Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.

1. Die Projektierung des Zielproteins <ol><li> Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht. Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten. </li><li> Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak Etch Virus (TEV) Protease geschnitten Website zur Entfernung von His-Tag (ENLYFQG), Biotin-Tag-Sequenz für die Biotinylierung von Protein bei K (GLNDIFEAQKIEWHE) und flexiblen Gelenk mit Lücken, die Raum für die richtige Proteinrückfaltung (EFPKPSTPPGSSGGAP) ermöglichen. Anmerkung: Diese Sequenzen können je nach der gewünschten Fusions prot variierenEin. </li><li> Senden vollständige Aminosäuresequenz an ein Unternehmen für die Gen-Design / Optimierung für gewünschte Wirtsarten und Synthese. Subklonieren in einen Vektor der Wahl mit der BamHI-NotI-Stelle mit einem Kit oder durch Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen. </li></ol> 2. Machen Agar-Platten Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass alle Aktien von Antibiotika, Platten, Puffer, etc. ordnungsgemäß gelagert (Temperatur und Dauer) und bleiben frei von Proteasen (sterilisiert). <ol><li> Abwiegen Agar bei 1,5 Gew.% und Lysogenie Brühe (LB) bei 20 g / L und in eine Glasflasche Medien. Ein 500-ml-Flasche macht etwa 15 Platten. </li><li> Volumetrisch hinzufügen Reinstwasser, gut mischen und Autoklaven. </li><li> Lassen Flasche kühl an und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika. Vermeiden vorzeitigen Erstarrung der Agar, aber wenn Flasche kühlt zu viel und Lösung beginnt zu erstarren, Aufwärmen in der Mikrowelle. Hinweis: Unsere Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-GenE. Daher müssen alle Schritte Ampicillin bei 100 ug / ml enthalten. Die E. coli K12-Stamm erfordert Klonierung Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotikum. BL21-Bakterien-Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotikum. </li><li> Gießen 25-30 ml Lösung in 90 mm Petrischalen und genügend Zeit, um zu trocknen. </li><li> Label-Gericht mit geeigneten Antibiotika und speichern upside-down in 4 ° C, mit Parafilm oder in einem wiederverschließbaren Beutel. Hinweis: Die Platten sind gut für etwa einen Monat. </li></ol> 3. Klonierung des Biotin Tagged Plasmid Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Spin down Plasmid-Vektor bei 6.000 xg für 3 min, um zu pelletieren, und fügen Sie 10 ul sterilisiert Reinstwasser. </li><li> Entfernen Sie 50 ul chemisch kompetente E. coli-Zellen hohe Transformationseffizienz von -80 ° C und sofort auf Eis für 5-10 min. </li><li> 1 ul der Vektor-Lösung bei 0,5-1 ng/5056, L-Zellen an die 50 &amp;mgr; l E. coli-Zellen, und legen Sie die restlichen Plasmid in -80 ° C </li><li> Platzieren der Bakterien-Zellen, die den Vektor auf Eis für 5 min. </li><li> Hitzeschock die Zelle und Vektor Mischung für 30-45 sec in 42 ° C Wasserbad und Ortszellen wieder auf Eis für 2 min. </li><li> Add 250 ul Superbrühe mit optimalen Repression (SOC)-Medium (2% w / v-Bacto-Trypton, 0,5% w / v Bacto-Hefeextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM Glucose , hochreinem Wasser, pH = 7,0) hinzugefügt und bei 250 Upm bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: SOC nicht autoklavierbar, sondern Filter durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert werden. </li><li> Trockenplatten 10-15 min vor dem Beschichten Zellen. </li><li> Pipette 25, 50 und 100 &amp;mgr; l der Zelllösung auf separate Agarplatten, die Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika. Verwenden Sie Glasperlen Lösung gleichmäßig auf Agar-Platten zu verteilen. </li> &lt;li&gt; Platten bei 37 ° C inkubieren upside-down für 15-18 Std. </li><li> Check für kleine Einzelbakterienkolonien auf den Platten bei 4 ° C lagern Oberseite nach unten bis zur weiteren Verwendung (Fig. 2A). <ol><li> Wenn keine Kolonien vorhanden sind: <ol><li> Überprüfen Sie die Frische und Sterilität von Puffern und Zubehör. </li><li> Erhöhen Sie die Menge von Plasmid E. hinzugefügt coli K12-Stamm. </li></ol></li><li> Wenn große Kolonien vorhanden sind oder ein übermäßiges Wachstum der Kolonien (Abbildung 2B und 2C), restreak ein neues Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Platten Zellen bei niedriger Lautstärke. </li></ol></li><li> Beimpfen von 5 ml LB, enthaltend Ampicillin (100 &amp;mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie transformierter E. coli-Zellen. Aufwachsen Zellen über Nacht bei 37 ° C bei 250-300 UpM. </li><li> Der folgende Tag, verwenden Sie ein Plasmid Isolation Kit, um die Zielvektor aus der Nacht gro isolierenw-und Speicher gereinigt Plasmid bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. <ol><li> Optional: Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmid mit Absorptionswert bei 260 und 280 nm erhalten. </li></ol></li></ol> 4. Transformation von Plasmid in Expression-Host Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für E. coli BL21-Zellen mit den folgenden Änderungen: Hinweis: BL21 Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotika Ampicillin daher nur auf den Agarplatten zur Transformation aufgenommen. <ol><li> In 2-5 ul isolierte Plasmid bei 0,5-2 ng/50 ul Zellen aus Schritt 3,12-50 ul E. coli-Expressionswirtszellen. </li><li> Hitzeschock-Zellen, die für 60 bis 90 Sekunden. </li><li> Schütteln Lösung mit SOC-Medium bei 250 rpm für 60 min statt 30 min. </li></ol></li><li> Zupfen Sie eine Einzelkolonie von transformierten Bakterienzellen aus der Petrischale mit einem sterile Applikatorstäbchen und in ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Ampicillin (100 ug / ml). </li><li> Platzieren Reagenzgläser in Schüttler über Nacht bei 37 ° C bei 250 UpM. </li><li> Am folgenden Morgen, nehmen Sie 200 ul der Nacht wachsen-up und auf 5 ml LB mit Ampicillin bei 100 ug / ml hinzuzufügen. </li><li> Frieren Sie unten die restlichen Zellen mit 250 ul 50% Glycerin (steril) auf 750 ul Kultur und halten in -80 ° C Hinweis: Neue Testausdruck und Scale-up-Verfahren kann mit einem sterilen Applikator-Stick, ein Kratzen der gefrorenen Zellen zu erhalten und Impfen LB mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden. </li><li> Platzieren Reagenzglas in Schüttler bei 250-300 Upm bei 37 ° C, bis die optische Dichte (OD) zwischen 0,7-0,8 bei einer Absorption von 600 nm gemessen. </li><li> Induzieren Zellen mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM. </li><li> Schütteln für weitere 4 h bei 37 ° C bei 300 UpM. Alternativ können auch Zellenüber Nacht bei 18 ° C bei 250-300 rpm geschüttelt werden. Dies kann eine höhere Ausbeute an Plasmid zu erzeugen in Abhängigkeit von dem Zielprotein. </li><li> Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse der Testausdruck <ol><li> Nehmen Sie 500 ul der Kultur und der Platz in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min. Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;löslich&quot;. Pellet unter Vortexen in 200 &amp;mgr; l Beladungsfarbstoff (50 ul 2-Mercaptoethanol, 950 &amp;mgr; l Laemmli-Probenpuffer). Hinweis: Löslich Bakterienpellets wird verwendet, um zu bestimmen, ob das rekombinante Protein in den cytoplasmatischen Regionen der Bakterienzellen. Pellets können in -80 ° C ohne Belastung Farbstoff, bis sie benötigt gespeichert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als lösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie 1000 ul der Kultur und in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min.Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften &quot;unlöslich&quot;. Hinweis: unlöslich Pellets Denaturierung Verfahren unten, um Proteine ​​in Einschlusskörpern von Bakterien Zellen gefunden loslassen zu unterziehen. Pellets können in -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als unlösliche als auch zum Vergleich behandelt werden. <ol><li> Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet in 200 ul BugBuster und bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Spin down Probe erneut bei 13-15 g für 5 min und nehmen 50 ul Überstand und es um neue &quot;unlöslich&quot; 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen. </li><li> Dann fügen Sie 50 ul Ladefarbstoff auf diese neue Probe. </li></ol></li><li> Sieden löslichen und unlöslichen Proben für 5 min, um Proteine ​​für die SDS-PAGE-Analyse zu denaturieren. </li><li> Legen Sie jede Probe in Elektrophorese-Gel mit Standard-Leiter. </li><li> Um zu visualisieren, die Proteinproben mit einem staining Reagenz und folgen Sie der Firma Protokoll. </li><li> Bestimmen, ob das Protein exprimiert, in den löslichen und / oder unlöslichen Fraktionen durch Vergleich dieser zwei Bahnen sowie den Vergleich der Spuren mit den löslichen und unlöslichen Kontrollspuren (siehe Anmerkung 4.9.1 und 4.9.2) auf den SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). Ein dunkles Band sollte um das Molekulargewicht des Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fahrspuren angezeigt. Damit wird festgelegt, welche Isolierungsverfahren in Protokoll Nr. 6 zu verwenden. Anmerkung: Wenn ein Band in diesen beiden Regionen entweder als Isolation in 6 verwendeten Protokoll unten durchgeführt werden, oder das Protein kann in beide Richtungen getrennt werden, um zu bestimmen, welche Isolierungsverfahren erzeugt eine höhere Ausbeute an rekombinantem Protein (Fig. 3) . </li><li> Wenn ein 4 h und Induktion über Nacht durchgeführt wurde, festzustellen, welche Induktionsmethode die höchste Proteinproduktion für das Scale-up-Prozess (Abbildung 2). </li></ol></li></ol&gt; 5. Scale-up Verfahren und Hauptkultur <ol><li> Bereiten Wachstumsmedien mit 85,7 g Terrific Broth und 28,8 ml 50% Glycerin in 1,8 l Reinstwasser und Autoklaven auf Flüssigkeitskreislauf für 1 Stunde. </li><li> Starten Sie eine Übernachtkultur von gefrorenen Zell Lager in Schritt 4.5 erstellt. Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Mischungs 20 ml LB mit einer Endkonzentration von Ampicillin bei 100 ug / ml in einer sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben. </li><li> Mit einem sterilen Applikator-Stick einen Verschrottung von transformierten E. coli-Zellen und Drop-Applikator in den Kolben. Entfernen Applikator-Stick und Stecker Kolben mit Schaumstoffstopper oder Baumwolle und mit Alufolie abdecken, um die Sterilität zu erhalten. </li><li> Schütteln über Nacht bei 250 UpM bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Hauptkultur Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht. <ol><li> Gießen-Nacht-Kultur in 1,8 L von sterilen Nährmedien und fügen Ampicillin bei 100 &amp;mgr; g / ml und 6 bis 8 Tropfen sterilen Antischaum 204 unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> Platz Kulturen in einem 37 ° C Wasserbad mit 0,2 mm durch Belüftung Steine ​​gefilterte Druckluft Blasenbildung in Kulturen. </li><li> Sobald der OD 600 nm von 0,7-0,8 erreicht, induziert mit IPTG (1 mM) und damit zur Induktion entweder 4 h bei 37 ° C oder über Nacht in Abhängigkeit von löslichen / unlöslichen Ergebnisse von SDS-PAGE in Schritt 4.9 auftreten, auf 18 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln E. coli-Zellen <ol><li> Spin-Down der Zellkultur in 1 l-Zentrifugenflaschen (2 Flaschen / Kultur) für 15 min bei 14.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand abgießen und mit einem dünnen Spachtel, schöpfen die Bakterien zu pelletieren in zwei 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletiert werden. Hinweis: Jeder 1,8-l-Kultur in zwei Bakterienpellets, eine in jeder 50-ml-Zentrifugenrohr führen. </li><li> Shop-Pellets in -80 C bis Proteinisolierung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 6. Isolierung und Reinigung von rekombinantem Protein Hinweis: Wenn das Protein in der löslichen Region auf Basis von SDS-PAGE-Analyse von Schritt 4,9, dann wird &quot;native Isolation&quot; verwendet werden, aber für die unlöslichen Proteinen &quot;Nonnative Isolation&quot;-Verfahren durchgeführt. <ol><li> Zelllyse <ol><li> Nonnative <ol><li> Transformierten E. entfernen coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank und 20 ml Lyse / Waschpuffer (Tabelle 1) zu jedem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex und schütteln Sie die gefrorenen Pellets, bis es taut und löst in der Pufferlösung ohne großen Brocken. Inkubation über Nacht auf Nutator. Am folgenden Morgen sollte das Pellet jetzt eine viskose Aufschlämmung aufgrund der Denaturierung des Proteins aus dem Puffer sein. </li><li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei Raumtemperatur für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li><li&gt; Native <ol><li> Erhalten transformierten E. coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Hinzufügen Lysis Buffer (Tabelle 1) Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen und zu entfernen gefrorene Pellet durch Verwirbeln und rigoros Schütteln. Zeigen Pellet auf Eis. </li><li> Waschen Sonicator Sonde mit 70% Ethanol bei 100% Amplitude für 1-2 min. Wiederholen Sie dann mit hochreinem Wasser. </li><li> Ultraschallbad Bakterien zu pelletieren, während auf Eis für 5 min (Gesamtzeit von 10 min). <ol><li> Stellen Ultraschallgerät bei 30% Amplitude mit Puls von 30 Sekunden an/30 s aus. </li><li> Bob Zentrifugenröhrchen nach oben und unten während der Beschallung Intervall, um vollständig brechen die Zellpellet. Am Ende der Gesamtzeit sollte es keine sichtbaren Bakterien zu pelletieren Verlassen einer sehnig, zähflüssige Brei. </li><li> Reinigen Sie das Ultraschallgerät Sonde zwischen verschiedenen Proteinisolierungen sowie für die Lagerung mit 70% Ethanol und Reinstwasser, wie in Schritt 6.1.2.3 beschrieben. </li></ol></li&gt; <li> Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets. </li></ol></li></ol></li><li> Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie <ol><li> Nonnative <ol><li> 1-ml-Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung zu jedem Zentrifugenröhrchen (2 ml Harz für insgesamt 1,8 l-Kultur) und Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Gießen Schlamm in Affinitätssäule und lassen Lösung durch Hahn Ventil vollständig in die Abfallbecherglas tropfen. </li><li> Zuführen 10 Wäschen mit 10 ml Lyse / Waschpuffer für jeden Waschgang. <ol><li> Für die ersten zwei Wäschen, fügen Sie die 10 ml-Zentrifugenröhrchen auf die zusätzliche Harz zu entfernen und gießen Sie dann in die Spalte. Die zusätzlichen Waschungen können direkt Spalte hinzugefügt werden. </li><li> Nach jedem Wasch, rühren Sie den Harz mit einem Glasstab. Sobald der Wasch tropft in den Abfall Becher können die nächsten 10 ml zugegeben werden. </li></ol></li><li> Nach dem vollständigen dr waschendurch ips, in der Nähe Absperrventil, entfernen und ersetzen Abfallbecherglas mit 50 ml-Zentrifugenröhrchen für die Protein-Sammlung. </li><li> 15 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und rühren-up Harz, so dass Lösung für 5 min zu sitzen. Absperrhahn öffnen Ventil und sammeln Elution. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren 15 ml. </li></ol></li><li> Ureinwohner <ol><li> Folgen Sie der Nonnative Affinity Chromatography oben (Schritte 6.2.1.1-6.2.1.4) mit Ausnahme stellen Sie die folgenden Parameter: <ol><li> Inkubieren Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 h auf Nutator. </li><li> Verwenden Sie die geeignete Waschpuffer (Tabelle 1). </li></ol></li><li> 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und Inkubation mit Harz 5 min. <ol><li> Offene Absperrventil und sammeln Elution, bis die meisten der Lösung durchtropft. </li><li> In 90 ul / Bradford Reagenz auf 96-Well-Platte zu löschen. Nach jeder Elution ermöglichen 10 ul soLösung, um aus der Spalte in den wohl mit 90 ul Bradford-Reagenz tropfen. </li><li> Weiter Zugabe von 5 ml Elution Buffer an, bis Bradford-Test erkennt nicht mehr Protein (Farbe reicht von dunkelblau bis hellblau zu löschen). Dies dauert in der Regel 4-5 Elutionsvolumina. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Dialyse / Renaturierung <ol><li> Machen nonnative (Renaturierung) und native Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Speicher in 4 ° C Anmerkung: Der pH-Wert der Dialyse-Puffer werden durch isoelektrische Punkt des Zielproteins (pI) bestimmt. Als eine Faustregel, Proteine ​​sollten mindestens einen vollen Punkt über oder unter ihrem pI-Werte gepuffert werden. </li><li> Übertragen nativen und nicht-nativen Elutionen einen Dialyseschlauch mit entsprechenden Molekulargewichtsgrenze (25.000 MWCO für NGF und 50.000 MWCO für Sema3A). Je eine Proteinprobe in jeweiligen Dialysepuffer 1 für 4 h bei 4 ° C und dann mit dem entsprechenden Puffer 2 über ersetzenNacht bei 4 ° C Hinweis: Protein muss in jedem Puffer für mindestens 4 Stunden für die ordnungsgemäße Rückfaltung und Pufferaustausch stattfinden dialysiert werden. </li><li> Konzentrieren Sie die dialysiert Protein Elutionen auf weniger als 5 ml Zentrifugen mit Spin-Konzentratoren. Hinweis: Die Proteine ​​können durch Verwendung schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt und erneut eingeengt werden. </li></ol></li><li> Bestimmen Proteinkonzentration (mg / ml) durch Gefriertrocknen einer 10-50 ml Probe in einem vorgewogenen Zentrifugenröhrchen. <ol><li> Optional: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ε, so daß die Konzentration des Proteins in Zukunft Isolierungen durch Messung der Absorption einer Probe bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden: C = A 280nm / &amp;epsi; L, wobei L die Weglänge ist. </li></ol></li></ol> 7. Biotinylierung von gereinigtem Protein <ol><li> Dialysiere Proteine ​​in 10.000 MWCO Dialysekassetten against 10 mM Tris (pH = 8,0), die Änderung der Puffer alle 4 Stunden mit insgesamt sechs Veränderungen. </li><li> Transfer der rekombinanten Proteine ​​(jetzt in 10 mM Tris-Puffer), um 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Biotinylierung. </li><li> Biotinylieren Proteine ​​unter Verwendung einer Biotin-Protein-Ligase-Kit. </li><li> Proteine ​​dialysiert gegen PBS (pH = 7,4) mit 10.000 MWCO Dialysekassetten mit 3 Puffer ändert einen Tag für 2 Tage. </li><li> Bestimmen Sie die Prozent Biotinylierung von Proteinen mit Hilfe eines quantitativen Kit. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration wieder wie in 6.4 und bei 4 ° C oder aliquotieren und bei -20 ° C zur Langzeitlagerung beschrieben. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kulti...

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt 2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen 3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt. Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E<html> tc.) 5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig 9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden 5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen 10 Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität 11 liefert. Zelt &quot;&gt; Nach Hostauswahl müssen weitere Pflege in der Wahl des geeigneten Expressionsvektor ausgewählt und gesteuert Proteinexpression zu erleichtern aufgenommen werden. Synthese von rekombinanten Proteinen beginnt mit einem Ziel-DNA-Sequenz, die unter der Leitung des Bakteriophagen T7 Transkriptions-und Translationssignale kloniert wird, und Expression in Wirtszellen, die chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gen 12 enthält, induziert. Diese Vektoren, aus dem Plasmid pBR322 (für einen Überblick siehe Referenz 13), fest mit dem T7-Promotor zunächst von Studier und Mitarbeiter entwickelten 14 gesteuert und zusätzliche Steuerung durch die Einbeziehung der lac-Operator-lac-Repressor (LAC1) 15,16. Für die rekombinante Proteintechnik bietet das Expressionssystem die Fähigkeit, eine spezifische Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins durch Einsetzen verschiedener DNA-Zielsequenzen anzupassen oder um Fusionsproteine ​​zu erzeugen bis kombinierter Domain gemachts von einzelnen Proteinen. Darüber hinaus können einige Vektorreihe umfassen Peptid-Tag Modifikationen am N-oder C-Terminus angeordnet werden. Unser Gestaltungszwecken wurde ein Histidin (His)-Tag an die DNA-Zielsequenz zur Reinigung aufgenommen und 15 Aminosäure biotinylatable Sequenz wurde für die Biotinylierung 17,18 enthalten. In diesem Protokoll ein Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, wurde ausgewählt, um unsere biotinylatable Fusionsprotein-Sequenzen tragen. Die Expression wird in diesem Vektor durch T7-lac-Promotor kontrolliert und ist leicht mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur 19 zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven 20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden. Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein 21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) 10 (für eine Übersicht siehe Referenz 24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung 25-27. Biophysikalischen Sonden 28,29, Biosensoren 30 und Quantenpunkte 31 sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K d in der Größenordnung von 10 -15 M 27 nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden 18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen 21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1,4-dithio--DL-threitol, DTT, 99.5%</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:121px;">127</td>
			<td style="width:239px;">100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">2-Hydroxyethylmercaptan &#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>642</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid, glacial</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR001.500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam 204</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6426</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barstar-NGF pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BL21(DE3) Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69450</td>
			<td>1 ml; Expression Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bradford reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BugBuster</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70922-3</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel filtration standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>151-1901</td>
			<td>6 vials</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLY001.1</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>152</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">His-Pur Ni-NTA Resin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88222</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>EMD&#160;</td>
			<td>HX0603-3</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole&#160;</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>194</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laemmli sample buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>270</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB Broth&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovaBlue Competent Cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69825</td>
			<td>1 ml; Cloning Host</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>10 pack</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>01247</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sema3A-pET-21a(+)</td>
			<td>GenScript USA Inc.</td>
			<td></td>
			<td>4 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate diabasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136-500G</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Terrific Broth</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TER409.5</td>
			<td>5 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Chem-Impex International</td>
			<td>667</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610732</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone, pancreatic</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.07213.1000</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract, granulated</td>
			<td>EMD</td>
			<td>1.03753.0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:299px;">Name of Kits/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">&#160;&#196;KTApurifier10</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">28-4062-64&#160;</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Benchtop Orbital Shaker</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">SHKE4000</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">BirA500</td>
			<td style="width:191px;">Avidity</td>
			<td style="width:121px;">BirA500</td>
			<td style="width:239px;">Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Casette</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">66380</td>
			<td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:191px;">Spectrum Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:121px;">132127, 132129</td>
			<td style="width:239px;">MWCO: 25,000 and 50,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flow Diversion Valve FV-923</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">11-0011-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:121px;">1094598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Frac-950 Tube Racks, Rack C</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fraction Collector Frac-950</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">18-6083-00</td>
			<td>Includes kits and accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heated/Refrigerated Circulator&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">13271-102</td>
			<td>Model 1156D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heating Oven FD Series</td>
			<td style="width:191px;">Binder</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Model FD 115</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td>
			<td style="width:191px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">17-1069-01</td>
			<td style="width:239px;">Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">J-26 XPI Avanti Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">393126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JA 25.50 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JLA 8.1 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">969329</td>
			<td>Includes 1 L polyporpylene bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">JS 5.3 Rotor</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:121px;">368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laminar Flow Hood</td>
			<td style="width:191px;">Themo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">1849</td>
			<td style="width:239px;">Forma 1800 Series Clean Bench</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:191px;">TECAN</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>infinite M200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">165-8004</td>
			<td style="width:239px;">4-gel vertical electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Mini-PROTEAN TGX Precast Gels</td>
			<td style="width:191px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">456-9036</td>
			<td style="width:239px;">Any kDa, 15-well comb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ni-NTA Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>737-2512</td>
			<td>49 ml&#160;volume ECONO-Column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:191px;">OMEGA bio-tek</td>
			<td style="width:121px;">D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">PowerPac HC Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:121px;">164-5052</td>
			<td>250 V, 3 A, 300 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:121px;">3119-0050</td>
			<td>50 ml&#160;tubes for JA 25.50 rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Spin-X UF Concentrators</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">431488, 431483</td>
			<td>&#160;20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Subcloning Service</td>
			<td style="width:191px;">GenScript USA Inc.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>Protein Services</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ultrasonic Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:121px;">18910445A</td>
			<td>Model CV18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Vortex-Genie 2</td>
			<td style="width:191px;">Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Model G560</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, isolation, and purification of soluble and insoluble biotinylated proteins for nerve tissue regeneration

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

<html> Klonierung und Expression-Test Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). W...

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Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.4K Aufrufe.  University of Akron.  Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. 

Serie: Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Forschung

Biotechnik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several angiogenic and prevascularization strategies have been established. However, most cell-based approaches include time-consuming in vitro steps for the formation of a microvascular network. Hence, they are not suitable for intraoperative one-step procedures. Adipose tissue-derived microvascular fragments (ad-MVF) represent promising vascularization units. They can be easily isolated from fat tissue and exhibit a functional microvessel morphology. Moreover, they rapidly reassemble into new microvascular networks after in vivo implantation. In addition, ad-MVF have been shown to induce lymphangiogenesis. Finally, they are a rich source of mesenchymal stem cells, which may further contribute to their high vascularization potential. In previous studies we have demonstrated the remarkable vascularization capacity of ad-MVF in engineered bone and skin substitutes. In the present study, we report on a standardized protocol for the enzymatic isolation of ad-MVF from murine fat tissue.

We present a protocol to isolate adipose tissue-derived microvascular fragments that represent promising vascularization units. They can be rapidly isolated, do not require in vitro processing and, thus, may be used for one-step prevascularization in different fields of tissue engineering.

Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

A functional microvascular network is of pivotal importance for the survival and integration of engineered tissue constructs. For this purpose, several ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine ​​für Nervengeweberegeneration

Expression, Isolierung und Reinigung von löslichen und unlöslichen biotinylierter Proteine für Nervengeweberegeneration