The authors have nothing to disclose.

1. Nanostrukturen <ol><li> Wählen, Durchmesser 25 mm Glasdeckgläsern mit einer ungefähren Dicke von 170 (No. 1,5) &amp; mgr; m als Substrate zur Nanofabrikation. </li><li> Tauchen Sie die Deckgläser in Piranha-Lösung (3: 1 Verhältnis von Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid) für mindestens 6 Stunden. Mit reichlich Reinstwasser 18,2 MOhm entionisiertes destilliertes Wasser (DDW) Waschen Sie den piranha getränkt Deckglas. ACHTUNG: Piranha-Säure reagiert heftig mit organischen Materialien und müssen mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden. </li><li> Beträgt 10 nm Chrom-Dünnfilm auf den Deckgläschen durch Elektronenstrahlverdampfung, um Ladungseffekte während der Strukturierung und Abbildung von Nanostrukturen zu vermeiden. </li><li> Drehen die erste Schicht der Doppelschicht Resist, bestehend aus Ethyllactat Methylmethacrylat (MMA_EL6) -Copolymer bei 2.000 rpm für 45 sec, und dann bei 150 ° C backen. Spin der zweiten Schicht aus Poly-Methylmethacrylat (950PMMA_A2) bei 3000 Upm für 45 sec bei 180 ° C backen. </li><li> Prasselnn die Doppelschicht Resist unter Verwendung des Elektronenstrahl-Lithographie (EBL) bei 25 kV mit einer Fläche von 300 &amp; mgr; C-Dosis / cm 2. Entwickeln Sie in Isopropylalkohol (IPA) / Methylisobutylketon (MIBK): 2/1 und spülen in IPA. </li><li> Ablagerung Ti (5 nm) / Au (80 nm) auf dem Substrat unter Verwendung eines E-Strahl-Verdampfer. </li><li> Nach der Goldabscheidung, heben Sie das Copolymer-Doppelschicht zu widerstehen durch Eintauchen des Substrats in Aceton 4 Stunden. </li><li> Überprüfen Sie das Substrat mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM), um Nanostruktur Form und Größe zu bestätigen, nehmen Sie das übrige Chrom aus dem Substrat über Nassätzung mit CR-7 Ätzmittel für 60 Sekunden bei Raumtemperatur und dann in DDW ausspülen. </li><li> Entwerfen Sie ein Mitte-zu-Mitte-Array-Abstand von 33 &amp; mgr; m, um Platz für Cell Imaging zwischen Arrays zu verlassen. Pattern die Nanostrukturen in 20 x 20 Muster für jedes Feld mit einem Abstand von 300 nm unter Verwendung eines E-Strahl-Schriftsteller. Jeder Chip enthält 300 Arrays mit einer typischen Nanostrukturdimension von 80 ± 2,5 nm Höhe und 70 ± 2,5 nm Durchter. </li><li> Inspizieren eine Untermenge von Anordnungen unter Verwendung des Atomkraftmikroskops (AFM) zur Überprüfung der Größe und Gleichförmigkeit. </li><li> Bringen Sie einen Stützring, in der Regel Silizium, auf der Rückseite des Deckglases mit einem UV-härtenden Epoxy. </li></ol> 2. Chip Reinigung und Anwendung von selbstorganisierten Monoschicht <ol><li> Zum Reinigen und Regenerieren der Chips, Plasma Asche bei einer Leistung von 40 W in einem 300 mTorr Gemisch aus 5% Wasserstoff, 95% Argon für 45 sec nach dem Reinigen der Kammer für 5 min unter den gleichen Bedingungen. </li><li> Funktionalisieren die Gold-Nanostrukturen unmittelbar nach Plasmaveraschung durch Eintauchen des Chips in einem Zweikomponenten-ethanolische Thiollösung bestehend aus einem 3: 1-Verhältnis von SH- (CH 2) 8 -EG 3 -OH (SPO) und eine Komponente mit entweder einem Amin oder carboxylfunktionelle Gruppe, nämlich SH- (CH 2) 11 -EG 3 -NH 2 (SPN) oder SH- (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC). </li><li> Verlassen Sie die Chip-in die Thiollösung O / N, um eine selbstorganisierte Monoschicht (SAM) zu bilden. </li><li> Spülen Sie den Chip mit Ethanol und mit Stickstoffgas trocken. </li><li> Falls erforderlich, speichern Sie die funktionalisierten Chip für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C. </li><li> Wenn Sie bereit sind für den Einsatz reagieren die SPN oder SPC-Komponente mit dem Liganden unter Verwendung einer Chemie in Abhängigkeit von der Ligand der Wahl (siehe unten). Anmerkung: Die Chips können regeneriert und re-funktionalisierten Dutzende Male. Eine gegebene Chip kann für Zeiträume, die von 6 Monaten bis zu einem Jahr reichen eingesetzt werden. Die Spektren, gemessen an einem bestimmten Array werden zuverlässig nach wiederholten Regenerationen durch Plasmaveraschung, gefolgt von Biofunktionalisierung wiedergegeben. 29 </li></ol> 3. Oberflächenfunktionalisierung und kinetische Charakterisierung Hinweis: Mit der funktionalisierten Chip in das Handels SPR Instrument, um die Geschwindigkeitskonstanten zwischen dem Liganden und dem Analyten zu charakterisieren, als auch um den Widerstand der SAM, um unspezifische b studiereninding. Es gibt eine Vielzahl von Durchflussraten und mikrofluidischen Designs, die für eine effiziente Oberflächenfunktionalisierung ermöglichen. Da haben wir einen im Handel erhältlichen SPR wir standardisiert um seine empfohlene Durchflussmengen. Wir stellen fest, dass diese Flussraten sind typisch für alle SPR Instrumente und so sind nicht einschränkend. Die SPR-Gerät ist nicht notwendig, da alle Funktionalisierung kann direkt auf der LSPR-Chip durchgeführt werden, aber es hat zu reduzieren unsere Arbeitsbelastung, weil es ein Multiplex-Instrument ist, während unsere LSPR Mikrofluidik-Setup nicht. <ol><li> Funktionalisieren Kommerzielle blanken Goldchip mit dem SAM wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Bei Verwendung eines SPC anhand SAM Aktivieren der Carboxylgruppe mit einem 1: 1-Mischung aus 133 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) und 33 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) in DDW 10 Minute </li><li> Konjugieren des aktivierten Carboxylgruppe mit dem Antikörper / Liganden von Interesse für 300 Sekunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ul / min. Bereiten Sie die Liganden inpH 6 Phosphatpuffer, typischerweise, aber dies kann in Abhängigkeit von dem Molekül variieren. </li><li> Nach der Liga Konjugation, fließen 0,1 M Ethanolamin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als ein Desaktivator für den Schritt 300 sec mit einer Rate von 30 ul / min. Ethanol hilft bei der Minimierung der nicht-spezifischen Bindung. </li><li> Präsentieren den interessierenden Analyten mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml / min mit einem Bereich von Konzentrationen und berechnen Sie die Geschwindigkeitskonstanten mit einer kinetischen Analyse-Software. </li><li> Wenn nicht-spezifische Bindung ist problematisch, erhöhen das Verhältnis der SPO zu SPC oder SPN. </li></ol> 4. LSPR Allgemeine Einstellungen <ol><li> Mikroskopeinstellungen: <ol><li> Verwenden Sie ein 100-W-Halogenlampe zu Koehler beleuchten die Probe. Verwenden Sie einen Langpassfilter (typischerweise 593 nm cutoff) in den Strahlengang, um Wellenlängen, die nicht auf die Resonanzverschiebung (Abbildung 2) beitragen, zu eliminieren. </li><li> Für die LSPRi Datensammlung, verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einem 40x Öl Immersion Ziel (1,4 NA) und einem thermoelektrisch gekühlten 16-Bit-CCD-Kamera. </li><li> Legen Sie einen Strahlteiler am Ausgang des Mikroskops zu Imagery und Spektren gleichzeitig zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Temperatur gesteuert Mikroskoptisch bis 37 ° C ins Gleichgewicht für 4 Stunden. </li><li> Beinhalten eine zusätzliche Inkubation Anordnung auf dem Mikroskop, um die CO 2 -Konzentration und der Feuchtigkeit auf 5% bzw. 95% zu regeln. </li></ol></li><li> Chip-Herstellung und Montage: <ol><li> Funktionalisierung der LSPR-Chip, wie in Abschnitt 2 mit den optimalen Zweikomponenten-SAM-Verhältnisse aus den SPR-Experimente bestimmt beschrieben. </li><li> Laden Sie den Chip in einem maßgeschneiderten mikrofluidischen Halter wie folgt. Platzieren Sie den Chip auf einer Aluminiumunterteil. Sandwich den Chip zwischen diesem Unterteil und einem Silikondichtung und einem durchsichtigen Kunststoff-Oberteil. Verwenden Sie 4 Schrauben, um die Montage zu klemmen. </li><li> Für eine typische SPC-basierte Anwendung Thiol, Tropfenlack 300 ul einer 1: 1-Mixtur von 133 mM EDC und 33 mM NHS in DDW die Carboxylgruppen des SPC Thiolkomponente zu aktivieren. </li><li> Warten Sie 10 min und die Oberfläche mit 10 mM PBS Hand spülen. </li><li> Konjugieren des aktivierten Carboxylgruppe mit dem Liganden (üblicherweise ein Antikörper oder Antikörper-Fragment) von Interesse durch Tropfbeschichtung 300 ul Ligandenlösung. </li><li> Warten Sie 30 Minuten und von Hand mit 10 mM PBS spülen. </li><li> Drop Mantel 300 ul 0,1 M Ethanolamin in PBS auf dem Chip nicht-spezifische Bindung zu minimieren. 10 Minuten warten. </li><li> Mit PBS, enthaltend 0,005% Tween 20 (PBS-T20), waschen Ethanolamin. </li><li> Legen Sie ein Quarzstück oberhalb des Chips, um Schwankungen in den Daten zu einem Wechsel Meniskus Verwandte reduzieren. </li><li> Halten Sie die Chip-nass mit PBS-T20-Puffer, während die Montage auf Mikroskop. </li><li> Setzen Sie den LSPR Chip-Montage fest in den beheizten Bühne Probenhalter und befestigen mikrofluidischen Schläuche. </li><li> Befestigen Sie den Schlauch an die Mikrofluidik Montage und Strömungs buffer (oder serumfreie Medien für Zellstudien), bis ein Gleichgewichtszustand erreicht ist. </li><li> Ermöglichen die Montage und Mikroskops, für mindestens 2 Stunden äquilibrieren. </li><li> Ausrichten der Chips mittels Joystick so dass der Zentralanordnung mit dem Lichtleiter zur Spektroskopie ausgerichtet sind. Spektroskopiedaten unter Verwendung eines Spektrometers und Spektralanalyse Software übernommen. </li><li> Halten Sie Arrays im Fokus während des gesamten Experiments unter Verwendung von Software-Autofokus, Zeiss Definite Focus oder gleichwertige Autofokuseinrichtung. </li></ol></li></ol> 5. LSPR Imaging von Anti-c-myc Sekrete aus 9E10 Hybridomzellen Anmerkung: Die Hybridomzellinie für diese Studie verwendete Ausdruck anti-c-myc-Antikörper konstitutiv und daher keine chemische Auslöser erfordern <ol><li> Funktionalisieren der Nanostrukturen mit c-myc-Peptid. Dies hat einen K D -Wert von 1,77 nM für die Anti-c-myc-Antikörper, die von Klon 9E10 Hybridom-Zellen sezerniert. </li><li> Kultur die Hybridomzellen in complete Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotikum in einem T75-Kolben bei 37 ° C unter 5% CO 2. Aufrechterhaltung einer Zelldichte von 4 × 10 5 Zellen / ml. </li><li> Für die Zellsekretion Studien Pellet Zellen von der T75-Flasche durch Zentrifugation, wasche zweimal mit RPMI-1640-serumfreiem Medium (SFM), um die sekretierten Antikörper zu entfernen, und Einstellen der Zelldichte auf 4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Ernten Sie die Zellen und Test für die Lebensfähigkeit vor der Einführung sie an die LSPR-Chips. </li><li> Einzuführen 50 ul der Zelllösung von Hand auf den LSPR Chips mit einer Mikropipette. Nach wenigen Minuten 25 bis 50 Zellen haften an der Oberfläche der LSPR Chips. </li><li> Wegwaschen die restlichen Zellen in Lösung mit frischem SFM mit dem mikrofluidischen Perfusionssystem. </li><li> Wählen Sie die LSPR-Arrays für die Bildgebung, die in der Nähe sind, innerhalb von 10 &amp; mgr; m, aber nicht mit den Zellen überlappen. </li><li> Um sicherzustellen, dass das Signal spezifisch auf die sekretierten anti-c-myc ANTIB istodies Einführung der Zellkulturmedien mit und ohne die vorliegende Antikörpern sowie mit den Antikörpern, aber mit ihren Bindungsstellen durch die Anwesenheit einer sättigenden Konzentration von c-myc-Peptid in der Lösung blockiert. </li><li> Kalibrieren der Sensoren am Ende jedes Durchlaufs mit einer sättigenden Lösung von anti-c-myc-Antikörper (250 nM). Dies hilft bei der Normierung der Antwort der Sensoren und bestimmen fraktionale Besetzung bezogen auf die Biofunktionalisierung Profil von jedem Lauf. </li><li> Korrektur der Drift in der X- und Y-Richtung unter Verwendung der Bildausrichtung Software. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+single-cell+IgG+secretion+frequency+and+rates+in+human+memory+B+cells+by+CpG+DNA,+CD40L,+IL-21,+and+cell+division.">Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division.</a> Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).</li><li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis.">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li></ol>

We thank George Anderson for helpful comments and discussions. This work was supported by the Naval Research Laboratory&#8217;s Institute for Nanoscience and the National Research Council Research Associateship Award.

The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines. 
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Regulierung von vielen physiologischen Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Eine Vielzahl von Proteinen und Vesikel können ausgeschieden werden, daß anschließend auslösen komplexen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Wundheilung, Immunantwort, Migration und Proliferation. 1-5 Störungen des interzelluläre Signalwege sind bei zahlreichen Erkrankungen einschließlich Krebs, Atherosklerose in Verbindung gebracht und Diabetes, um nur einige zu nennen. Die optimale Zellsekretion Test sollte in der Lage, räumlich und zeitlich Kartierung des sekretiertes Protein von Interesse ohne Beeinträchtigung der entsprechenden Signalwege sein. Auf diese Weise kann kausalen Beziehungen zwischen den Konzentrationsprofilen und der Reaktion der Aufnahmezellen ableiten. Leider sind viele der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden basierende Techniken nicht diese Kriterien erfüllen. Fluoreszierende Fusionsproteine ​​können verwendet werden, um den Analyten zu markieren, werden wnnerhalb die Zelle kann aber den sekretorischen Weg zu stören, oder sezerniert wird, ergibt sich ein diffuses Glühen außerhalb der Zelle, die schwierig zu quantifizieren ist. Fluoreszenz immunosandwich basierende Tests sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum Erfassen der Zellabsonderungen aber typischerweise die Isolation einzelner Zellen 6-11. Darüber hinaus ist die Einführung des Fühl Antikörper typischerweise anhält oder endet, das Experiment und die Größe der Antikörper markiert, 150 kDa für IgG ist ein Hindernis für die nachgeschalteten Signal. Wegen dieser Hindernisse ist es vorzuziehen, dass eine markerfreie Technik zur Bild Protein Sekreten und unter den bestehenden Label-freie Technologien verwendet werden, Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) Sensoren sind ausgezeichnete Kandidaten. 12-17 Diese Sensoren sind in großem Umfang für Analyt-Bindungsstudien von Proteinen, Exosomen und andere Biomarker verwendet. 18-24 Bei LSPR, das Plasmonen nanostructures können lithographisch auf Deckgläser strukturiert und aufgeregt mit sichtbarem Licht über Standard-Weitfeldmikroskopie Konfigurationen werden. Aufgrund ihrer nanoskaligen Platz, ist der Hauptteil des Glassubstrats für gemeinsame Abbildungstechniken wie Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie Herstellung dieser Sonden gut für die Integration mit Lebendzell-Mikroskopie geeignet erhältlich. 25-28 Wir haben die Echtzeitmessung nachgewiesen Antikörpersekrete aus Hybridomzellen funktionalisierte Gold plasmonic Nanostrukturen mit räumlichen und zeitlichen Auflösung von 225 msec und 10 um betragen. Der grundlegende Chip-Konfiguration ist in 1 veranschaulicht. 28 die Ausgangsstrahlengang des Mikroskops zwischen einer CCD-Kamera zur Bild verwendet und ein faser optisch gekoppelten Spektrometer für die quantitative Bestimmung von fraktionale Besetzung einer gegebenen Anordnung von Nanostrukturen (Abbildung 2 aufgeteilt ). Die Protocol in diesem Papier wird die Versuchsanordnung zur Echtzeitmessung von Einzelzellsekrete, während gleichzeitig die Kontrolle der Reaktion der Zellen unter Verwendung des Standardhellfeldmikroskopie. Der multidisziplinäre Ansatz umfasst die Herstellung von Nanostrukturen, Funktionalisierung der Nanostrukturen für die hochaffine Bindung von Analyten, Oberflächenoptimierung sowohl für die Minimierung nicht-spezifische Bindung und Charakterisierung von Geschwindigkeitskonstanten unter Verwendung eines kommerziellen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Instrument, die Integration von Zelllinien auf das Substrat, und die Analyse der Bilder und Spektraldaten. Wir erwarten, dass diese Technik, um eine Technologie für die räumlich-zeitliche Zuordnung der Zellsekrete und ihrer kausalen Beziehungen mit Aufnahmezellen sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25mm diameter glass coverslips</td>
			<td>Bioscience Tools&#160;</td>
			<td>CSHP-No1.5-25</td>
			<td>&#160; 170&#177;5 &#181;m is optimal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-methyl methacrylate</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl lactate methyl metacrylate</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>MMA EL6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Temescal</td>
			<td>FC-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam lithography</td>
			<td>Raith</td>
			<td>Series 150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CR-7 chromium etchant</td>
			<td>Cyantek</td>
			<td>CR-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Ultra 55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Nanoscope III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma ashing system</td>
			<td>Technics</td>
			<td>Series 85 RIE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)&#160;</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 001-m8.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 003m11n3-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td>
			<td>Prochimia</td>
			<td>TH 002-m11.n3-0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface plasmon resonance system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>XPR36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bare gold chip</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>GLC chip</td>
			<td>Plasma ashed to remove the monolayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentylamine-Biotin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>21345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutraavidin</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca R2</td>
			<td>Thermoelectrically cooled (16 bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>QE65Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrasuite</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>version1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c-myc peptide HyNic Tag</td>
			<td>Solulink</td>
			<td>SP-E003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-c-myc antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free media RPMI 1640&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11835-030&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine DHPE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-1392</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free technique for the spatio-temporal imaging of single cell secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

In einem typischen Live Zellsekretion Studie gibt es mehrere Betriebsarten der Datensammlung stattfindet, Fig. 3 zeigt eine Überlagerung von einer LSPRi Bild, das die quadratische Anordnungen herausstellt, und ein übertragenes Lichtbild belichtet, die die Zelle an der linken unteren hervorhebt. Daten werden typischerweise über eine 3-Stunden-Periode, gefolgt von der Einführung einer sättigenden Lösung des Analyten für den unten beschriebenen Normalisierungsberechnung gesammelt. Fluoreszenzbilder können auch durch das automatische Schalten eines Filterwürfel in die Datensammelroutine integriert werden. In Figur 4 eine Zelle mit dem fluoreszierenden Membranfarbstoff Rhodamin DHPE gefärbten aufweist Lamellipodia artigen Verlängerungen (Pfeile). Wenn solche Erweiterungen sollten mit den Arrays überlappen sie ein falsch-positiv für Protein-Sekretion geben würde. Nachdem mehrere Modi der Bildsprache kann dazu beitragen, solche Vorkommnisse. Figur 5 zeigt Spektrometrie Daten vor und achterner die Einführung einer sättigenden Lösung (400 nM) von kommerziell erworben anti-c-myc-Antikörper gegen den c-myc-funktionalisierten Arrays. Es wurden keine Zellen in diesem Versuch vor. Das Spektrum zeigt sowohl eine Rotverschiebung und eine Zunahme der Intensität. Die Differenz der Flächen unter den beiden Kurven führt zu einem Anstieg in der Anordnung der Bildintensität in LSPRi Modus auf der CCD-Kamera. Eine nichtlineare Kleinste-Quadrate-Datenanalyseansatz wurde entwickelt, um fraktionale Besetzung der Oberfläche gebundenen Liganden aus der Spektren herzuleiten. 30,31 Am Ende des Experiments wurden die gesättigten Intensitätswerte (dh fraktionale Besetzung ≈ 1) verwendet werden, um eine normierte Antwort für jedes Feld unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Wo sind die normierte Intensität zum Zeitpunkt t, Anfangsintensität zu Beginn des Versuchs, endgültige gesättigte Intensität und gemessene Intensität des Arrays zum Zeitpunkt t </em&gt; sind. Normalisierte Werte von zwei Anordnungen sind in Fig. 6 gezeigt ist eine Anordnung innerhalb von 10 &amp; mgr; m der Zelle in Untersuchung während der andere, als Kontrolle verwendet wurde, war ein Abstand von 130 um aus der Zelle. Der plötzliche Anstieg der normalisierten Antwort der Anordnung am nächsten an der Zelle relativ zu dem flachen Verlauf der Steueranordnung ist ein Hinweis auf eine lokalisierte Explosion der sekretierten Antikörper. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> Abbildung 1. Sensor-Design. Eine Zeichnung, die die Geometrie eines typischen Live-Cell-Sekretion Experiments. Die Zelle (blau Sphäroid) wird an den LSPR-Chip, der Arrays von biofunktionalisierten Gold-Nanostrukturen enthält, abgeschieden. In der vergrößerten Ansicht der Zelle Sekretion von Interesse, in diesem wie Y-förmige Moleküle gezeigten Fall Antikörper, wird gemessen, wie sie an die Oberfläche bindender funktionalisierten Nanostrukturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> Abbildung 2. Optical-Setup. Das beleuchtete Licht aus einer Halogenlampe wird zunächst durch einen Langpassfilter (LP) filtriert. Das Licht wird linear polarisiert (P1) und beleuchtet die Probe über ein 40X / 1,4 NA-Objektiv. Das gestreute Licht wird durch das Objektiv durch einen gekreuzten Polarisator (P2) gesammelt und weitergeleitet. Eine 50/50 Strahlteiler (BS) in den gesammelten Lichtpfad zum gleichzeitigen spektroskopischen und Bildanalyse eingesetzt. Oben rechts:. Ein Rasterkraftmikroskopie Bild von 9 individuellen Nanostrukturen mit einem Abstand von 300 nm abgetrennt <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a>um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> Abbildung 3. Live Cell LSPRi Study. A verschmolzen Durchlicht und LSPRi Bild, das einen einzigen Hybridomzelllinie (unten links) um 12 Arrays umgeben. Dies ist eine kontrastverstärkten Bild. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> Abbildung 4. Live Cell Fluorescence Studie. Eine Leuchtstofffalschfarbenbild eines einzelnen Hybridomzelllinie mit Rhodamin DHPE, die eine Membran-Farbstoff angefärbt. In Fluoreszenz-Imaging-Modus die Arrays sind im Allgemeinen nicht sichtbar ist, ist jedoch ein in der Nähe Array hier beobachten, wie abfehlt Quadrat in der rechten unteren Ecke. Die Zelle kann gesehen werden, aus dem Array obwohl tentakelartige Verlängerungen (möglicherweise Filopodien oder Lamellipodia) nach außen von den Zellen (Pfeile), die sich trennen. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> Figur 5. Spectral Modalität. Die von einem c-myc-funktionalisierten Array vor und nach der Einführung von 400 nM Lösung von anti-c-myc-Antikörper erhaltenen Spektren. Keine Zellen in dieser Studie vor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src= &quot;/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6. Single Cell-Sekretion. Die Antwort eines Arrays innerhalb von 15 &amp; mgr; m aus einer einzigen Zelle und eines sich 130 &amp; mgr; m entfernt (Kontrolle) entfernt. Maßstabsbalken ist 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert.

Ein Markierungsfreie Technik für die Raum-zeitliche Imaging von Single Cell Sekrete

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K Aufrufe.  Naval Research Laboratory.  Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert. 

Serie: A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Forschung

Biotechnik

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Eine Anleitung zu einem stark geneigten bauen fegte Fliese Mikroskop für erweiterte Sichtfeld der Einzelmolekül-Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...