Die Autoren möchten sich Matthew Florence zur Herstellung der Hippocampusschnitt Kulturen danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus US-amerikanischen National Institute on Aging und Alzheimer Association NZG unterstützt.

Ein. Fixierung Fixative sind cancerogen Handschuhe tragen und handhaben die Fixiermittel in einer Abzugshaube. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen auf Eis durchgeführt und alle Lösungen sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Verwenden Elektronenmikroskopie-grade Reagenzien. Tag 1 <ol><li class="jove_content"> Nach experimentellen Bedingungen (zB virale Injektion, medikamentöse Behandlung), legen Sie die Membran mit organotypischen Schnitten des Hippocampus in einem 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale mit eiskaltem 0,1 M Phosphatpuffer (Sorensen Phosphat-Puffer), pH 7,3. Fügen Sie 1 bis 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer direkt auf die Scheiben, um sie kalt. </li></ol> Entscheidender Schritt: Verwenden Sie immer frisch zubereitet Puffer und Fixative. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert des Puffers innerhalb gewünschten Bereich. Ein Scheitern zu tun beschädigen könnten zellulären Strukturen. <ol start="2"><li> Um die CA1 Unterfeld der Scheibe zu isolieren, verwenden Sie einEinmalskalpell sanft über die Scheibe neben der DG, parallel zur CA1 Zellschicht (Abbildung 1) geschnitten. Dann schneiden Sie die restlichen Scheibe vertikal, um die CA3 Unterfeld und die Subiculum entfernen. Schneiden Sie eine Ecke der Scheibe zur Identifizierung der Oberseite des Gewebes. </li></ol> HINWEIS: Falls keine virale Lieferung von Protein von Interesse erforderlich ist, das gesamte Gewebeschnitt fixiert, nachdem die Medien mit einem sanften eiskaltem Puffer spülen entfernt wird. Dieses wird dann durch Ausschneiden der CA1 gefolgt. Entscheidender Schritt: Verfolgen Sie die Oberseite des Gewebes, um für die richtige Schneiden der Gitter später. <ol start="3"><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus der Membran unter Verwendung der Rückseite des Skalpells. Verwenden einer Pasteurpipette zu übertragen, um sanft das Gewebe bis zu einer 12-well Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Entfernen Sie den Puffer in der auch von der Platte und 500 &amp; mu, l - 1 ml eiskaltem Fixiermittel (pH 7,3) wie folgt zusammen: 0,1% Pikrinsäure, 1% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C. </li></ol> HINWEIS: Pikrinsäure kann explosiv sein, wenn sie trocken. Halten Sie es angefeuchtet mit Wasser in einem Behälter dicht geschlossen halten. An einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die Fixiermittel aus dem Brunnen und waschen Proben 3 mal (20 min jeweils) in 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Inkubieren für 40 min in 1% Tanninsäure (w / v) in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH 6,0. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. </li><li> Inkubieren für 40 min in 1% Uranylacetat (w / v) in Maleatpuffer im Dunkeln. Uranylacetat ist lichtempfindlich und ist radioaktiv. Das Becherglas mit Parafilm beim Auflösen und speichern Sie unbenutzte Puffer im Dunkeln bei 4 ° C. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. </li><li> Inkubieren für 20 min in 0,5% Platin Chloride (w / v) in Maleatpuffer. </li><li> Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. Speichern die Proben bei 4 ° C, bis sie zur weiteren Verarbeitung bereit sind. </li></ol> 2. Dehydration und Embedding Propylenoxid ist krebserregend. Vermeiden Dämpfe durch die Arbeit mit ihm in einer Abzugshaube. Verwenden Sie absolute, 100% reinem Ethanol, die keine Spuren von Wasser enthält. Verdünnen Sie dieses absolute Ethanol zu unterschiedlichen Konzentrationen zur Entwässerung herzustellen. Tag 2 <ol><li> Inkubation für 5 min in 50% Ethanol und dann 5 min in 70% Ethanol. </li><li> Inkubieren für 15 min in frisch zubereiteten 1% p-Phenylendiamin (PPD) in 70% Ethanol. </li><li> Spülen dreimal in 70% Ethanol. </li><li> Inkubation für 5 min in 80% Ethanol und dann 5 min in 95% Ethanol. </li><li> Inkubieren in 100% Ethanol zweimal jeweils 5 min. </li><li> Bereiten Glasfläschchen mit Schraubverschluss und stellen Sie sicher, sie sind sauber und komplett trocken. Übertragen Slices Glasfläschchen undbeschriften jedes Fläschchen einfach und klar. </li><li> Inkubation für 5 min in 1:1 Ethanol: Propylenoxid. </li><li> Inkubieren in 100% Propylenoxid zweimal jeweils 5 min. </li><li> Fügen Harz (Epon) zu jedem Fläschchen ein 1:1-Gemisch mit Propylenoxid zu machen. Sanft für 2 Stunden zu mischen. Nicht schütteln die Fläschchen zu rigoros, um Blasen, die mit Einbettung stören könnten. </li><li> Hinzufügen Harz, um ein 3:1-Gemisch mit Propylenoxid, und Mischen für 2 Stunden zu machen. </li><li> Übertragen auf 100% Harz und inkubieren O / N. </li></ol> Tag 3 <ol start="12"><li> Sandwich-Proben zwischen Streifen aus ACLAR Kunststoff und Heilmittel für 24 Stunden bei 60 ° C. </li></ol> 3. Schneiden und Montage auf Grids Tag 4 <ol><li> Geschnitten semidünnen (0,5 um) Abschnitte und Flecken mit 1% Toluidinblau + 1% Borax, um die korrekte Ausrichtung der Proben zu bestimmen. </li><li> Geschnitten Ultradünnschnitten (60 nm) und Halterungen auf Nickel Gitter, ein Abschnitt pro Raster. </li></ol>4. Immunhistochemie Alle Puffer und Wasser sollte vor dem Gebrauch gefiltert werden. Tag 5 <ol><li> Geben Sie einen Tropfen (~ 50 ul) von 1% Tween-20/phosphate Puffer (T / PB), pH 7,5, auf ein Stück sauberer Parafilm auf einer ebenen Fläche. Vorsichtig holen die Gitter mit sauberen Pinzette durch die Kante und schweben auf dem Puffer, Abschnitt unten, und inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Überschüssiges Flüssigkeit aus dem Gitter durch Anordnen Abschnitt nach oben auf auf Filterpapier und anschließend schwimmen auf 50 mM Glycin in T / PB für 15 min bei RT. </li></ol> Entscheidender Schritt: Zur Vermeidung übermäßigen &quot;carry-over&quot; von Lösungen aus einer Lösung Tropfen zum nächsten während der Inkubationen, abtropfen überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Berühren der Kante des Gitters auf # 1 Filterpapier zwischen jeder Lösung ändern. Außerdem entfernen Lösung zwischen den Armen des EM eingefangenen Forceps Halten des Gitters durch sanftes Dochtwirkung mit einem Faserband aus Filterpapier zwischen den Zangenschenkeln während ensuklingeln die Abschnitte nicht vollständig austrocknen. <ol start="3"><li> Trocknen des Gitters mit Filterpapier und anschließend schwimmen auf blockierende Lösung, die 2,5% BSA und 2,5% Serum von dem Tier des sekundären Antikörpers in T / PB 30 min bei RT. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper (in T / PB) bei RT oder O / N bei 4 ° C. Die optimale Zeit und Temperatur der Inkubation sowie Antikörperkonzentration, müssen experimentell bestimmt. </li><li> Waschen Sie das Raster drei Mal (2 min jeweils) mit T / PB. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper (1:20 Anti-Kaninchen oder Anti-Maus gekoppelt bis 10 nm Gold) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB. </li><li> Postfix mit 2% Glutaraldehyd in T / PB für 5 min. </li><li> Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB und dann dreimal (2 min jeweils) mit gefiltertem Wasser. </li><li> Inkubieren mit 2% Uranylacetat in Wasser für 10 min. </li></ol> Während das Gitter Färbung, bereiten Sie einen CO 2-freien Kammer durch placinga Stück Parafilm im Zentrum eines Glases Petrischale. Dann legen 4-6 Pellets von NaOH in der Schale um den Parafilm um CO 2 in der Luft aufnehmen. Halten Sie die oben geschlossen für ein paar Minuten. Verwenden einer Pasteurpipette und schnellen Übertragen eines kleinen Volumens von Bleicitrat Reynold-Lösung des Parafilm im Glas Petrischale. Öffnen Sie die obere gerade genug, um die Pasteurpipette einlegen, um die Wiedereinführung von CO 2 in die Kammer zu minimieren. HINWEIS: Um Reynolds Bleicitrat Lösung zu machen, kochen 100 ml entionisiertem Wasser in einem Mikrowellenherd und lassen in einem luftdichten Behälter kühl. In einem 50-ml-Messkolben mit Stopfen, mix 1,33 g Bleinitrat, 1,76 g Natriumcitrat und 30 ml des abgekochtes Wasser durch kräftiges Schütteln für 1 min. Dann zeitweise schütteln für 30 min. Zu diesem trübe Lösung, 8 ml 1 M Natronlauge und langsam umzukehren den Kolben ein paar mal. Lösung klar geworden. Wird die Lösung auf 50 ml mit der gekochten water. Bewahren Sie die Lösung dicht geschlossen halten. Wenn Niederschlag erscheint, zu verwerfen und einen neuen ein. <ol start="11"><li> In drei kleineren Bechern vorzubereiten warm, frisch gekochtes deionisiertem Wasser. Waschen Sie die Uranylacetat durch Eintauchen des Rasters im ersten Becherglas und sanft wirbeln sie herum für 30 sek. Wiederholen Sie diesen Schritt in den beiden anderen Becher. </li><li> Öffnen Sie die Spitze des Glases Petrischale gerade genug, um das Gitter auf der Tropfen Bleicitrat Reynold-Lösung stellen. Falls möglich, tragen eine Maske während diese Weise, um die Atmung zu Bleicitrat vermeiden und um die Bildung von Niederschlag zu verhindern. Inkubieren für 10 min. </li><li> Öffnen Sie die obere gerade genug, um das Gitter zu entfernen. Einatmen der Bleicitrat. Waschen Sie die Grid dreimal durch Eintauchen sequentiell in drei Bechern mit warmen, frisch gekochtes destilliertes Wasser. Lassen Sie das Gitter trocken auf einem Stück Filterpapier, Abschnitt up. Die Probe ist nun bereit für das Elektronenmikroskop. </li></ol>

<ol>
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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. 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E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll haben wir die Phend und Weinberg Methode für Gehirn und Rückenmark Gewebe dendritischen Dornen in Ratten Hippocampusschnitt Kulturen zu studieren angenommen. Dendritischen Dornen in der hippocampalen CA3-CA1-Region sind empfindliche Strukturen, die eine Vielzahl von Proteinen, die eine wichtige Rolle spielen bei der Regulierung der neuronalen Funktionen. Das vorgestellte Verfahren stellt eine ausgewogene Ansatz zur Erzielung verbesserter Antigenizität unter Beibehaltung guter ultrastrukturelle Kon...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

Immunelektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um biologische Moleküle auf subzellulärer Ebene zu studieren. Antikörper gekoppelt elektronendichten Marker wie kolloidales Gold offenbaren kann die Lokalisation und Verteilung von spezifischen Antigenen in verschiedenen Geweben ein. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken sind pre-embedding und Post-embedding Techniken. In vor-Einbettung Immunogold-Elektronenmikroskopie (EM)-Techniken, muss das Gewebe permeabilisiert zu Antikörper Eindringen zu ermöglichen, bevor er eingebettet werden. Diese Techniken sind ideal zum Konservieren Strukturen aber schlechte Penetration des Antikörpers (oft nur die ersten paar Mikrometer) ist ein erheblicher Nachteil, 2. Die post-Einbettung Kennzeichnung Methoden können dieses Problem vermeiden, weil Kennzeichnung erfolgt auf Abschnitten von festen Geweben, in denen Antigene leichter zugänglich sind. Im Laufe der Jahre wurden eine Reihe von Änderungen, die post-Einbettung verbessert Immunreaktivität zu verbessern und Ultrastruktur bewahren <sup&gt; 3-5. Gewebefixierung ist ein entscheidender Teil des EM-Studien. Fixative chemisch vernetzen die Makromoleküle, die Gewebestrukturen einrastet. Die Wahl der Fixateur wirkt nicht nur strukturelle Erhaltung, sondern auch Antigenität und Kontrast. Osmiumtetroxid (OsO 4), Formaldehyd, Glutaraldehyd und wurden die Standard-Fixiermittel für Jahrzehnte, einschließlich des zentralen Nervensystems (CNS) Gewebe, die besonders anfällig für strukturelle Beschädigungen bei chemischen und physikalischen Verarbeitung sind. Leider ist OsO 4 hochreaktiv und wurde gezeigt, dass maskieren Antigene 6, was zu einer schlechten und unzureichende Etikettierung. Alternative Ansätze zur chemischen Fixierung vermeiden sind Einfrieren der Gewebe. Aber diese Techniken sind schwierig durchzuführen und erfordern teure Instrumente. Um einige dieser Probleme anzugehen und ZNS-Gewebe Kennzeichnung, Phend et al verbessern. ersetzt OsO 4 mit Uranylacetat (UA) und Tannin acid (TA), und erfolgreich zusätzliche Modifikationen eingeführt, um die Empfindlichkeit der Antigennachweis und strukturelle Erhaltung im Gehirn und Rückenmark Geweben 7 zu verbessern. Wir haben dieses Osmium-free post-Einbettung Methode Rattenhirngewebe angenommen und optimiert die Immunogoldmarkierung Technik zu erkennen und zu studieren synaptischen Proteinen. Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die ultrastrukturellen Lokalisation der synaptischen Proteinen in Ratten hippocampalen CA1 Pyramidenzellen bestimmen. Wir verwenden organotypischen hippocampalen kultivierten Scheiben schneiden. Diese Scheiben halten die trisynaptic Schaltung des Hippocampus, und sind daher besonders nützlich zur Untersuchung synaptischer Plastizität, ein Mechanismus weithin angenommen, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen. Organotypischen hippocampalen Schnitten aus postnatalen Tag 5 und 6 Maus / Rattenjungen können wie zuvor beschrieben 8 werden und sind besonders nützlich, um akut Knockdown oder überexprimieren exogenen Proteinen. Wir haben dieses Protokoll ch verwendetaracterize Neurogranin (Ng), einem Neuronen-spezifischen Proteins mit einem kritische Rolle bei der Regulierung der synaptischen Funktion 8,9. Darüber hinaus haben wir es verwendet, um die Lokalisierung von ultrastrukturelle Calmodulin (CaM) und Ca 2 + / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) 10 charakterisieren. Wie in den Ergebnissen dargestellt, ermöglicht dieses Protokoll gute ultrastrukturelle Erhaltung der dendritischen Dornen und effiziente Kennzeichnung von Ng zu helfen charakterisieren ihre Verteilung in der Wirbelsäule 8. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren eine breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung viele andere Proteine ​​in neuronalen Funktionen beteiligt sind.

2B zeigt ein Beispiel der Verteilung des endogenen Ng Moleküle in dendritischen Dornen von hippocampalen CA1 pyramidalen Neuronen. Nickelgittern mit ultradünnen (60 nm) enthält Geweben CA1-Region des Hippocampus (wie in 2A zu sehen) wurden in 1% abgedeckt T / PB, 50 mM Glycin, dann mit 2,5% BSA und 2,5% Serum vor der Inkubation mit Anti blockiert Ng-Antikörpers. Nach dem Waschen mit T / PB, wurden Netze dann in anti-Kaninchen sekundären Antikörper gekoppelt an 10 nm Gold bedeckt. ...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und Antigene im ZNS zu studieren zu bewahren und zu charakterisieren synaptischen Proteinen in Ratten-Hippocampus-CA1 pyramidalen Neuronen.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K Aufrufe.  Medical College of Wisconsin. Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das v...

Serie: Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine in Hippocampusschnitt Kulturen