This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.

1. Vorbereitung der akuten Hippocampus von erwachsenen Ratte Gehirn <ol><li> Betäuben Ratten mit Isofluran. ACHTUNG: Führen Sie das Verfahren unter Verwendung eines geschlossenen Exsikkator, nicht einatmen Isofluran. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt. </li><li> Enthaupten die Ratte, schnell zu isolieren, die das Gehirn, und tauchen es in precarbonated (95% O 2/5% CO 2 Gasgemisch) eiskalt Gey-Lösung (Zusammensetzung in mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O 0,3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucose · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7,32) 30 min 1,2,10,16. </li><li> Entfernen Sie das Kleinhirn und ein Teil des entorhinalen Kortex. Trennen Sie die kortikalen Hemisphären mit einem mittleren sagittalen Schnitt, dann platzieren Sie jede Halbkugel nach unten auf seiner medialen Oberfläche. Danach machenein 50-70 ° Schnitt (50-70 ° quer) entlang der dorsalen Rand jeder Hemisphäre 13,14. </li><li> Kleben jeder Hemisphäre mit dem frisch geschnittenen Fläche, auf der Schneideplattform des Schneidesystems. Die Plattform sollte von precarbogenated eiskalten Gey-Lösung abgedeckt werden. </li><li> Schneiden Sie 350 um 50-70 ° Querschnitten von anterior nach Seite mit einem Vibratom angepasst, um z-Achse Pendeln zu minimieren posterior. Der Hippocampus, entorhinalen Kortex und subicular, sowie die Rinden, die dorsolateralen zum Hippocampus befinden, werden Teil der für Versuche verwendeten Scheiben 13,14 sein. </li><li> Übertragen des Hippocampus zu einer U-Form und Art Inkubator eingetaucht und Inkubation für mindestens 2 h bei 32 ° C mit carbogenated künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, enthaltend in mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glucose · H 2O, 27,4 NaHCO 3, pH 7,3) 1,2,10,16. </li></ol> 2. Positionierung der Elektroden, Baseline-Aufnahme, und die Induktion von LTP <ol><li> Übertragen Sie die Hippocampus-Scheibe zu einem untergetauchten Aufzeichnungskammer unter dem Mikroskop montiert. Perfusion (6-7 ml / min) mit carbogenated ACSF für mindestens 30 min bei 32 ° C aufweist. </li><li> Bereiten Glaskapillare gefüllt mit Mikroelektroden ACSF (Spitze Widerstand ist 3-5 MQ). </li><li> Stellen Sie ein Glas-Mikroelektroden mit ACSF in der CA1-Schaffer Sicherheiten Fasern für die Stimulation und in der CA1 Stratum radiatum für fEPSP Aufnahme 1,2,10 (Abbildung 2) gefüllt. Der Abstand zwischen den Elektroden beträgt ca. 300 um. </li><li> Evoke Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (fEPSPs) durch Stimulation der Schaffer-Sicherheiten Fasern mit zweiphasigen Rechteckstromimpulse (200 ms / Polarität) in einem Bereich von 3-4 V. </li><li> Führen Sie die maximale Stimulationstest durch Messung der InPut-Ausgangs-Beziehung und definieren die Stimulationsstärke als 40% der maximalen erhalten fEPSP-Steigungswerte und halten Sie sie während des Experiments konstant. </li><li> Beginnen Sie mit der Baseline-Aufnahme für mindestens 15 Minuten nach der maximalen Stimulationstest. Messen Sie die Antworten auf Teststimuli jede Minute während des Experiments. Führen Baseline-Aufnahmen mit niedriger Frequenz Stimulation. </li><li> Nehmen Sie die Grundlinie für mindestens 30 min. </li><li> Für Late-LTP Induktion gelten Hochfrequenz 100 Hz Tetanisierung aus drei 1 sec Reiz Züge bei 100 Hz mit einer 5 Minuten-Intervall intertrain. Um das Feld der Stimulation innerhalb CA1-Region 5 uM Bicucullin erhöhen kann in 2 min vor Tetanisierung gewaschen werden und sollte unmittelbar nach der letzten Tetanisierung gewaschen werden. </li></ol> 3. Sammlung von Scheiben nach der Induktion von LTP und Snap-Freezing <ol><li> Stop LTP Aufnahme 2 min oder 30 min nach drei Zügen der tetanischen Stimulation induziert Spät-LTP. </li><li&gt; Entfernen Sie die Elektroden und schnell übertragen die Scheibe auf eine Metallplattform precold auf Trockeneis gelegt. Wiederholen Sie den Vorgang für eine Steuerscheibe in U-förmigen Inkubator gehalten. ACHTUNG: Handschuhe bei der Arbeit mit Trockeneis. </li><li> Sammeln jede Scheibe in einem 1,5-ml-Röhrchen und bei -80 ° C. </li></ol> 4. Isolierung von Kern angereicherten Fraktionen aus der CA1-Region des Hippocampus <ol><li> Nehmen Sie 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit den gefrorenen Scheiben von -80 ° C und halten sie auf dem Eis. </li><li> 0,5 ml frischem kaltem TBS-Puffer, der Protease (PI) und Phosphatase-(PS)-Inhibitoren, in die Röhre. Inkubation für 2-3 min und Transfer zu einem Stereomikroskop. ACHTUNG: Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Kittel bei der Arbeit mit PI und PS. </li><li> Präparieren des Stratum pyramidale CA1-Region des Hippocampus mit Hilfe von zwei Nadeln. Verwenden Sie eine Nadel zum Halten der Scheibe unter dem Stereomikroskop und die zweite Nadel zum Schneiden der CA1-Region. </li><li> Sammeln Sie die seziert CA1-Regionen von 5 Scheiben (für jede Gruppe) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen mit 50 ul Lysepuffer (1x hypotonische Lyse-Puffer, enthaltend in mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7,9, mit PI und PS). Beachten Sie, dass diese Menge an Material ausreicht, um 2-3 Immunoblots laufen. </li><li> Homogenisieren gesammelte Gewebe durch sorgfältige Pipettieren auf und ab. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette. Bebrüten das Lysat auf Eis für 5-7 min, damit sich die Zellen zu schwellen. </li><li> Nehmen Sie 2 ul des Lysates, fallen auf einen Objektträger und visualisieren die Schwellung der Zellen unter einem Hellfeld-Mikroskop. Mit der richtigen Schwellung der Zellen die Zellkerne erscheinen als runde Strukturen intakt. </li><li> Sammeln Sie 20 ul Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen als &quot;Homogenat Fraktion &#39;. Hinzufügen 8 ul der Denaturierung 4x SDS-Probenpuffer. </li><li> Zentrifugieren Sie die verbleibenden Lysate bei 11.000 rpm für 1 min. </li><li> Sorgfältig sammeln Stand von oben (&quot;cytosolische Fraktion), transfer in ein neues Röhrchen und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer. </li><li> Das Pellet in 60 ul hypotonischen Puffer und fügen Sie 20 ul 4x Probenpuffer. Diese Fraktion wird als &quot;Kern angereicherte Fraktion&quot; bezeichnet. </li><li> Homogenisat, zytosolischen und nuklearen angereicherten Fraktionen bei -20 ° C oder -80 ° C für die spätere Immunoblotting gespeichert werden. </li></ol> 5. Semiquantitative Immunoblotting für Synapto-Kernproteine <ol><li> Aufzutauen die Proben und kochen Sie sie für 5 min bei 95 ° C. </li><li> Take 5 ul von jeder Fraktion und bestimmen die Proteinkonzentration von Amidoschwarz Test oder BCA-Test. </li><li> Laden gleiche Menge von Proteinproben aus Homogenat und zytoplasmatische angereicherten Fraktionen auf SDS-PAGE. Proben von Kontrolle und LTP Scheiben sollten auf dem gleichen Gel zum direkten Vergleich gesetzt werden. </li><li> Führen Sie eine Standard-Western-Blot-Verfahren (Nasstransfer wird empfohlen). </li><li> Sonde die Membranen mit ter Antikörper Wahl. Neuron spezifischen enolase2 (NSE2) und Kernmarker - - NeuN und Actin-Antikörper als Ladekontrolle anschließend die gleichen Blots (oder gleichen Proben parallel laufen) kann mit einem zytoplasmatischen Marker untersucht werden. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Effizienz der Induktion von LTP durch Clampfit Software analysiert werden. Die durchschnittlichen Steigung von Baseline-Aufnahmen wurde mit den Pisten nach Tetanisierung mit Zwei-Wege-ANOVA, p gegen &lt;0,05 wurde als signifikant unterschiedlich. Die fEPSP Steigungswerte wurden in Diagrammen als Mittelwert ± SEM dargestellt, </li><li> Zur Quantifizierung der Immunoblots, Scannen entweder die autoradiographische Film und mit einem Licor System analysieren die integrierte Dichte der Proteinbanden durch ImageJ oder Fluoreszenzbanden. Werte der immunreaktiven Banden sollte für die Be-und Löschsteuer normalisiert werden. Zum Vergleich der Steuer-und LTP-Gruppen ein nonparametrical Mann-Whitney-U-Test verwendet werden könnte. </li></ol><table border="0"cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Name der Puffer </td><td> Reagens </td><td> Konzentration (mM) </td><td> Menge </td><td> Kommentare / Beschreibung </td></tr><tr><td> Gey-Lösung (pH-Wert: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7,6 g </td><td> Sterilfiltration </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0,37 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1,5 </td><td> 0,22 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 0,3 </td><td> 0,0739 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2,24 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0,23 </td><td> 0,0313 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0,8 </td><td> 0,2145 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucose · H 2 O </td><td> 5 </td><td> 0,9909 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5,96 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 22 </td><td> 1,85 g </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH-Wert: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6,428 g </td><td> Sterilfiltration </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 0,1865 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0,368 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 1,5 </td><td> 0,370 g </td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,24 </td><td> 0,169 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucose · H 2 O </td><td> 10 </td><td> 1,9817 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO 3 </td><td> 27,4 </td><td> 2,3 g </td><td></td></tr><tr><td> 1x hypotonischen Puffer (pH-Wert: 7,9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0,23 g </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml </td><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 1,5 </td><td> 0,0304 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> 0,07455 g </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Puffer.

<ol>
	<li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression.">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).</li><li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation.">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li><li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA(A)+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters.">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li><li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus.">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caldendrin-Jacob:+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus.">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).</li><li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons.">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li><li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling:+implications+for+neurodegenerative+disorders.">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li><li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+(ERK)+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons.">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li><li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+protein+shuttling:+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling.">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li><li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus.">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li><li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking.">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li><li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons.">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures.">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li><li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve.">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li><li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro.">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li><li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation:+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation.">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die in der oben beschriebenen Protokoll Schritten eine Anleitung, wie die Vorbereitung von jungen Hippocampus akuten oder erwachsenen Ratten in Scheiben geschnitten, induzieren und Rekord LTP, schnell sezieren stimulierten Bereich der Scheibe, und bereiten Kern angereicherte Fraktion für das Studium Aktivität abhängige Proteindynamik. Dieser Ansatz ergibt sich aus Kombination von mehreren verschiedenen Methoden unabhängig voneinander verwendet. Wir optimierten Workflow und eine ausführlich genug für Anfänger, in ...

Synaptischen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) spielen eine entscheidende Rolle bei der synaptischen Plastizität und Zellüberlebenssignalwohingegen die Aktivierung von extrasynaptischen NMDARs können Neurodegeneration und Zelltod auslösen. Diese Veränderungen hängen von streng kontrollierten / reglementierten Tätigkeit abhängige Genexpression und erfordern daher eine ständige Kommunikation zwischen aktivierten Synapsen oder Dendriten und den Zellkern 7. Die MAP-Kinasen ERK1 / 2 Effektoren der synaptischen NMDARs Signalisierung und in NMDAR-Aktivierungs-induzierte Genexpression beteiligt, während Signalisierung über extrasynaptischen NMDAR keine oder eine hemmende Wirkung auf ERK1 / 2 Aktivität 8,11. Es gibt eine Reihe von Proteinen, die Shuttle zwischen dem distalen Dendriten und den Zellkern gezeigt wurden. Viele dieser Proteine ​​enthalten ein Kernlokalisierungssignal und aktiv an Mikrotubuli in einer Dynein und Importin-abhängige Weise in den Zellkern transportiert 6,9. Interestingly, einige dieser Botenstoffe nur Transit an den Kern in Reaktion auf spezifische Stimuli synaptische. Beispielsweise retrograden Transport von cAMP response element binding protein 2 (CREB2) durch chemische LTD aber nicht LTP 12 induziert. Lokalisierten NMDAR-abhängige synaptische Stimulation treibt CREB-regulierten Transkriptions Coaktivator (CRTC1) in den Zellkern, einer Translokation, die in langfristigen hippocampalen Plastizität 4 beteiligt ist. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Protein Bote Jacob transloziert in den Zellkern, nachdem beide, synaptic und extrasynaptischen NMDAR-Aktivierung und regelt CREB abhängigen Gentranskription 5. Die synaptische oder extrasynaptischen Ursprung des Signals in einer posttranslationalen Modifikation von Jacob kodiert. Synaptische Aktivität induziert ERK1 / 2 abhängige Phosphorylierung von Jacob an einem entscheidenden Serin an Position 180 (pJacobS 180), die eine Voraussetzung für die anschließende Translokation in den Zellkern in der Grund Hippocampus Kultur ist. Außerdem habe ichn CA1 Neuronen des Hippocampus akuten pJacobS 180 transloziert in den Zellkern nach Schaffer Sicherheiten LTP aber nicht LTD 1,10. PS-180 Jacob führt zu einer erhöhten Expression von Genen Plastizität und das Gen-Expression zurückführt, die synaptische Funktion. In scharfem Kontrast dazu Jacob, die in den Zellkern transloziert nach extrasynaptischen NMDARs Aktivierung nicht an Ser180 phosphoryliert und kann mit verschiedenen Protein-Komplex in den Zellkern bewirkt in Verbindung gebracht werden &quot;CREB abgeschaltet&quot; und ein Zurückziehen der synaptischen Kontakte 10. Die meisten veröffentlichten Studien über die Kernimport synapto-Kernprotein Messenger in dissoziierten neuronalen Primärkulturen durchgeführt worden. Daher wäre es interessant zu sehen, ob solche Erkenntnisse in physiologisch relevanter Bedingungen mit Hippocampus wiedergegeben werden, wo neuronale Konnektivität und Funktion sind viel besser erhalten. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Beurteilung der LTP-dependent nukleäre Translokation von Protein Boten durch Immunoblotting. Dieses Verfahren ist auch für die Analyse Aktivität abhängige Phosphorylierung von Proteinen in einer rohen Kernfraktion. Insbesondere beinhaltet das aktuelle Protokoll Vorbereitung der akuten CA1 des Hippocampus, Induktion, und die Aufnahme von LTP. Als nächstes wird CA1 Region mikroskopisch seziert, um den angeregten Bereich zu isolieren. Wir kombinierten und modifizierte das Protokoll für die Isolierung durch Atomkern CellLytic Extraction Kit mit Änderungen von Zhao und Kollegen 17 eingeführt wird. Das optimierte Verfahren umfasst die Lyse von seziert CA1 Regionen in hypotonischen Puffer ermöglicht Zellschwellung und die Freisetzung von Kernen. Zell-Lyse und Kerne Morphologie kann durch mikroskopische Untersuchung festgestellt werden. Urananreicherung wird durch einen kurzen Zentrifugationsschritt erzielt. Immunoblotting-Analyse mit Antikörpern gegen NeuN und NSE2, spezifische Marker für nukleare oder cytosolischen Fraktionen zeigt, dass dieser Ansatz als schneller eingesetzt werdenund reproduzierbare Protokoll, diese subzellulären Fraktionen zu isolieren und sehr labil posttranslationale Modifikationen wie Protein-Phosphorylierung zu studieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren für kleine Gewebeproben, die aus sezierten Bereiche CA1 des Hippocampus und kann vorteilhaft in Kombination Immunhistochemie von Schnitten des Hippocampus verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CED 1401 AD/DA converter</td>
			<td>Cambridge Electronics Design, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/data_acquisition_system">Axon Digidata acquisition system</a></td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software</td>
			<td>Axon&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope</td>
			<td>Leica TCS SP2&#65292;Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Standard microelectrode puller</td>
			<td>Sutter&#65292;USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope</a></td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica S4E, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica VT1000S, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated pulse stimulator</td>
			<td>Model2100, A-M systmes, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE system</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>JULABO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field Microscope</td>
			<td>NIKON ECLIPSE TS100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation, HERAEUS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, SM-5, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting chamber and electric power supplier</td>
			<td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Julabo, F12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submerged type Recording Chamber</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-shape and submerged type incubator&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic culture dish&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.3957.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6781.1</td>
			<td>&#8805;99.5%, p.a.,ACS,ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>5886.05</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>12034.025</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;2H2O</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06574.1000</td>
			<td>extra pure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#183;H2O</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.6887.1</td>
			<td>for Molecularbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>Art.-Nr.9105.4</td>
			<td>PUFFERAN, &#8805;99.5%, p.a.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.06329.1000</td>
			<td>pro analysi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor Coctail</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphostop</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicuculline</td>
			<td>Tocris bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Isofluran</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJac-s180</td>
			<td>Biogenes/ purified</td>
			<td></td>
			<td>rabbit (dil. 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>mouse (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSE</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>D20H2</td>
			<td>rabbit (dil. 1:1,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5441</td>
			<td>mouse (dil. 1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - mouse (1:5,000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG HRP Conjugated</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td>goat anti - rabbit (1:5,000)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of ca1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins

Studium Aktivität abhängige Protein-Expression, subzelluläre Translokation oder Phosphorylierung ist unerlässlich, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der synaptischen Plastizität zu verstehen. Langzeit-Potenzierung (LTP) und Langzeit-Depression (LTD) bei akuten Hippocampus induziert werden allgemein als Zellmodelle von Lernen und Gedächtnis akzeptiert. Es gibt zahlreiche Studien, die Live-Cell-Imaging oder Immunhistochemie Ansätze verwenden, um Aktivität abhängige Proteindynamik zu visualisieren. Diese Verfahren stützen sich auf die Eignung der Antikörper für Immunzytochemie oder Überexpression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in einzelnen Neuronen. Immunoblotting von Proteinen ist eine alternative Methode, die unabhängige Bestätigung der Ergebnisse. Die erste limitierende Faktor in der Vorbereitung subzellulärer Fraktionen aus einzelnen tetanized Hippocampus ist die geringe Menge an Material. Zweitens ist die Handhabung Verfahren entscheidend, weil auch sehr kurze und kleinere Manipulationen living Scheiben könnten Aktivierung bestimmter Signalkaskaden auslösen. Hier beschreiben wir einen optimierten Arbeitsablauf, um eine ausreichende Menge von Kern angereicherte Fraktion von ausreichender Reinheit aus der CA1-Region des Hippocampus akuten aus Rattenhirn erhalten. Als ein repräsentatives Beispiel gezeigt, dass die ERK1 / 2 phosphorylierte Form des synapto-Kernprotein Messenger Jacob aktiv transloziert in den Kern nach der Induktion von LTP und kann in einem Kern angereicherte Fraktion von CA1-Neuronen nachgewiesen werden.

Wir haben bereits gezeigt, dass die synapto-Kernprotein Bote Jacob sammelt sich im Zellkern nach der Induktion von LTP aber nicht LTD 1. Darüber hinaus Translokation von Jacob nach synaptischer Stimulation erfordert die Aktivierung der MAPK ERK1 / 2 und Phosphorylierung von Jacob in Ser180 (Abbildung 1). Phosphorylierte Jacob transloziert in den Kern in einer Importin-abhängigen Art und Weise und die phosphorylierten Zustand über längere Zeit durch die Verbindung mit dem Zwischen Filament...

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Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Aufrufe.  Leibniz Institute for Neurobiology.  Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität. 

Serie: Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic cues. Their membranes are often juxtaposed at defined contact sites, which become hubs for the exchange of signaling molecules and membrane components1,2,3,4. The inter-organellar membrane microdomains that are formed between the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria at the opening of the IP3-sensitive Ca2+ channel are known as the mitochondria associated-ER membranes or MAMs4,5,6. The protein/lipid composition and biochemical properties of these membrane contact sites have been extensively studied particularly in relation to their role in regulating intracellular Ca2+ 4,5,6. The ER serves as the primary store of intracellular Ca2+, and in this capacity regulates a myriad of cellular processes downstream of Ca2+ signaling, including post-translational protein folding and protein maturation7. Mitochondria, on the other hand, maintain Ca2+ homeostasis, by buffering cytosolic Ca2+ concentration thereby preventing the initiation of apoptotic pathways downstream of Ca2+ unbalance4,8. The dynamic nature of the MAMs makes them ideal sites to dissect basic cellular mechanisms, including Ca2+ signaling and regulation of mitochondrial Ca2+ concentration, lipid biosynthesis and transport, energy metabolism and cell survival 4,9,10,11,12. Several protocols have been described for the purification of these microdomains from liver tissue and cultured cells13,14. 
	Taking previously published methods into account, we have adapted a protocol for the isolation of mitochondria and MAMs from the adult mouse brain. To this procedure we have added an extra purification step, namely a Triton X100 extraction, which enables the isolation of the glycosphingolipid enriched microdomain (GEM) fraction of the MAMs. These GEM preparations share several protein components with caveolae and lipid rafts, derived from the plasma membrane or other intracellular membranes, and are proposed to function as gathering points for the clustering of receptor proteins and for protein&#x2013;protein interactions4,15.

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

This procedure illustrates how to isolate from the adult mouse brain the mitochondria-associated ER membranes or MAMs and the glycosphingolipid-enriched microdomain fractions from MAMs and mitochondrial preparations.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

Implantation von chronischen Silicon Sonden und Aufzeichnung der Hippocampal Platzzellen in eine angereicherte Laufband-Vorrichtung

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine Studieren