Alle Verfahren wurden von der University of Wisconsin Ausschuss für Animal Care genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit NIH-Richtlinien. Wir danken Dr. Katherine Kalil für die großzügige Verwendung von ihr Nucleofector Gerät. Wir danken auch Mitglieder der Dent Labor für Kommentare zu Protokoll. Diese Arbeit wurde durch Stipendien NIH R01-NS064014, Dana Foundation und Whitehall Stiftung EWD unterstützt Christopher Viesselmann, Jason Ballweg und Derek Lumbard trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

1. Vorbereitung der Deckgläser und Chambers <ol><li> Vorbereitung von sauberen Deckgläschen und Kammern ist wichtig für gesunde Kulturen. Shortcuts sollten nicht auf jeder dieser Schritte unternommen werden. </li><li> Waschen Sie die Deckgläser (12mm oder 22mm rund, deutsche Glas - Carolina Assistant Brand) über Nacht in konzentrierter Salpetersäure (HNO3) in einem speziellen Glas oder Becher. </li><li> Deckgläser abnehmen Salpetersäure und wäscht intensiv (5-7x) in destilliertem Wasser. </li><li> Trennen Sie die Deckgläser und trocken in einer Sterilbank oder Biosicherheitswerkbank. Nach dem Trocknen, Sterilisieren sie mit UV-Licht für 30 Minuten. Ort sterilisiert Deckgläschen in eine sterile Petrischalen für die Lagerung. Wenn plating Neuronen auf 12mm Deckgläser direkt Platz Deckgläser in einer sterilen 35-mm-Schale und fahren Sie mit Abschnitt 2. </li><li> Imaging Kammern sind durch Bohren eines 15mm-Loch in der Unterseite 35mm Petrischalen (entfernen Sie alle Grate) und Anbringen der gereinigten Deckgläser mit einem 3:1-Gemisch aus Paraffin und Vaseline gebaut. </li><li> Melt das Paraffin / Vaseline-Gemisch in einem konischen Rohr in einem siedenden Wasserbad. Mit einem kleinen Pinsel und Beschichtung der Unterseite der Schale um die 15mm Loch. Achten Sie darauf, immer schön rühren das Paraffin / Vaseline-Gemisch, wie es getrennt werden. Dies führt in der Regel Kammern zusammen mit einer höheren Konzentration von Vaseline, die viskosen werden wird, wenn Gerichte in den Inkubator gelegt, was in Deckglas Ablösung geklebt. Die restlichen Paraffin / Vaseline kann bei Raumtemperatur gelagert werden. </li><li> Die Schale nach oben auf eine flache Schale und legen Sie das Deckglas über dem Loch. Hitze in 80 ° C im Ofen, bis Paraffin-Gemisch geschmolzen ist (~ 10 Minuten). Entfernen Sie Speisen auf eine ebene Fläche und lassen Sie die Paraffin-Gemisch eingestellt. </li><li> Schalten Sie das Geschirr über und sterilisieren sowohl die Innenseiten der Deckel und die Böden der Kammern mit UV-Licht. </li><li> Coat Deckgläser oder Glas Regionen Kammern mit 1.0mg/mL Poly-D-Lysin (30-kDa) in Boratpuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,5) für eine Stunde. Spülen Sie 3-5 mal mit reichlich Gewebekultur grade deionisiertem Wasser. Vergewissern Sie sich, um alle Spuren von Borat-Puffer zu entfernen. Trockene und sofort verwenden oder lagern Kammern / Deckgläser für die spätere Verwendung. Wir verwenden normalerweise gereinigt Deckgläser innerhalb von einem Monat der Vorbereitung. </li></ol> 2. Vorbereitung der Neuronale Dissection und Kulturmedium <ol><li> Bereiten Sie die Dissektion (DM) durch Zugabe entsprechender Mengen von 10x HBSS und 100X HEPES auf Gewebekultur-Wasser. Lagerung bei 4 ° C. Keep on ice während der Präparation. </li><li> Am Tag vor der Dissektion Vorbereitung der Beschichtung Medium (PM) und Serum-freiem Medium (SFM). PM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose, 37,5 mM NaCl und 5% fötales Rinderserum (FBS). SFM besteht aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, 2 mM Glutamin, 0,3% Glucose und 37,5 mM NaCl. </li><li> Machen Sie nur so viel für die Zerlegung und Speicherung in einer Gewebekultur-Inkubator über Nacht mit der Kappe leicht geöffnet, so dass die Temperatur und CO 2-Gehalt des Mediums im Gleichgewicht. Wir fügen zusätzliche Glukose und erhöhen die Osmolalität auf rund 310mOsm mit NaCl. Wir finden die Kulturen besser zu einem mehr physiologischen Osmolalität (Neurobasal Osmolalität ist in der Regel 205-245mOsm). </li></ol> 3. Kortikale Glial Feeder-Layer Vorbereitung für Langzeit-Kulturen <ol><li> Wenn langfristig Kulturen hergestellt werden sollen, führen Sie diesen Teil des Protokolls zwei vor drei Wochen vor Fortsetzung der kortikalen oder Hippocampus Dissektionen. </li><li> Bereiten Gliazellen Medium (GM) mit MEM, 0,3% Glucose, Penicillin / Streptomycin und 10% Pferdeserum. </li><li> Euthanize P1-P3 Maus Welpen durch Kühlung auf Eis für 5 Minuten. Nehmen Sie jedes Jungtier aus dem Eis und Spray mit 70% Ethanol. Schnell köpfen mit einer Schere. Entfernen Sie das gesamte Gehirn eine Schüssel mit kaltem DM (Schritt 2,1). </li><li> Entfernen Sie die beiden Gehirnhälften und der Hirnhäute. Excise des Neokortex und zu entfernen, um ein neues Gericht, die keine Medien. Bereiten Kortex von 4 Gehirne insgesamt. </li><li> Mince den Kortex mit einem sauberen, sterilen Rasierklinge so fein wie möglich und entfernen gehackte Gewebe mit einer Kunststoff-Pipette auf eine 50 ml konische Röhrchen mit 12 ml kaltem DM. Add Trypsin und DNase, um Endkonzentrationen von 0,25% (1,5 ml) und 0,1% (1,5 ml) bzw.. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen mit dem kortikalen Gewebe und gründlich reinigen mit 70% Ethanol vor Inbetriebnahme der Gewebekultur Kapuze. Pipet kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einer 10 ml Pipette ca. 10-15 mal, oder bis die meisten Stücke verschwinden. </li><li> Senden Sie das Rohr auf 37 ° C im Wasserbad für weitere 10 Minuten mit intermittierendem Schwenken. </li><li> Reinigen Sie das Rohr mit 70% Ethanol und bringen sie zurück in die Gewebekultur Kapuze. Pipettieren der kortikalen Gewebe nach oben und unten mit einem 5 mL Pipette ca. 10-15 mal, oder bis zum Brocken verschwinden. </li><li> 15 ml warmes GM und Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 10 Minuten. </li><li> Überstand resuspendieren die pelletierten Zellen in 20 ml frisches GM und zählen mit einer Zählkammer. Platte 5-7.5x10 6 Zellen in 15 ml GM pro 75 cm 2-Kolben. </li><li> Nach einem Tag und alle 2-3 aufeinander folgenden Tagen in Kultur, zu vertreiben lose Zellen durch Klopfen der Flasche gegen die Hand. Entfernen Sie das Medium zusammen mit allen verdrängt Zellen und ersetzen mit 15 ml frischem GM. </li><li> Glia kann nach 1-2 Wochen des Wachstums in den Kolben geerntet werden, wenn sie ca. 70-100% konfluent sind. Zur Vorbereitung einzelner Deckgläser mit Glia beschichtet, gereinigt Platz 6 Salpetersäure und sterilisiert 25mm runden Deckgläschen in einer 10 cm Schüssel, und Platz 3 Punkte des 3:1-Gemisch aus Paraffin / Vaseline auf jedes Deckglas in einem dreieckigen Muster mit einem kleinen Pinsel . Gönnen offene Küche mit UV-Licht für 30 Minuten. Bestreichen Sie die Deckgläser mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin (30-kDa) in Borat-Puffer für eine Stunde, dann ausgiebig waschen (3-5x) mit steriler Gewebekultur grade VE-Wasser und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Sie die Glia-haltigen Flasche aus Inkubator, entsorgen Sie die Medium und spülen mit 5 ml vorgewärmten Trypsin / EDTA-Lösung. Entfernen Sie das Trypsin / EDTA-Lösung aus dem Kolben und Pipette 3 ml frisches vorgewärmtes Trypsin / EDTA in die Flasche. Inkubieren Sie die Flasche für 1 Minute bei 37 ° C vor Zugabe von 5 ml GM die Trypsinierung stoppen. </li><li> Entfernen Sie die Glia von Kolben durch wiederholtes Pipettieren 10-15 Mal, und übertragen Sie dann die Medien zu einer 15 mL konischen Rohr. Zentrifuge bei 200xg (1000rpm) für 8 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und 10 ml GM, Zählen von Zellen, und die Platte 5x10 5 Zellen in 12,5 ml GM pro 10cm Schüssel mit dem Deckgläschen. </li><li> Austausch des Mediums mit frischem vorgewärmten GM alle 2-3 Tage. Am Tag vor dem Neuron Dissektion, entfernen Sie die GM und ersetzen mit SFM (Abschnitt 2.2). Mit dieser Gliazellen klimatisierten SFM in Schritt 4.12 Bei Überschwemmungen kortikalen oder Hippocampus Kulturen. </li></ol> 4. Kortikale und / oder Hippocampus Dissection und Elektroporation <ol><li> Entfernen entsprechender Mengen Nukleofektion Lösungen (Lonza), kombinieren und auf Raumtemperatur erwärmt, bevor das Sezieren. Da Nucleofection Lösung hat eine begrenzte Lebensdauer, wenn kombiniert, wir nur kombinieren die benötigte Menge für jedes Präparat (100 ul pro Transfektion). </li><li> Euthanize eine schwangere Maus E15.5 mit CO 2 (Tag der Stecker E0.5) und entfernen die Gebärmutter auf eine 10cm Petrischale. Entfernen Föten und zu enthaupten ins kalte DM (Abschnitt 2.1). </li><li> Entfernen Sie das gesamte Gehirn in eine separate Schüssel kaltes DM und mit einem gebogenen Wolframnadel, entfernen Sie beide neocortices. Entfernen Sie die Hirnhäute mit microforceps und Ort Kortex in neue Schüssel kaltes DM. Mit einer kleinen Blende oder Wecker Schere, entfernen Sie die Rinde oder Hippocampus und in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,0 ml kaltem DM gefüllt. Bewahren Sie diese Röhrchen auf Eis. </li><li> Nach seziert alle Rinden oder hippocampi, fügen Sie 110 ul 2,5% Trypsin, die Eppendorf-Röhrchen mit dem Gewebe und Ort Rohr in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wäscht Kortex oder hippocampi mit 1,0 mL PM (Abschnitt 2.2) durch vorsichtiges Umdrehen des Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, so dass 1 ml PM in die Röhre. </li><li> Man reibt die Stücke 15 Mal mit einem P1000 Pipette, und entfernen Sie überstehende / Zellen zu einem neuen 15 ml konische Röhrchen mit 4 ml PM, so dass keine Klumpen, die bleiben in Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie die 15 ml Tube bei 20xg (350rpm) für 7 Minuten mit der Bremse ausgeschaltet. Überstand verwerfen und 100 ul der vorgemischten, Raumtemperatur Nukleofektion Lösung (Lonza) für jede Transfektion. Man reibt 5 mal mit einem sanften Auf-und Abbewegung des P1000 Pipette. </li><li> Nehmen Sie 100 ul der Nukleofektion Lösung / Zellgemisch auf jede neue Eppendorf-Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Menge an DNA. Für die langfristige Kulturen, die wir verwenden in der Regel 1-2μg DNA pro Transfektion. Dies ist jedoch nur eine kleine Etiketten &lt;10% Anteil der Neuronen in der Kultur. Wir verwenden in der Regel 5-10 ug DNA pro Transfektion, wenn höhere Transfektionseffizienz für kurzfristige Kultur wollen. Wir haben bis zu einem Gesamtbetrag von 40μg DNA verwendet werden, wenn die Transfektion mit zwei verschiedenen Plasmiden. Plasmide sind in TE-Puffer bei 1 g / ul gespeichert. </li><li> Add Zellsuspension / DNA in die Küvette (Lonza) und elektroporieren die Zellen in der Nucleofector (Lonza), mit dem Programm O-005 (Maus ZNS-Neuronen). </li><li> Arbeiten schnell, 500 ul vorgewärmtes und äquilibriert PM in die Küvette und entfernen Lösung / Zellen in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie genug PM, um die Lautstärke der einzelnen Transfektion bis 1,0 mL zu bringen. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und Platte bei 3-5x10 3 Zellen / cm 2 für junge Kulturen, oder 5-10x10 3 Zellen / cm 2 für die langfristige Kulturen. &lt;/ Li&gt; <li> Für kurzfristige Kulturen, Überschwemmung des 35-mm-Kulturschalen mit 2,0 ml erwärmt, CO 2-Gleichgewicht SFM nach einer Stunde Beschichtung. Bei Verwendung von Deckgläsern, wir die Hälfte entfernen des PM und ersetzen sie durch SFM, dann noch zweimal wiederholen. Entweder Überflutung der Imaging-Kammern oder Waschen der Deckgläschen führt zu einer sehr niedrigen Serum-Gehalt (&lt;0,5%). Kurzfristige Kulturen brauchen nicht mit einer glialen Feeder-Schicht kultiviert werden und müssen nicht wieder zugeführt werden. </li><li> Für die langfristige Kulturen, entfernen wir eine Glia gedeckt Deckglas mit drei Punkten aus Paraffin / Vaseline und invertieren sie über das 15mm Loch in die Schale 35mm, 1 Stunde nach der ersten Beschichtung. Zwei Milliliter der konditionierten SFM aus der Glia-Schüssel wird dann auf den Imaging-Kammer aufgenommen. Zur Speisung der langfristigen Kulturen, entfernen wir ein Drittel des SFM alle 2-3 Tage und ersetzen sie durch frische, vorgewärmte und CO 2-Gleichgewicht SFM. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Wohnen Hippocampus-Neuronen in aufeinanderfolgenden Stadien der Entwicklung. Gepaart Bilder von repräsentativen Wohn Hippocampus-Neuronen sind nicht nur als ein Differential-Interferenz-Kontrast Bild und eine entsprechende Fluoreszenzaufnahme gezeigt. Jede dieser Zellen hat mit EGFP-Tubulin und DsRed2 in pCAX Vektoren transfiziert wurden. Stufe 1 (1cm), Stufe 2 (1cm), Stufe 3 (2DIV), Stage 4 (11DIV) und Stufe 5 (32DIV): Die Neuronen wurden in den folgenden Tagen in vitro (DIV) abgebildet. Scale-Bar ist 20 um.

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Dieses Protokoll zur Kultivierung von embryonalen hippokampalen und kortikalen Neuronen der Maus wurde als eine Modifikation der Banker-Protokoll, das Rattenneuronen 1,2 verwendet entwickelt. Wir haben dieses Protokoll zur Kultivierung von Maus und Hamster Neuronen verwendet sowie 3,4,5,6,7. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut für beide Hippocampus und Neokortex Neuronen und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Meberg und Miller 8 veröffentlicht. Generell verwenden wir Hippocampus-Neuronen für die langfristige Kultur, weil sie gut charakterisiert sind und ein etabliertes Modell-System. Darüber hinaus sind sie wahrscheinlich zu einer homogenen Population von Neuronen als Neocortex enthalten. Allerdings kultivierten Neuronen Neokortex mit diesem Protokoll auch überleben und differenzieren ähnlich (unveröffentlichte Daten). Wir verwenden routinemäßig Hippocampus und Neokortex Neuronen für kurzfristige Kultur. Präparation des Neokortex führt auch zu wesentlich mehr Neuronen (1.5x10 6 Neuronen pro Paar Kortex) als Hippocampus Dissektion (2.5x10 5 Neuronen pro Paar hippocampi), das es eine bessere Auswahl des Materials für Western-Blot, zum Beispiel macht. Wie bei allen primären Kultur, ist es wichtig, die Zeit, die vom Tod des Tieres, um die Plattierung der Zellen zu minimieren. Es dauert in der Regel 10-20 Dissektionen zu werden konstant schnell zu Dissektion und Beschichtung. Auch beim Arbeiten mit der Lonza Nucleofector, ist es wichtig, schnell zu arbeiten während der Elektroporation Verfahren, wie die Lebensfähigkeit der Nervenzellen schnell abnimmt, wenn sie in der Nukleofektion Puffer übrig sind. Ein Großteil unserer Bildgebung ist mit einem inneren Reflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) durchgeführt. Diese Art der Mikroskopie ist nur in der Lage Bildgebung mehreren hundert Nanometern über dem Deckglas. Daher werden die Bereiche der Neuronen, die wir häufig image, müssen die axonale Wachstum Kegel und dendritischen Dornen, direkt an das Deckglas eingehalten werden. So verwenden wir low density Kulturen, die Gliazellen Fütterung benötigen für die langfristige Kultur. Wir haben eine höhere Dichte Kulturen eingesetzt (&gt; 2x10 4 Zellen / cm 2), ohne Gliazellen Feeder Schichten, für die langfristige Kulturen und festgestellt, dass sie sehr gut überleben mit wenig füttern. Allerdings sind die dendritischen Dornen dieser Neurone oft zu weit weg vom Substrat zum Bild in TIRFM, obwohl sie leicht mit Weitwinkel-Mikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie nachgewiesen werden. In den meisten unserer Studien haben wir transfizieren Neuronen vor dem Ausplattieren und abgebildet fluoreszenzmarkierten Proteine ​​für bis zu drei Monate in Kultur. Diese langfristige Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen gibt uns die Zuversicht, dass durch niedrige Konzentrationen von DNA (1-2μg) sind wir nicht produzieren Überexpression Artefakte in den Neuronen. Allerdings kann dieses Verfahren auch zur Überexpression von Proteinen untersucht werden, ob große Mengen von DNA verwendet werden (10-20mg) werden. Die Plasmide, die wir verwenden, um Neuronen transfizieren enthalten in der Regel EGFP oder mCherry Fusionsproteine, obwohl wir auch Label das neuronale Zytoplasma mit DsRed2 oder EGFP allein. Diese Elektroporation Technik funktioniert gut mit einer Reihe von Vektoren. Wir bevorzugen Plasmide, die eine β-Aktin-Promotor mit einer CMV-Enhancer und β-Globin enthalten poly-A-Schwanz (pCAGGs oder pCAX Plasmide) 9, aufgrund der relativ hohen Niveau des Ausdrucks, und die Tatsache, dass sie gut von den Neuronen geduldet in kurz-und langfristige Kultur. Im Allgemeinen beginnt Proteine ​​innerhalb von ca. 4 Stunden plating auszudrücken und erreichen Werte ausreichend für die Bildgebung in 10-24h 10. Wir haben erfolgreich CMV-Promotor getriebene Plasmide in kurzfristige Kulturen verwendet, haben aber festgestellt, dass sie ein hohes Maß an Überexpression dazu führen, dass zu töten Nervenzellen in langfristige Kultur. Trotzdem haben wir festgestellt, dass die Gliazellen Konditionierung von low density Kulturen mit dem Überleben von Neuronen mit CMV-Promotor angetrieben Plasmiden transfiziert hilft, im Vergleich zu höheren Dichte (non-Glia-fed) Kulturen.

* Die meisten Reagenzien, dass wir bei -80 ° C auf -20 ° C gelagert werden können als gut. Speichern sie bei -80 ° C verlängert sich ihre Haltbarkeit und die Ergebnisse in etwas mehr konsistente Kulturen.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Hippokampalen und kortikalen Neuronen wurden ausgiebig auf das zentrale Nervensystem (ZNS) neuronalen Polarisation, Axon / Dendriten Auswuchs, und Synapsenbildung und Funktion Studie verwendet. Ein Vorteil der Kultivierung dieser Neuronen ist, dass sie leicht zu polarisieren, bilden markante Axonen und Dendriten, auf einer zweidimensionalen Substrat bei sehr geringen Dichten. Diese Eigenschaft hat sie extrem nützlich für die Bestimmung viele Aspekte der neuronalen Entwicklung. Darüber hinaus, indem sie Gliazellen Klimaanlage für diese Neuronen werden sie weiter zu entwickeln, bilden funktionelle synaptische Verbindungen und Überleben für einige Monate in Kultur. In diesem Protokoll skizzieren wir eine Technik zu sezieren, Kultur und Transfektion von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen. Die Transfektion wird durch Elektroporation von DNA in die Neuronen vor dem Ausplattieren über Nukleofektion erreicht. Dieses Protokoll hat den Vorteil, auszudrücken Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine ​​früh in der Entwicklung (~ 4-8h nach dem Ausplattieren), um die Dynamik und Funktion von Proteinen während der Polarisation, Axon Auswuchs und Verzweigung zu studieren. Wir haben auch entdeckt, dass diese einzelne Transfektion vor dem Ausplattieren Fluoreszenz-markierten Fusionsproteins Ausdruck unterhält auf einem Niveau angemessen für die Bildgebung während der gesamten Lebensdauer des Neurons (&gt; 2 Monate in Kultur). Somit ist diese Methode zur Untersuchung von Protein-Lokalisation und Funktion im gesamten ZNS-Entwicklung mit wenig oder gar keine Störung der neuronalen Funktion.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison. Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zu zerlegen, zu transfizieren via Elektroporation und Kultur Maus Hippocampus und kortikalen Neuronen. Kurzfristige Kulturen können für die Untersuchung der Axon Auswuchs und Beratung verwendet werden, während die langfristigen Kulturen für ein Studium der Synaptogenese und dendritischen Dorn Analyse verwendet werden können.

Serie: Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...