Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.

1. Die Projektierung des Zielproteins <ol><li> Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht. Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten. </li><li> Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak Etch Virus (TEV) Protease geschnitten Website zur Entfernung von His-Tag (ENLYFQG), Biotin-Tag-Sequenz für die Biotinylierung von Protein bei K (GLNDIFEAQKIEWHE) und flexiblen Gelenk mit Lücken, die Raum für die richtige Proteinrückfaltung (EFPKPSTPPGSSGGAP) ermöglichen. Anmerkung: Diese Sequenzen können je nach der gewünschten Fusions prot variierenEin. </li><li> Senden vollständige Aminosäuresequenz an ein Unternehmen für die Gen-Design / Optimierung für gewünschte Wirtsarten und Synthese. Subklonieren in einen Vektor der Wahl mit der BamHI-NotI-Stelle mit einem Kit oder durch Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen. </li></ol> 2. Machen Agar-Platten Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass alle Aktien von Antibiotika, Platten, Puffer, etc. ordnungsgemäß gelagert (Temperatur und Dauer) und bleiben frei von Proteasen (sterilisiert). <ol><li> Abwiegen Agar bei 1,5 Gew.% und Lysogenie Brühe (LB) bei 20 g / L und in eine Glasflasche Medien. Ein 500-ml-Flasche macht etwa 15 Platten. </li><li> Volumetrisch hinzufügen Reinstwasser, gut mischen und Autoklaven. </li><li> Lassen Flasche kühl an und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika. Vermeiden vorzeitigen Erstarrung der Agar, aber wenn Flasche kühlt zu viel und Lösung beginnt zu erstarren, Aufwärmen in der Mikrowelle. Hinweis: Unsere Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-GenE. Daher müssen alle Schritte Ampicillin bei 100 ug / ml enthalten. Die E. coli K12-Stamm erfordert Klonierung Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotikum. BL21-Bakterien-Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotikum. </li><li> Gießen 25-30 ml Lösung in 90 mm Petrischalen und genügend Zeit, um zu trocknen. </li><li> Label-Gericht mit geeigneten Antibiotika und speichern upside-down in 4 ° C, mit Parafilm oder in einem wiederverschließbaren Beutel. Hinweis: Die Platten sind gut für etwa einen Monat. </li></ol> 3. Klonierung des Biotin Tagged Plasmid Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Spin down Plasmid-Vektor bei 6.000 xg für 3 min, um zu pelletieren, und fügen Sie 10 ul sterilisiert Reinstwasser. </li><li> Entfernen Sie 50 ul chemisch kompetente E. coli-Zellen hohe Transformationseffizienz von -80 ° C und sofort auf Eis für 5-10 min. </li><li> 1 ul der Vektor-Lösung bei 0,5-1 ng/5056, L-Zellen an die 50 &amp;mgr; l E. coli-Zellen, und legen Sie die restlichen Plasmid in -80 ° C </li><li> Platzieren der Bakterien-Zellen, die den Vektor auf Eis für 5 min. </li><li> Hitzeschock die Zelle und Vektor Mischung für 30-45 sec in 42 ° C Wasserbad und Ortszellen wieder auf Eis für 2 min. </li><li> Add 250 ul Superbrühe mit optimalen Repression (SOC)-Medium (2% w / v-Bacto-Trypton, 0,5% w / v Bacto-Hefeextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM Glucose , hochreinem Wasser, pH = 7,0) hinzugefügt und bei 250 Upm bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: SOC nicht autoklavierbar, sondern Filter durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert werden. </li><li> Trockenplatten 10-15 min vor dem Beschichten Zellen. </li><li> Pipette 25, 50 und 100 &amp;mgr; l der Zelllösung auf separate Agarplatten, die Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika. Verwenden Sie Glasperlen Lösung gleichmäßig auf Agar-Platten zu verteilen. </li> &lt;li&gt; Platten bei 37 ° C inkubieren upside-down für 15-18 Std. </li><li> Check für kleine Einzelbakterienkolonien auf den Platten bei 4 ° C lagern Oberseite nach unten bis zur weiteren Verwendung (Fig. 2A). <ol><li> Wenn keine Kolonien vorhanden sind: <ol><li> Überprüfen Sie die Frische und Sterilität von Puffern und Zubehör. </li><li> Erhöhen Sie die Menge von Plasmid E. hinzugefügt coli K12-Stamm. </li></ol></li><li> Wenn große Kolonien vorhanden sind oder ein übermäßiges Wachstum der Kolonien (Abbildung 2B und 2C), restreak ein neues Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Platten Zellen bei niedriger Lautstärke. </li></ol></li><li> Beimpfen von 5 ml LB, enthaltend Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie transformierter E. coli-Zellen. Aufwachsen Zellen über Nacht bei 37 ° C bei 250-300 UpM. </li><li> Der folgende Tag, verwenden Sie ein Plasmid Isolation Kit, um die Zielvektor aus der Nacht gro isolierenw-und Speicher gereinigt Plasmid bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. <ol><li> Optional: Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmid mit Absorptionswert bei 260 und 280 nm erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Transformation von Plasmid in Expression-Host Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für E. coli BL21-Zellen mit den folgenden Änderungen: Hinweis: BL21 Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotika Ampicillin daher nur auf den Agarplatten zur Transformation aufgenommen. <ol><li> In 2-5 ul isolierte Plasmid bei 0,5-2 ng/50 ul Zellen aus Schritt 3,12-50 ul E. coli-Expressionswirtszellen. </li><li> Hitzeschock-Zellen, die für 60 bis 90 Sekunden. </li><li> Schütteln Lösung mit SOC-Medium bei 250 rpm für 60 min statt 30 min. </li></ol></li><li> Zupfen Sie eine Einzelkolonie von transformierten Bakterienzellen aus der Petrischale mit einem sterile Applikatorstäbchen und in ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Ampicillin (100 ug / ml). </li><li> Platzieren Reagenzgläser in Schüttler über Nacht bei 37 ° C bei 250 UpM. </li><li> Am folgenden Morgen, nehmen Sie 200 ul der Nacht wachsen-up und auf 5 ml LB mit Ampicillin bei 100 ug / ml hinzuzufügen. </li><li> Frieren Sie unten die restlichen Zellen mit 250 ul 50% Glycerin (steril) auf 750 ul Kultur und halten in -80 ° C Hinweis: Neue Testausdruck und Scale-up-Verfahren kann mit einem sterilen Applikator-Stick, ein Kratzen der gefrorenen Zellen zu erhalten und Impfen LB mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden. </li><li> Platzieren Reagenzglas in Schüttler bei 250-300 Upm bei 37 ° C, bis die optische Dichte (OD) zwischen 0,7-0,8 bei einer Absorption von 600 nm gemessen. </li><li> Induzieren Zellen mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM. </li><li> Schütteln für weitere 4 h bei 37 ° C bei 300 UpM. Alternativ können auch Zellenüber Nacht bei 18 ° C bei 250-300 rpm geschüttelt werden. Dies kann eine höhere Ausbeute an Plasmid zu erzeugen in Abhängigkeit von dem Zielprotein. </li><li> Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse der Testausdruck <ol><li> Nehmen Sie 500 ul der Kultur und der Platz in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min. Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;löslich&quot;. Pellet unter Vortexen in 200 &amp;mgr; l Beladungsfarbstoff (50 ul 2-Mercaptoethanol, 950 &amp;mgr; l Laemmli-Probenpuffer). Hinweis: Löslich Bakterienpellets wird verwendet, um zu bestimmen, ob das rekombinante Protein in den cytoplasmatischen Regionen der Bakterienzellen. Pellets können in -80 ° C ohne Belastung Farbstoff, bis sie benötigt gespeichert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als lösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie 1000 ul der Kultur und in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min.Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;unlöslich&quot;. Hinweis: unlöslich Pellets Denaturierung Verfahren unten, um Proteine ​​in Einschlusskörpern von Bakterien Zellen gefunden loslassen zu unterziehen. Pellets können in -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als unlösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. <ol><li> Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet in 200 ul BugBuster und bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Spin down Probe erneut bei 13-15 g für 5 min und nehmen 50 ul Überstand und es um neue &quot;unlöslich&quot; 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. </li><li> Dann fügen Sie 50 ul Ladefarbstoff auf diese neue Probe. </li></ol></li><li> Sieden löslichen und unlöslichen Proben für 5 min, um Proteine ​​für die SDS-PAGE-Analyse zu denaturieren. </li><li> Legen Sie jede Probe in Elektrophorese-Gel mit Standard-Leiter. </li><li> Um zu visualisieren, die Proteinproben mit einem staining Reagenz und folgen Sie der Firma Protokoll. </li><li> Bestimmen, ob das Protein exprimiert, in den löslichen und / oder unlöslichen Fraktionen durch Vergleich dieser zwei Bahnen sowie den Vergleich der Spuren mit den löslichen und unlöslichen Kontrollspuren (siehe Anmerkung 4.9.1 und 4.9.2) auf den SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). Ein dunkles Band sollte um das Molekulargewicht des Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fahrspuren angezeigt. Damit wird festgelegt, welche Isolierungsverfahren in Protokoll Nr. 6 zu verwenden. Anmerkung: Wenn ein Band in diesen beiden Regionen entweder als Isolation in 6 verwendeten Protokoll unten durchgeführt werden, oder das Protein kann in beide Richtungen getrennt werden, um zu bestimmen, welche Isolierungsverfahren erzeugt eine höhere Ausbeute an rekombinantem Protein (Fig. 3) . </li><li> Wenn ein 4 h und Induktion über Nacht durchgeführt wurde, festzustellen, welche Induktionsmethode die höchste Proteinproduktion für das Scale-up-Prozess (Abbildung 2). </li></ol></li></ol&gt; 5. Scale-up Verfahren und Hauptkultur <ol><li> Bereiten Wachstumsmedien mit 85,7 g Terrific Broth und 28,8 ml 50% Glycerin in 1,8 l Reinstwasser und Autoklaven auf Flüssigkeitskreislauf für 1 Stunde. </li><li> Starten Sie eine Übernachtkultur von gefrorenen Zell Lager in Schritt 4.5 erstellt. Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Mischungs 20 ml LB mit einer Endkonzentration von Ampicillin bei 100 ug / ml in einer sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben. </li><li> Mit einem sterilen Applikator-Stick einen Verschrottung von transformierten E. coli-Zellen und Drop-Applikator in den Kolben. Entfernen Applikator-Stick und Stecker Kolben mit Schaumstoffstopper oder Baumwolle und mit Alufolie abdecken, um die Sterilität zu erhalten. </li><li> Schütteln über Nacht bei 250 UpM bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Hauptkultur Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Gießen-Nacht-Kultur in 1,8 L von sterilen Nährmedien und fügen Ampicillin bei 100 &amp;mgr; g / ml und 6 bis 8 Tropfen sterilen Antischaum 204 unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> Platz Kulturen in einem 37 ° C Wasserbad mit 0,2 mm durch Belüftung Steine ​​gefilterte Druckluft Blasenbildung in Kulturen. </li><li> Sobald der OD 600 nm von 0,7-0,8 erreicht, induziert mit IPTG (1 mM) und damit zur Induktion entweder 4 h bei 37 ° C oder über Nacht in Abhängigkeit von löslichen / unlöslichen Ergebnisse von SDS-PAGE in Schritt 4.9 auftreten, auf 18 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln E. coli-Zellen <ol><li> Spin-Down der Zellkultur in 1 l-Zentrifugenflaschen (2 Flaschen / Kultur) für 15 min bei 14.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand abgießen und mit einem dünnen Spachtel, schöpfen die Bakterien zu pelletieren in zwei 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletiert werden. Hinweis: Jeder 1,8-l-Kultur in zwei Bakterienpellets, eine in jeder 50-ml-Zentrifugenrohr führen. </li><li> Shop-Pellets in -80 C bis Proteinisolierung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 6. Isolierung und Reinigung von rekombinantem Protein Hinweis: Wenn das Protein in der löslichen Region auf Basis von SDS-PAGE-Analyse von Schritt 4,9, dann wird &quot;native Isolation&quot; verwendet werden, aber für die unlöslichen Proteinen &quot;Nonnative Isolation&quot;-Verfahren durchgeführt. <ol><li> Zelllyse <ol><li> Nonnative <ol><li> Transformierten E. entfernen coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank und 20 ml Lyse / Waschpuffer (Tabelle 1) zu jedem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex und schütteln Sie die gefrorenen Pellets, bis es taut und löst in der Pufferlösung ohne großen Brocken. Inkubation über Nacht auf Nutator. Am folgenden Morgen sollte das Pellet jetzt eine viskose Aufschlämmung aufgrund der Denaturierung des Proteins aus dem Puffer sein. </li><li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei Raumtemperatur für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li><li&gt; Native <ol><li> Erhalten transformierten E. coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Hinzufügen Lysis Buffer (Tabelle 1) Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen und zu entfernen gefrorene Pellet durch Verwirbeln und rigoros Schütteln. Zeigen Pellet auf Eis. </li><li> Waschen Sonicator Sonde mit 70% Ethanol bei 100% Amplitude für 1-2 min. Wiederholen Sie dann mit hochreinem Wasser. </li><li> Ultraschallbad Bakterien zu pelletieren, während auf Eis für 5 min (Gesamtzeit von 10 min). <ol><li> Stellen Ultraschallgerät bei 30% Amplitude mit Puls von 30 Sekunden an/30 s aus. </li><li> Bob Zentrifugenröhrchen nach oben und unten während der Beschallung Intervall, um vollständig brechen die Zellpellet. Am Ende der Gesamtzeit sollte es keine sichtbaren Bakterien zu pelletieren Verlassen einer sehnig, zähflüssige Brei. </li><li> Reinigen Sie das Ultraschallgerät Sonde zwischen verschiedenen Proteinisolierungen sowie für die Lagerung mit 70% Ethanol und Reinstwasser, wie in Schritt 6.1.2.3 beschrieben. </li></ol></li&gt; <li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li></ol></li><li> Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie <ol><li> Nonnative <ol><li> 1-ml-Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung zu jedem Zentrifugenröhrchen (2 ml Harz für insgesamt 1,8 l-Kultur) und Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Gießen Schlamm in Affinitätssäule und lassen Lösung durch Hahn Ventil vollständig in die Abfallbecherglas tropfen. </li><li> Zuführen 10 Wäschen mit 10 ml Lyse / Waschpuffer für jeden Waschgang. <ol><li> Für die ersten zwei Wäschen, fügen Sie die 10 ml-Zentrifugenröhrchen auf die zusätzliche Harz zu entfernen und gießen Sie dann in die Spalte. Die zusätzlichen Waschungen können direkt Spalte hinzugefügt werden. </li><li> Nach jedem Wasch, rühren Sie den Harz mit einem Glasstab. Sobald der Wasch tropft in den Abfall Becher können die nächsten 10 ml zugegeben werden. </li></ol></li><li> Nach dem vollständigen dr waschendurch ips, in der Nähe Absperrventil, entfernen und ersetzen Abfallbecherglas mit 50 ml-Zentrifugenröhrchen für die Protein-Sammlung. </li><li> 15 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und rühren-up Harz, so dass Lösung für 5 min zu sitzen. Absperrhahn öffnen Ventil und sammeln Elution. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren 15 ml. </li></ol></li><li> Ureinwohner <ol><li> Folgen Sie der Nonnative Affinity Chromatography oben (Schritte 6.2.1.1-6.2.1.4) mit Ausnahme stellen Sie die folgenden Parameter: <ol><li> Inkubieren Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Verwenden Sie die geeignete Waschpuffer (Tabelle 1). </li></ol></li><li> 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und Inkubation mit Harz 5 min. <ol><li> Offene Absperrventil und sammeln Elution, bis die meisten der Lösung durchtropft. </li><li> In 90 ul / Bradford Reagenz auf 96-Well-Platte zu löschen. Nach jeder Elution ermöglichen 10 ul soLösung, um aus der Spalte in den wohl mit 90 ul Bradford-Reagenz tropfen. </li><li> Weiter Zugabe von 5 ml Elution Buffer an, bis Bradford-Test erkennt nicht mehr Protein (Farbe reicht von dunkelblau bis hellblau zu löschen). Dies dauert in der Regel 4-5 Elutionsvolumina. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Dialyse / Renaturierung <ol><li> Machen nonnative (Renaturierung) und native Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Speicher in 4 ° C Anmerkung: Der pH-Wert der Dialyse-Puffer werden durch isoelektrische Punkt des Zielproteins (pI) bestimmt. Als eine Faustregel, Proteine ​​sollten mindestens einen vollen Punkt über oder unter ihrem pI-Werte gepuffert werden. </li><li> Übertragen nativen und nicht-nativen Elutionen einen Dialyseschlauch mit entsprechenden Molekulargewichtsgrenze (25.000 MWCO für NGF und 50.000 MWCO für Sema3A). Je eine Proteinprobe in jeweiligen Dialysepuffer 1 für 4 h bei 4 ° C und dann mit dem entsprechenden Puffer 2 über ersetzenNacht bei 4 ° C Hinweis: Protein muss in jedem Puffer für mindestens 4 Stunden für die ordnungsgemäße Rückfaltung und Pufferaustausch stattfinden dialysiert werden. </li><li> Konzentrieren Sie die dialysiert Protein Elutionen auf weniger als 5 ml Zentrifugen mit Spin-Konzentratoren. Hinweis: Die Proteine ​​können durch Verwendung schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt und erneut eingeengt werden. </li></ol></li><li> Bestimmen Proteinkonzentration (mg / ml) durch Gefriertrocknen einer 10-50 ml Probe in einem vorgewogenen Zentrifugenröhrchen. <ol><li> Optional: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ε, so daß die Konzentration des Proteins in Zukunft Isolierungen durch Messung der Absorption einer Probe bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden: C = A 280nm / &amp;epsi; L, wobei L die Weglänge ist. </li></ol></li></ol> 7. Biotinylierung von gereinigtem Protein <ol><li> Dialysiere Proteine ​​in 10.000 MWCO Dialysekassetten against 10 mM Tris (pH = 8,0), die Änderung der Puffer alle 4 Stunden mit insgesamt sechs Veränderungen. </li><li> Transfer der rekombinanten Proteine ​​(jetzt in 10 mM Tris-Puffer), um 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Biotinylierung. </li><li> Biotinylieren Proteine ​​unter Verwendung einer Biotin-Protein-Ligase-Kit. </li><li> Proteine ​​dialysiert gegen PBS (pH = 7,4) mit 10.000 MWCO Dialysekassetten mit 3 Puffer ändert einen Tag für 2 Tage. </li><li> Bestimmen Sie die Prozent Biotinylierung von Proteinen mit Hilfe eines quantitativen Kit. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration wieder wie in 6.4 und bei 4 ° C oder aliquotieren und bei -20 ° C zur Langzeitlagerung beschrieben. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kulti...

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt 2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen 3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt. Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E<html> tc.) 5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig 9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden 5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen 10 Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität 11 liefert. Zelt &quot;&gt; Nach Hostauswahl müssen weitere Pflege in der Wahl des geeigneten Expressionsvektor ausgewählt und gesteuert Proteinexpression zu erleichtern aufgenommen werden. Synthese von rekombinanten Proteinen beginnt mit einem Ziel-DNA-Sequenz, die unter der Leitung des Bakteriophagen T7 Transkriptions-und Translationssignale kloniert wird, und Expression in Wirtszellen, die chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gen 12 enthält, induziert. Diese Vektoren, aus dem Plasmid pBR322 (für einen Überblick siehe Referenz 13), fest mit dem T7-Promotor zunächst von Studier und Mitarbeiter entwickelten 14 gesteuert und zusätzliche Steuerung durch die Einbeziehung der lac-Operator-lac-Repressor (LAC1) 15,16. Für die rekombinante Proteintechnik bietet das Expressionssystem die Fähigkeit, eine spezifische Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins durch Einsetzen verschiedener DNA-Zielsequenzen anzupassen oder um Fusionsproteine ​​zu erzeugen bis kombinierter Domain gemachts von einzelnen Proteinen. Darüber hinaus können einige Vektorreihe umfassen Peptid-Tag Modifikationen am N-oder C-Terminus angeordnet werden. Unser Gestaltungszwecken wurde ein Histidin (His)-Tag an die DNA-Zielsequenz zur Reinigung aufgenommen und 15 Aminosäure biotinylatable Sequenz wurde für die Biotinylierung 17,18 enthalten. In diesem Protokoll ein Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, wurde ausgewählt, um unsere biotinylatable Fusionsprotein-Sequenzen tragen. Die Expression wird in diesem Vektor durch T7-lac-Promotor kontrolliert und ist leicht mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur 19 zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven 20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden. Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein 21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) 10 (für eine Übersicht siehe Referenz 24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung 25-27. Biophysikalischen Sonden 28,29, Biosensoren 30 und Quantenpunkte 31 sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K d in der Größenordnung von 10 -15 M 27 nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden 18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen 21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hydroxyethylmercaptan &amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antifoam 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Gel filtration standard</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 vials</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli sample buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Broth&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Cloning Host</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 pack</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodium phosphate diabasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Tryptone, pancreatic</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Yeast extract, granulated</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;Auml;KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Includes kits and accessories</td></tr><tr><td>Benchtop Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td></tr><tr><td>Dialysis Casette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>Dialysis Tubing</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25,000 and 50,000</td></tr><tr><td>Flow Diversion Valve FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Tube Racks, Rack C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Includes kits and accessories</td></tr><tr><td>Heated/Refrigerated Circulator&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Model 1156D</td></tr><tr><td>Heating Oven FD Series</td><td>Binder</td><td></td><td>Model FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Series Clean Bench</td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-gel vertical electrophoresis system</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Any kDa, 15-well comb</td></tr><tr><td>Ni-NTA Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&amp;nbsp;volume ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&amp;nbsp;tubes for JA 25.50 rotor</td></tr><tr><td>Spin-X UF Concentrators</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&amp;nbsp;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td></tr><tr><td>Subcloning Service</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>Protein Services</td></tr><tr><td>Ultrasonic Processor&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Model CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Model G560</td></tr></tbody></table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

<html> Klonierung und Expression-Test Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). W...

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration at JoVE.com

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.5K Aufrufe.  University of Akron.  Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. 

Serie: Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of several pathogens. Efforts have been dedicated to the cattle tick control to diminish its deleterious effects, with focus on the discovery of vaccine candidates, such as BM86, located on the surface of the tick gut epithelial cells. Current research focuses upon the utilization of cDNA and genomic libraries, to screen for other vaccine candidates. The isolation of tick gut cells constitutes an important advantage in investigating the composition of surface proteins upon the tick gut cells membrane. This paper constitutes a novel and feasible method for the isolation of epithelial cells, from the tick gut contents of semi-engorged R. microplus. This protocol utilizes TCEP and EDTA to release the epithelial cells from the subepithelial support tissues and a discontinuous density centrifugation gradient to separate epithelial cells from other cell types. Cell surface proteins were biotinylated and isolated from the tick gut epithelial cells, using streptavidin-linked magnetic beads allowing for downstream applications in FACS or LC-MS/MS-analysis.

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

A modified density centrifugation gradient-based methodology was utilized to isolate epithelial cells from Rhipicephalus microplus gut tissue. Surface-bound proteins were biotinylated and purified through streptavidin magnetic beads for utilization in downstream applications.

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Forschung

Biochemie

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Genetik

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Neurowissenschaften

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Zelloberflächen-Biotinylierungs-Assay

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration