Die mikroskopische Bildgebung wurde über die Dienste der Michigan State University Center for Advanced Microscopy durchgeführt. Mais Kallus wurde von der Mais Zentrum für Transformation der Iowa State University erworben. Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey R. Weather der MSU Plant Research Laboratory für seine technische Unterstützung bei der Kohlenhydratanalyse danken. Diese Forschung wurde großzügig von der Mais-Marketing-Programm von Michigan (CMPM) und die Arbeitsgemeinschaft für Forschung Pflanzenbiotechnologie (CPBR) finanziert.

1. Vorbereitung der dsRNAi Konstrukte Wird für die Herunterregulierung von ZmCCR1 <ol><li> Design-Gen-spezifischen Primer einschließlich der erforderlichen Restriktionsenzym für die Herstellung einer dsRNAi Konstrukt zur Knock-out die ZmCCR1 Gen. Zwei Primer-Sets wurden entwickelt, um zwei Segmente Fragment ZmCCR1 cDNA verstärken:. Ein 523 bp-Fragment von Nukleotid 748 bis 1271 und ein 285 bp-Fragment von Nukleotid 986-1271 ZmCCR1 Die cDNA wurde von der Arizona Genome Institute (AGI) zur Verfügung gestellt. Weitere Details sind in Fig. 1 beschrieben. </li><li> Verstärken des großen Fragments durch Polymerasekettenreaktion (PCR) aus der ZmCCR1 cDNA-Matrize unter Verwendung der Primer ZmCCR1_748F_BglII (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) und ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;). Verstärken das kleinere Fragment (285 bp) unter Verwendung der Primer ZmCCR1_986F_BglII (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) und einen ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> Individuell ligieren die Fragmente in pGEM-T Easy folgenden Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Mini-Prep Plasmid-DNA-Isolierung aus einzelnen Trans, die jeweils das pGEM-T-Konstrukte mit einem handelsüblichen Mini-Prep Plasmid-Kit. </li><li> Digest sowohl das pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) und ImpactVector (IV) -1,1 (Zytoplasma Expressionsvektor) sowohl mit BglII und NcoI. </li><li> Ligieren die große Faul Gel gereinigt ZmCCR1 Fragment (523 bp) in den verdaut Gel gereinigt IV-1.1. </li><li> Verdauen die pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) und IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) sowohl mit BglII und SacI, um die kleine Fragment in den IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) einfügen. </li><li> Ligieren das kleine Faul Gel gereinigt ZmCCR1 Fragment (285 bp) in das verdaut Gel gereinigt IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp). </li><li> Klonen sowohl 523 bp und 285 bp Fragmentierungts in IV-1.1, um die ZmCCR1 RNAi-Konstrukt, das ein 285 bp invertierten Wiederholungssequenz mit einem 238 bp Abstandshalter in der Mitte der invertierten Repeat-Fragmente (siehe Fig. 1) hat. </li><li> Übertragen Sie dieses Konstrukts in Escherichia coli (E. coli), wachsen sie und führen Sie eine Midi-Prep-Größe Plasmid-DNA-Isolierung, genügend Plasmid-DNA für Mais genetische Transformation erhalten. </li></ol> 2. Mais, Genetische Transformation <ol><li> Herstellung von Wolfram-Teilchen <ol><li> Platz 60 mg Wolframkügelchen (M10) in einem 1,5-ml-Röhrchen vereinigt und mit 1 ml 70% Ethanol für 2 Minuten gevortext. Inkubation für 10 min bei 23 ° C, dann bei 18.894 xg zentrifugieren für 2 min und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen 3x mit 1 ml 100% Ethanol, Zentrifugieren für 2 min und Überstand verwerfen. 1 ml steriles 50% Glycerin, um die Mikropartikel-Konzentration auf 60 mg / ml zu bringen. </li></ol></li><li> Herstellung von DNA für die Bombardierung <ol><li> Place die 50 ul (3 mg) von Wolfram-Perlen in 50% Glycerin in ein 1,5-ml-Röhrchen vorbereitet. Werden 5 ul (1 ug) der IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi-Plasmid-DNA, 50 &amp;mgr; l 2,5 M CaCl 2 und 20 &amp;mgr; l 0,1 M Spermidin. Wirbel kurz zwischen jeder Zugabe der obigen Reagenzien. </li><li> Vortex die Wolfram-Wulst-DNA-Gemisch kurz und Zentrifuge bei 18.894 g für 30 Sekunden. Abgießen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 140 ul 70% Ethanol. Entfernen Sie die Flüssigkeit und entsorgen. Add 140 &amp;mgr; l 100% Ethanol. Entfernen Sie die Flüssigkeit und entsorgen. </li><li> Add 48 &amp;mgr; l 100% Ethanol. Verwenden oder lagern Sie sofort auf Eis für bis zu 4 Stunden vor der Bombardierung. </li></ol></li><li> Beschuss <ol><li> Legen Sie eine 3-5 cm Durchmesser Hallo-II embryo Mais Kalli (von Mais Transformation Center of Iowa State University zur Verfügung gestellt) in der Mitte des 100 mm Petrischalen mit 32 N6OSM Medien (wie osmotium) mindestens vier Stunden vor dem Bombardement. </li><li> Prepare die PSD-1000/He Partikelliefer Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers 33. </li><li> Sterilisieren Kammerwand mit 70% Ethanol. Legen Sie sterile 650 psi Berstscheibe in sterile Haltekappe. Verbreiten Sie 5-6 ul der M10-DNA-Lösung auf die Oberfläche eines Macrocarriers, kurz antrocknen. Last Macrocarrier und Stoppen Bildschirm in Mikroeinführung Montage. </li><li> Zeigen Mikroeinführung Montage und Mais Kalli in Kammer in einem gewählten Abstand von dem Stop-Bildschirm (L2 = 6 cm) und Tür schließen. Beschleunigen in einem Vakuum von 27 psi gegen einen Drahtgitter. </li><li> Drücken Sie die Feuer-Taste, bis Berstscheibe platzt und Helium-Druckmesser auf Null fällt. Lassen Sie den Feuerknopf. </li><li> Inkubieren bombardiert Kalli in eine Petrischale mit N6OSM (osmotischem Medium) 32 für 16 Stunden im Dunkeln bei 27 ° C. Brechen Sie die Kalli in etwa zehn Stücke und Transfer zum N6E (Kallus) 32 in Petrischalen und Inkubation für 5 Tage in Dunkeln bei 27 ° C. </li></ol></li><li> Auswahl <ol><li> Nach 5 Tagen auf N6E, übertragen Sie die Kalli auf N6S Medium (Auswahl Medien) 32. Subculture alle Kalli auf Selektionsmedium alle 30 Tage für 8-12 Wochen ohne die Kalli-Struktur zu stören. </li><li> Nach etwa 8-10 Wochen wird weiß schnell wachsenden Sektoren aus dem nicht-proliferativen und teilweise nekrotischen Mutter Kalli wachsen. Verbrauchsteuern die weißen schnell wachsenden Geweben und Subkultur ihnen an die frische Selektionsmedium (N6S) 32 und weiter wie oben inkubiert. </li></ol></li><li> Regeneration <ol><li> Übertragen Sie die weißen und schnell wachsenden embryonalen Kalli auf Regenerationsmedium und Inkubation 32 wie oben für 1 Woche. Schalten Sie die regenerierende embryogene Kalli auf einen Zeitraum von 16 Stunden Tageslicht und 8 Stunden Dunkelheit bei 25 bis 27 ° C </li><li> Übertragen Sie die Regenerations schießt auf das Wurzelmedium 32 in einem Reagenzglas nach 3-4 Wochen, weiter wie oben inkubiert. Nach umfangreichen rRoot Entwicklung erscheint, waschen Wurzeln vorsichtig unter Wasserhahn, dann verpflanzen die Pflänzchen zu 4 &quot;Töpfe mit Erde. Decken Sie die Töpfe mit Plastiktüten feucht zu halten. Nach 2 Tagen machen kleine Löcher die Kunststoffbeutel. Nach 5-6 Tagen entfernen Sie die Plastiktaschen. Fahren Sie wie oben für weitere 5-6 Tage inkubiert. </li></ol></li><li> Gewächshaus <ol><li> Übertragen Sie die Jungpflanzen in 18 &quot;Töpfe mit Erde und halten in voller Sommersonne oder im Gewächshaus Licht. Die ersten regenerierten Pflanzen werden als T 0, während die ersten Samen gehören zu den T 1-Generation. </li></ol></li></ol> 3. Histologische Assay <ol><li><ol><li> Beheben die Maisblatt Mitte Rippen in 5 ml 10% igem neutral gepuffertem Formalin. </li><li> Prozess-und Vakuum infiltrieren mit Paraffin auf einer Gewebeprozessor mit einem Gewebe-Prozessor. </li><li> Betten Sie das Gewebe in Paraffin mit einem Histocentre III Einbettung Station. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Paraffin von den Rändern einmal blocks gekühlt. </li><li> Abschnitt Probe bei 4-5 &amp;mgr; m mit einem Mikrotom mit einem Mikrotom. </li><li> Zeigen Abschnitte auf Objektträgern und trocken in einer 56 ° C-Inkubator für 2-24 Std. Stellen Sie sicher, Abschnitte sind komplett auf den Objektträger geklebt. </li><li> Entparaffinieren Abschnitte in zwei Änderungen Xylol für 5 min bei 23 ° C. </li><li> Hydrat gleitet durch zwei Änderungen von 100% igem Ethanol für 2 min und zwei Wechsel von 95% Ethanol für 2 Minuten bei 23 ° C. </li><li> Spülen Sie die Abschnitte in fließendem Leitungswasser für 2 min. </li><li> Färben mit 0,05% Toluidinblau O für 1-2 min und rasch mit ddH 2 O. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf den Proben mit Immersionsöl und Visualisierung mit Lichtmikroskopie. </li></ol></li><li> Rasterelektronenmikroskopie (SEM) <ol><li> Beheben die geschnittene Maisblatt Mitte Rippen in 4% Glutaraldehyd und 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) bei 4 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Die Proben in dem Puffer kurz abspülen, dehydratisiert sie in eineEthanolreihe (25%, 50%, 75% und 95%) für 10-15 Minuten bei jeder Abstufung und 100% Ethanol für 10 min, 3x. </li><li> Trocknen der entwässerten geschnittene Maisblatt Mitte Rippen in einem kritischen Punkt Trockner unter Verwendung von flüssigem Kohlendioxid als Übergangsfluid. </li><li> Montieren Sie die getrockneten Proben auf Aluminium Stubs mit Hochvakuum-Kohlenstoff Registerkarten </li><li> Bestreichen Sie die Maisblatt Mitte der Rippen auf Aluminium-Stubs in einem Sputter-Coater mit Argongas gespült montiert mit Gold (ca. 20 nm Dicke). </li><li> Untersuchen Sie die beschichteten Proben in einem JEOL JSM-6400V (Lanthanhexaborid Elektronenemitter) Rasterelektronenmikroskop. </li><li> Digitale Bilder wurden mit einer Analyse Pro-Software (Version 3.2) abgebildet. </li></ol></li></ol> 4. Klason Lignin Mess <ol><li> Mühle die Proben durch ein 2-mm-Sieb. </li><li> Verwenden Sie ein Feuchtemessgerät, um den Feuchtigkeitsgehalt jeder Probe zu bestimmen und notieren Sie den Wert. </li><li> Abwiegen ~ 1,5 g jeder Probe und notieren Sie die Masse. Extract die Proben unter Verwendung von Wasser für die erste Extraktion, für die zweite Extraktion unter Verwendung entweder eines automatischen Lösemittelextraktion (3 Zyklen pro Extraktion ~ 14 min pro Zyklus) oder Soxhlet-Apparat (8 hr pro Extraktion) gefolgt von Ethanol. (Anmerkung: Dieser Schritt entfernt Extraktstoffe, die bei der sauren Hydrolyse kondensieren und beeinträchtigen die genaue Messung von Lignin, die Erhöhung der scheinbaren Klason Lignin.) </li><li> Trocknen Sie die extrahierten Proben bei 45 ° C über Nacht, dann ist es ihnen ermöglichen, im Exsikkator abkühlen und wieder wiegen. </li><li> Einen Brutschrank auf 30 ° C Messen Sie 0,3 g jeder trockenen, extrahierten Probe in Schraubverschluss-Hochdruckrohre (dreifach pro Probe wird empfohlen) und notieren Sie die Gewichte auf 0,1 mg. 3 ml 72% H 2 SO 4 zu jeder Druckrohr. </li><li> Mischen Sie die Probe mit einem Glas-oder Teflon-Rührstab. Lassen Sie den Rührstab in der Röhre, bis Wasser nach Inkubation aufgenommen. </li><li> Zeigen Fläschchen in einem Inkubator set auf 30 º C und 150 Upm für 60 min. Nach 1 Stunde hinzuzufügen 84 ml entionisiertem Wasser, um die Säurekonzentration auf 4% verdünnt und mit dem Rührstab gemischt. Seien Sie vorsichtig, nicht zu große Probenmengen an den Seiten der Flasche über der Wasserlinie zu verlassen. </li><li> Dicht verschließen Sie die Verschlüsse an allen Fläschchen und legen Sie sie in eine Metallstange oder große Becher. Autoklaven bei 121 ° C unter Verwendung eines flüssigen Sterilisationszyklus für 1 Stunde. Lassen Sie sie auf Raumtemperatur vor dem Öffnen kühlen. </li><li> Pre-ash die Filtertiegel in einem Ofen bei 575 ° C für mindestens 4 Stunden. Lassen Tiegel einen Exsikkator für mindestens eine Stunde abkühlen in. </li><li> Vakuumfilter die Lösung von jedem Röhrchen durch einen separaten Tiegel mit Hilfe einer Gummiadapter, um den Tiegel zu sichern. Verwenden VE-Wasser, um alle verbleibenden Partikel aus dem Rohr spülen. </li><li> Trocknen des Lignins Rückstand bei 105 ° C für mindestens 4 Stunden. Das Gewicht der trockenen und Tiegel und Rückstand. </li><li> Bei Verwendung eines 575 ° C, vorgeFeuer die Proben über einen Bunsenbrenner, bis es keinen Rauch oder Asche und legen Sie dann in den Ofen für 24 Stunden, oder wenn mit einem programmierbaren Ofen, nicht vor, Asche und verwenden Sie das folgende Programm: </li><li> Rampe von Raumtemperatur bis 105 ° C und Halten für 12 min. </li><li> Rampe bis 250 ° C bei 10 ° C / min und halten für 30 min. </li><li> Rampe bis 575 ° C bei 20 ° C / min und halten Sie für mindestens 180 min. </li><li> Entfernen Sie die Tiegel aus dem Ofen und kühlen in einem Exsikkator. Abwiegen und Asche. </li><li> Berechnen der Säure unlöslicher Rückstand unter Verwendung der folgenden Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> PRE M = Masse der Pre-extrahierte Biomasse POST M = Masse der Post-extrahierte Biomasse M = Masse der PHIOLE extrahierte Biomasse in das Fläschchen gegeben M = Masse der RESIDUE Tiegel und Rückstand Ligninue ASH M = Masse der Tiegel und Asche MC = Feuchtigkeitsgehalt des vorextrahierten Biomasse, Gesamtgewichtsbasis 5. Analyse von Kohlenhydraten <ol><li> Führen Zellwandkohlenhydratanalysen auf der Basis der Foster et al. (2010) Protokoll 31. Kurz gesagt, Vorbereiten Alkohol unlösliche Rückstand aus gefriergetrockneten Pflanzenmaterial. Dann hydrolysieren das Material mit Trifluoressigsäure und entsprechen den gelösten Monosaccharidderivate zu ihren entsprechenden Alditolacetate. Analysieren diese flüchtigen Derivate durch Gaschromatographie (GC) zu einem Vierfach-Massenspektrometer verbunden. </li></ol>

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	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Zugänglichkeit mikrobieller Cellulasen Zellwandpolysacchariden Anlage ist weitgehend abhängig von dem Grad, in dem sie mit phenolischen Polymeren 23 verbunden. Die Umwandlungsrate aus Lignocellulose vergärbaren Zucker ist negativ mit Lignin-Gehalt in der Pflanzenzellwänden abgelagert secondadry korreliert. Dieser Zusammenhang wird auf die physikalischen Eigenschaften von Lignin, wie Hydrophobizität 24. chemischen Heterogenität zugeschrieben, und das Fehlen von regelmäßigen hydrolysierba...

Die Produktion von Biokraftstoffen aus Lignocellulose-Biomasse ist aufgrund seiner Fülle gegenwärtig in den USA ein sehr wünschenswert, und im Fall der nachhaltigen Ernte von land-und forstwirtschaftlichen Rest, die Fähigkeit, nicht direkt konkurrieren um Ackerflächen für Lebensmittel-und Futtermittelproduktion verwendet. Doch im Gegensatz zu Mais Getreide, das die Hauptquelle der derzeit in den USA erzeugt Biokraftstoff ist, sind Lignocellulose-Materialien deutlich komplexer und schwieriger zu brechen. Zusätzlich zu dem langkettigen Kohlenhydrate, Cellulose und Hemicellulose, die während der Fermentation von Lignocellulose-Materialien sind die Hauptquellen für Zucker sind, viele Arten von Pflanzenzellwänden Lignin enthalten, ein Polymer, das Phenylpropanoid Stärke, Abwehr gegen Pathogenbefall bietet, und Hydrophobie an der Wand der Zelle. Während für das Pflanzenwachstum und Überleben notwendig, Lignin stellt auch ein ernsthaftes Hindernis für die erfolgreiche enzymatische Umwandlung von Cellulose und hemicelluverlieren, um lösliche Zucker. Materialien mit hoher Lignin Inhalte sind in der Regel weniger wünschenswert Materialien sowohl für die Biokraftstoff (durch biologische Umwandlung Wege) und der Zellstoff-und Papierindustrie aufgrund der negativen Auswirkungen auf die Verarbeitungseigenschaften und Produktqualität. Daher könnte die genetische Manipulation von Pflanzenmaterialien für Lignin Reduzierung auf einem Niveau, das nicht mit Pflanzen strukturelle Stärke und Verteidigungssysteme nicht beeinträchtigt wichtig für die Senkung der Produktionskosten sowohl für die Lignocellulose Biokraftstoff und der Zellstoff-und Papier-Industrie werden. In Mais (Zea mays), Lignin kovalent vernetzt, um in der primären Zellwand und über ferulate Diferulat Brücken 2 Hemicellulose. Das Lignin-Hemicellulose Komplex bindet an Cellulosemikrofibrillen über Wasserstoffbrücken bilden eine komplexe Matrix, die Integrität und Stärke verleiht dem sekundären Zellwand. Die mechanische Festigkeit von Pflanzenzellwänden wird weitgehend durch die Art bestimmt lignin Untereinheiten 3-5. In früheren Studien, Veränderung der Anteile von Lignin-Untereinheiten hat keinen klaren Trend auf enzymatische Verdaulichkeit 6-11 gezeigt. Allerdings Senkungen in Ligningehalt zeigen in der Regel eine Verbesserung der Conversions 12,13 und kann ein Schlüssel zur Steigerung der Verdaulichkeit von Pflanzenmaterial durch hydrolytische Enzyme, einschließlich Endocellulasen, Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen 14 sein. Gentechnik, um die Expression von Transkripten zu regulieren wurde ausgiebig geübt, um Pflanzenmerkmale zu verbessern. Erweiterte Techniken, einschließlich Anti-Sense-15 und Co-Suppression 16 Technologien, ermöglichen eine effektive Down-Regulation von Zielgenen. Komplette Gen Knock-Out wurde auch mit Gen-Konstrukte Intron-RNA gespleißt Codierung mit einer Haarnadelstruktur 17 erreicht. Weiterhin ist ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik, dh ein leistungsfähiges und effektives Gen-Expression Mediator, die entweder gezielt Transkript Abbau oder Übersetzung Repression funktioniert, stellt ein starkes Mittel, um eine breite Palette von Unterdrückung Auswirkungen auf die Ziel-mRNA 18 induzieren. Gen-Silencing-Techniken zeigen mehrere Einschränkungen. Diese Techniken nicht genau regeln die Ebene der Transkription und es kann zu unerwarteten Silencing Auswirkungen auf andere homologe Gene verursachen. In diesem Verfahren beschäftigten wir Partikelbeschuss zu tragen dsRNAi die Konstrukte in das Maisgenom. Bis heute eine Vielzahl von Pflanzenarten wurden erfolgreich mit Partikelbeschuss, Agrobacterium vermittelte Transformation, Elektroporation und Mikroinjektion Verfahren transformiert. In Mais genetische Transformation ist die particle bombardment Methode gegenüber allen anderen Methoden vorteilhaft, weil es die effizienteste. Partikelbeschuss ist nicht abhängig von Bakterien, so daß das Verfahren frei von biologischen Einschränkungen wie der Größe des Gens oder Gen-Artenigin oder die Pflanze Genotyp. Die physikalische Transgen Abgabesystem ermöglicht hochmolekularen DNA und mehreren Genen in Pflanzengenomen und in bestimmten Fällen in Chloroplasten mit hoher Transformationseffizienz 19 eingeführt werden. Das Lignin Verringerung des Gefäßsystems der Blattmittelrippe über Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dargestellt werden, die nützlich für die Untersuchung der Topographie und der Zusammensetzung der Proben ist. In Maispflanzen, zwei der Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1: X98083 und ZmCCR2: Y15069)-Gene wurden in das Maisgenom 20 gefunden. Cinnamoyl-CoA-Reduktase katalysiert die Umwandlung der Hydroxycinnamoyl-CoA-Ester in Cinnamyl Aldehyden. Wir wählten die ZmCCR1 Gens herunterregulieren, weil dieses Enzym das Gen in allen Geweben exprimiert verholzenden. Die 523 Nukleotide am 3&#39;-Terminus des Gens wurden ZmCCR1 für eine dsRNAi Konstrukt gewählt, weil die Sequenzen zu sein schienvielfältiger als im Vergleich zu denen von ZmCCR2. So würde das Konstrukt genau dsRNAi nur ZmCCR1 binden, Vermeidung von Off-Target-Silencing-21. Ein ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde in der zytoplasmatischen Expressionssystems ImpactVector1.1-Tag konstruiert (IV 1,1), enthaltend das grüne Gewebe spezifischen Promotor, Ribulose-1 ,5-bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase (RuBisCO). Um die Auswirkungen der dsRNAi bauen auf transgene Pflanzen zu untersuchen, wurde das Lignin-Gehalt quantifiziert. Die Klason (säureunlösliche) Lignin Messung ist bekannt, genauer im Vergleich zu der sauren Detergens-Lignin Quantifizierungsverfahren, die ein Teil des Lignins 22 zu lösen. Daher wurde die Klason Lignin in transgenen Maisstengel gemessen. Dieses Verfahren besteht aus zwei Schritten, die saure Hydrolyse in lösliche polymere Kohlenhydrate Monosaccharide 23 umwandelt. Das hydrolysierte Biomasse wurde dann in Säure löslichen und unlöslichen Materialien fraktioniertALS und die Säure unlösliche Lignin wurde nach früheren Studien 23,24 gemessen. Idealerweise sollte Lignin Analyse Extraktionen mit Wasser und Ethanol vor der Hydrolyse, um lösliche Materialien, die mit dem Ergebnis stören können, und eine post-Hydrolyse Verbrennung des Lignin-Rest, für jede in dem Rückstand enthalten Asche ausmachen. Ohne diese Maßnahmen konnte die Lignin-Gehalt der Probe künstlich aufgebläht werden. Der vollständige Verfahren wird hier dargestellt, aber für unsere Versuche waren wir nicht in der Lage, diese beiden Schritte aufgrund der geringen Materialvolumens zum Testen durch Zwei weitere Zellwandbestandteile, Cellulose und Hemicellulose wurden auch in der Lignin herunterreguliert transgenen Maislinien analysiert. Es wurde berichtet, dass transgene Pflanzen, die entweder in ihrer Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) 25, 4-Coumarat herunterreguliert sind: CoA-Ligase (4CL) 26, ein oder Zimtalkohollcohol-Dehydrogenase (CAD) 27 zeigen einen Anstieg in anderen Zellwandstrukturkomponenten. Als ersten Schritt in unseren Studien wurde kristalline Cellulose nach dem Verfahren Updegraff 28 gemessen. Diese Methode wurde ursprünglich zur Bestimmung von Cellulose in einer großen Anzahl von cellulolytischen Bakterien und Pilze entwickelt. Kurz gesagt, wurden die gemahlenen Mais Aktien mit Updegraff Reagenz (: Salpetersäure: Essigsäure Wasser) behandelt, um Hemicellulose, Lignin und xylosans entfernen. Die kristalline Cellulose wurde vollständig durch Zugabe von H 2 SO 4 in Glucose über Saeman hydrolysiert. Die kristalline Cellulose wurde dann unter Verwendung der farbmetrischen Verfahren Anthron 29 untersucht. Um zu überprüfen, ob die Hemicellulose Inhalt geändert wurden, wurden die Extrakte aus Monosaccharid gemahlen Stiele mit Trifluoressigsäure hydrolysiert, derivatisiert mit dem Alditolacetat Verfahren und durch Gaschromatographie (GC) 30 analysiert dann. Die detaillierten Verfahren für kristalline celCellulose und den Matrixzusammensetzung Polysaccharide Analysen sind in Foster et al. (2010) 31. Hier beschreiben wir die für Lignin verwendeten Verfahren Herunterregulierung in Mais über eine RNAi-Technologie, Partikelbeschuss Transformation und Lignin-Analyse für beschleunigte Dekonstruktion von Mais Lignocellulose in vergärbaren Zucker für Biokraftstoffe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Um die Verwendung von Lignocellulose-Biomasse als Alternative Bioenergie Ressource, bei der biologischen Umsetzungsprozesse zu erleichtern, ist eine Vorbehandlung erforderlich Schritt zu öffnen, die Struktur der Pflanzenzellwand, die Erhöhung der Zugänglichkeit der Zellwand Kohlenhydraten. Lignin, ein Polyphenol Material in vielen Zelltypen vorhanden Wand, ist bekannt, dass eine erhebliche Behinderung der Zugang Enzym sein. Reduzierung der Ligningehalt auf ein Niveau, das nicht mit der strukturellen Integrität und Verteidigungssystem der Anlage nicht stört könnte ein wertvoller Schritt, um die Kosten der Bioethanolproduktion zu reduzieren. In dieser Studie haben wir genetisch herunterreguliert einem der Lignin-Biosynthese-Genen, Cinnamoyl-CoA-Reduktase (ZmCCR1) über ein Doppelstrang-RNA-Interferenztechnik. Die ZmCCR1_RNAi Konstrukt wurde mit der Partikelbeschuss Verfahren in die Maisgenom integriert. Transgene Maispflanzen wuchsen in der Regel im Vergleich zu den Kontrollpflanzen Wildtyp ohne interfering mit Biomasse Wachstum oder Abwehrmechanismen, mit Ausnahme der Anzeige der Braunfärbung in transgenen Pflanzen Blattmittelrippen, Hülsen, und Stängel. Die mikroskopische Analysen in Verbindung mit der histologischen Test ergab, dass die Blatt Sklerenchymfasern wurden verdünnt, aber die Struktur und Größe der anderen Hauptgefäßsystemkomponenten nicht verändert wurde. Der Ligningehalt in der transgenen Mais wurde von 7-8,7% verringert wurde das kristalline Cellulosegehalt in Reaktion auf Lignin Reduktion erhöht und Hemicellulosen unverändert. Die Analysen können zeigen, dass der Kohlenstofffluss kann von Lignin-Biosynthese Cellulose-Biosynthese verschoben wurden. Dieser Artikel umreißt die zur Herunterregulierung der Ligningehalt in Mais via RNAi-Technik Verfahren und die Zellwandzusammensetzungsanalyse verwendet, um die Wirkung der Modifikationen auf der Zellwandstruktur zu überprüfen.

Wir haben eine Verringerung der Ligningehalt in Maispflanzen durch RNAi gezeigt. Die Partikelbeschuss-Transformationsverfahren ergab rund 30% trnasformation Effizienz. Die Gen-Silencing von ZmCCR1 wurde konsequent in T0-T2 Generationen beobachtet. Die Lignin reduziert transgenics wuchs ähnlich wie Wildtyp-Mais-Pflanzen, außer für die Anzeige von Braunfärbung in der Blattmittelrippe, Schale und Schaft. Die histologischen Test hat gezeigt, dass die Mutantenlinien zeigen eine signifikante Reduktion der Zellwan...

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Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik wird eingesetzt, um nach unten zu regulieren den Mais Cinnamoyl Coenzym A-Reduktase (ZmCCR1)-Gen zu niedrigeren Pflanzen Ligningehalt. Lignin Down-Regulation aus der Zellwand wird durch mikroskopische Analysen visualisiert und durch die Klason Verfahren quantifiziert. Änderungen der Zusammensetzung in kristalliner Cellulose und Hemicellulose werden analysiert.

Lignin Herunterregulierung<em&gt; Zea mays</em&gt; Über dsRNAi und Klason Lignin Analyse

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K Aufrufe.  University of Arizona.  Ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik wird eingesetzt, um nach unten zu regulieren den Mais Cinnamoyl Coenzym A-Reduktase (ZmCCR1)-Gen zu niedrigeren Pflanzen Ligningehalt. Lignin Down-Regulation aus der Zellwand wird durch mikroskopische Analysen visualisiert und durch die Klason Verfahren quantifiziert. Änderungen der Zusammensetzung in kristalliner Cellulose und Hemicellulose werden analysiert. 

Serie: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Contrast Ultrasound gezielte Behandlung von Gliomen in Mäusen über Drug-Bearing Nanopartikel Liefer-und mikrovaskuläre Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Forschung

Biotechnik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Studieren weicher Materie und biologischer Systeme über eine Breite Länge-Skala von Nanometer- und Mikrometer Größen im Kleinwinkel Neutronendiffraktometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...