술 후 처리 소프트웨어 모듈을 사용합니다. </li></ol> 5. 미네소타 2 + Autometallography (TIMM 염색) <ol><li> MEMRI 다음 미네소타 2 + 추적 뇌 구조의 TIMM 염색의 경우, 15-150 nmol의 망간 2 + ivit 24 시간 이전의 영상에의 투여 량을 주입. </li><li> MR 스캔 한 후, PBS의 30 ML 얼음처럼 차가운 0.325 % 나 2 S (산도 7.4)와 함께 동물을 perfuse. 냉동 섹션에서 망막 동결 샘플을 해부하다. </li><li> cryotome 15 μm의 두께의 연속, 적도 부분을 잘라. </li><li> Angenstein 등 22에 따라 정착 및 cryoprotection의 부재에 TIMM 염색 (21)를 수행합니다. </li></ol> 6. 통계 분석 사후 ANOVA 다음에 하나의 비교에 대한 학생의 T-테스트를​​ 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 개별 N 번호는각 실험에 대해 별도로 없습니다. (***, P ≤ 0.001, **, P ≤ 0.01 *, P ≤ 0.05) 0.05 ≤ P에 도달 한 결과는 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다.

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

시각 시스템의 MEMRI은 순진하고 병적 인 조건에서 기능을 평가하기위한 기존의 신경 생물학적 기술을 확장합니다. 떨어져 고립 CNS 섬유 기관의 무결성에 독특한 통찰력을 제공에서, MEMRI 쉽게 시각적 인식에 대한 특정 패러다임의 즉각적인 결과를 조사하기 위해, 행동 예를 들어, 테스트, 검안 및 시각 기반의 물 작업으로 보충 할 수있다. 또한 전기 생리학과 생체 내에서 기능 시각적...

유리한 신경 해부학 적 구조를 기반으로 설치류의 시각 시스템은 신경 보호 1 프로 재생 효과 2,3를 중재하는 약물 화합물 및 이들의 능력을 평가하는 독특한 가능성을 제공합니다. 또한, 최근에 연접 비계 단백질 바순 4 부족한 생쥐에 예시 된 바와 같이, 마우스 돌연변이의 기능과 신경 해부학 적 특성에 대한 연구를 할 수 있습니다. 또한, 보조 도구의 광범위한 스펙트럼은 전위도 및 행동 테스트 및 고유 신호의 광학 영상에 의한 대뇌 피질의 재 배열의 결정에 의해, 예를 들어 망막 신경절 세포 (RGC) 및 RGC 축삭 번호뿐만 아니라 RGC 활동의 특색 추가로 제공한다. 레이저 현미경의 최신 기술 개발은 시신경 (ON)과 뇌의 전체 마운트 표본 깊은 조직의 형광 이미징에 의해 RGC 재생의 현장 시각화를 가능하게한다. 이 histolog에서iCal의 접근 방식, 빛 시트 형광 현미경과 함께 테트라 히드로 푸란을 기반으로 조직의 청산은 deafferented ON 및 광학 기관 (5)에 다시 입력 한 섬유의 해상도를 허용합니다. 이러한 기술은 해상도와 성장 패턴의 결정이 뛰어나 수도 있지만, 그들은 특히 장기 재생의 과정을 평가하기 위해 원하는 개별 성장 이벤트의 반복 및 종 분석을 사용하지 마십시오. 조영 증강 MRI는 생쥐와 쥐 6,7의 레티노-tectal 투사의 최소 침습 시각화를 위해 사용되어왔다. 이는 망막 세포에 상자성 이온 (예를 들어, Mn이 2 +)의 직접 안내 전달함으로써 달성 될 수있다. 칼슘 아날로그로, 미네소타 2 +는 전압 게이트 칼슘 채널을 통해 RGC의 인 somata에 통합하고 적극적으로 그대로 ON 및 광학 기관의 축삭 세포 골격을 따라 운반. 이는 뇌의 핵에 축적하면서그것은 10, 11을 발생할 수 있지만 시각적 투영, 옆 무릎 모양 관절이 핵 (LGN)와 우수한 둔덕 (SC)를 즉, 일차 시각 피질에 transsynaptic 전파, 8,9 무시할 나타납니다. MR의 순서에 따라, 성체 미네소타 2 +는 주로 T 1 스핀 - 격자 완화 시간 (12)을 단축하여 MR의 명암을 보완. 이러한 망간 2 + MRI (MEMRI)가 성공적으로 부상 13, 14 후 축삭 재생과 퇴보의 평가를 포함하여 쥐의 다양한 신경 해부학 적 및 기능적 연구에 적용된 강화, 레티노-tectal 돌기 (15)의 정확한 해부학 적 매핑 뿐만 아니라, 약물 치료 16 일 후 축삭 전송 특성의 결정 등. 미네소타 2 + 통풍 관 및 교통의 연결뿐만 아니라, 향상된 MRI 프로토콜의 투여 량, 독성 및 역학의 최근 분류는 유전자 변형에 대한 연구에의 응용 프로그램을 확장 한일반적으로 임상 실습 17에 사용 된 3 테슬라 스캐너를 사용하여 마우스 9. 여기, 우리는 마우스 레티노-tectal 투사의 생체 내 이미징에 세로에 적합한 MEMRI 프로토콜을 제시하고 순진 다양한 신경 변성 조건에서 망간 2 + 종속 신호 향상을 평가하여 그 적용 가능성을 예시. 우리의 프로토콜은 일반적으로 전용 동물 스캐너보다 더 액세스 할 수있는 적당한 3 T 자기장에서 MR 데이터 수집에 특정 중점을두고 있습니다. 순진 마우스, 우리는 기관 고유의 신호 강도가 실질적으로 재현성 강내 (ivit) 미네소타 2 + 신청 후 증가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 정량적으로, 시각적 투사 따라 미네소타 2 + 전파 (3, 26 개월 된 생쥐 사이에서 측정) 정상적인 노화 과정과 독립적으로 발생 증가는 어둠에 시각적 인 자극과 적응에 내화물입니다. 반대로, Mn이 <s시상과 중뇌 센터의 최대&gt; 2 + 농축은 호감 부상 18 급성뿐만 아니라 nfkb1 녹아웃 마우스에서 자연 사멸 RGC의 죽음과 변성 19 고통 (P50 KO) 다음 감소한다. 따라서, 기존의 조직 학적 분석에 확장에, 각각의 동물의 종 MEMRI 분석은 신경 퇴행성 과정의 독특한 역학의 프로파일 링을 사용합니다. 이 약물 또는 유전자 개입과 관련된 신경 보호 및 축삭 재생에 대한 연구에 유용합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Manganese (II) chloride solution 1M</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M1787</td>
			<td style="width:184px;">MEMRI contrast reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conjuncain</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7617666</td>
			<td>0.4% oxybuprocaine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Floxal eye drops</td>
			<td>Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3820927</td>
			<td>3 mg/ml ofloxacin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ointment panthenol</td>
			<td>Jenapharm, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 3524531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloral hydrate&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">C8383</td>
			<td>420-450 mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis, Munich, Germany</td>
			<td style="width:119px;">PZN 7253744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">7634-01</td>
			<td>SYR 5 &#181;l, 75 RN, no NDL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">34 G&#160; needle (34/35/pst4/tapN)</td>
			<td style="width:269px;">Hamilton Company, Reno, NV, USA</td>
			<td style="width:119px;">207434/00</td>
			<td>removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular Stemi-2000</td>
			<td style="width:269px;">Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3T MRI scanner Magnetom TIM Trio</td>
			<td colspan="2">Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat head coil</td>
			<td>Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse holder</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Red light lamp</td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Frozen section medium NEG-50</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td style="width:119px;">6502</td>
			<td>tissue embedding for cryo-sections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106346</td>
			<td rowspan="2" style="width:184px;">for sulfide perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Sodium sulfide nonahydrate (Na2S &#215; 9 H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">208043</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">gum arabic</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">4159</td>
			<td rowspan="5">for TIMM staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hydroquinone (C6H6O2)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">3586</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Citric acid (C6H8O7)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">6490</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O)</td>
			<td style="width:269px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">106448</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Silver nitrate (AgNO3)</td>
			<td style="width:269px;">Roth, Arlesheim, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">7908</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of optic nerve fiber integrity by contrast-enhanced mri in mice

설치류의 시각 시스템은 시각 피질에 시상과 중뇌 센터, 시냅스 돌기를 입력 시신경을 형성하는 망막 신경절 세포와 축색 돌기를 포함한다. 그것의 독특한 해부학 적 구조와 편리한 접근성을 바탕으로, 그것은 생존의 연결, 축삭 재생 및 시냅스 가소성에 대한 연구에 대한 선호 구조로되어있다. MR 영상에서의 최근 발전은 망간 매개 대비 향상 (MEMRI)를 사용하여이 돌기의 레티노-tectal 부분의 생체 내 시각화를 사용할 수있다. 여기, 우리는 (200 ㎛)의 3 해상도는 일반적인 3 테슬라 스캐너를 사용하여 달성 할 수있는 생쥐의 시각 투영의 그림 MEMRI 프로토콜을 제시한다. 우리는 15 nmol의 MnCl 2의 단일 투여 량의 유리체 강내 주입은 24 시간 안에 그대로 투영 포화 향상에 이르게하는 방법을 보여줍니다. 망막의 제외, 신호 강도의 변화는 각각 C1됩니다일치 시각적 인 자극 또는 생리적 노화의 함몰. 우리는 더 심각한 시신경 손상에 대한 응답으로 축삭 변성을 모니터링 종에이 기술을 적용, 패러다임 병변 사이트에있는 망간 2 + 교통 완전히 체포하여. 반대로, 활성 망간 2 + 수송 가능성, 수, 축삭 섬유의 전기적 활동을 정량적으로 비례한다. 이러한 분석을 위해, 우리는 시각, 전망 등의 감각의 자연 위축을 표시하는 형질 전환 마우스 모델 (NF-κB의 P50 KO)의 시각 경로를 따라 미네소타 2 + 전송 반응 속도를 예시. 이 마우스에서 MEMRI이 감소하지만, 따라서 NF-κB의 돌연변이에 의해 구조 및 / 또는 기능 장애의 징후를 드러내는, 야생형 마우스에 비해 망간 2 + 전송을 지연 나타냅니다. 요약하면, MEMRI 편리 생체 분석에 다리와 characterizati 대한 해부 조직학을 게시신경 섬유의 무결성과 활동에. 그것은 축삭 변성과 재생, 및 정품 또는 유도 표현형에 대한 돌연변이 생쥐의 조사에 종 연구에 매우 유용합니다.

정확하게 시각적 투사의 활력과 기능을 평가하기 위해이 영상 기술의 능력은 유리체와 망막 신경절로의 흡수에 독성 미네소타 2 + 복용량의 정확한 응용 프로그램에 의존한다. 이 주요 가정은 계층 별 미네소타 2 + 흡수가 autometallography (TIMM 염색) (21)에 의해 설명된다 그림 1에서 테스트합니다. 망막 섹션은 컨트롤과 같은 15 nmol의 150 nmol의 하나 미네소타 2 +...

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In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

이 동영상은 순진 마우스 시각 투사의 조영 증강 자기 공명 영상과 급성 시신경 압박 손상 및 만성 시신경 변성과 관련된 시신경 변성의 반복 및 종 생체 내 연구에, 임상 3 T 스캐너를 사용하는 방법을 보여줍니다 녹아웃 마우스 (P50 KO).

마우스의 조영 증강 MRI에 의한 시신경 섬유 무결성의 생체 내 이미징

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

13.3K 조회수.  Jena University Hospital.  이 동영상은 순진 마우스 시각 투사의 조영 증강 자기 공명 영상과 급성 시신경 압박 손상 및 만성 시신경 변성과 관련된 시신경 변성의 반복 및 종 생체 내 연구에, 임상 3 T 스캐너를 사용하는 방법을 보여줍니다 녹아웃 마우스 (P50 KO). 

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.