In lignozellulosehaltiger Biomasse wird die Aktivität von Enzymen, die Polysaccharide analysieren, durch das Vorhandensein unspezifischer Wechselwirkungen mit Lignin eingeschränkt. Die FRET-Analyse ist ein relevanter Ansatz für die Evolution im Nanomaßstab. Die Beschaffung aller Abschnitte danach kann je nach Biomasse eine Herausforderung darstellen.
Nehmen Sie sich Zeit, das Schneiden mit dem Mikrotom zu tun und führen Sie sanfte Waschungen durch. Die Sortierung von fluoreszierenden Lebensdauer- und Spektrummessungen ermöglicht eine quantitative empfindliche und eindeutige FRET-Bestimmung zwischen Lignin- und TAG-Molekülen in situ. Diese Methode verwendet die Verwendung von kniffligen Techniken, wie Beispielschnitte zur Erfassung und Analyse der mehrdimensionalen Mikroskopie, die mit einer visuellen Demonstration leicht zu erlernen sind.
Um Pflanzenproben aus Holz, Weizen, Fasern oder Fragmenten zu zu bereiten, verwenden Sie Rasierklingen, um einen Zentimeter lange Proben zu schneiden, ohne die Struktur des Materials zu beschädigen, und stellen Sie die Proben unter Vakuum, um Luft zu entfernen. Untertauchen Sie die Proben für 24 Stunden in aufeinanderfolgenden 30% und 50%Konzentrationen von PEG in Wasser bei Raumtemperatur mit sanftem Rühren verdünnt. Gefolgt von 24 Stunden in einer 100%-Konzentration von PEG bei 70 Grad Celsius untergetaucht.
Nach dem 100%PEG-Eintauchen die Proben in Kapseln auf eine 70 Grad Celsius-Kochplatte legen und die Plattentemperatur schrittweise in fünf Grad Celsius-Schritten verringern, bis die Platte Raumtemperatur erreicht. Wenn die Proben abgekühlt sind, verwenden Sie ein Mikrotom und Einwegklingen, um sorgfältig flache 30 bis 60 Mikrometer dicke Abschnitte aus jedem PEG-Block zu erhalten. Entfernen Sie den PEG mit drei fünfminütigen sanften Wasserwass aus den Abschnitten.
Nach der letzten Wäsche bis zu drei Abschnitte pro Röhre mit 500 Mikroliter frisch zubereiteter Leuchtstoffsonde 72 Stunden lang lichtgeschützt inkubieren. Am Ende der Färbeininkubation, verwenden Sie eine Bürste, um die Abschnitte auf eine Folie zu übertragen, bevor Sie die Abschnitte zwischen einem Glasschlitten und einer Zahl 1.5H Abdeckung Schlupf montieren. Um die Spektralfensterbreite des sFLIM-Detektors zu bestimmen, legen Sie Harnstoffkristalle in eine Kulturbox mit einem 0,17 Mikrometer-Glasboden und legen Sie die Box auf einen Mikroskopprobenhalter.
Wählen Sie das 20X Objektiv und einen Titan dotierten Saphirlaser mit einer Wellenlänge von 900 Nanometern und einer Leistung von 2%, und schalten Sie das Scannen ein. Um sFLIM-Messungen durchzuführen, schalten Sie das System in den sFLIM-Modus. Um das zweite harmonische Signal auf dem sFLIM-Detektor zu erfassen, passen Sie die Laseranregungswellenlänge schrittweise von 900 bis 980 Nanometern an, bis das zweite harmonische Signal im zweiten Spektralkanal gesammelt wird.
Bestimmen Sie dann die Länge des Spektralfensters. Wechseln Sie in den nicht-D-gescannten Modus, um fluoreszierende Photonen an den sFLIM-Detektor zu senden. Legen Sie die sFLIM-Erfassung auf den Aktivierungsmodus fest, damit die Photonenzählung auf dem einzelnen Photonenzähler möglich ist.
Wenn das Instrument bereit ist, legen Sie einen steuerbaren nativen Weizenstroh-Pflanzenabschnitt allein zwischen dem Schlitten und dem Deckelschlupf auf der Mikroskopbühne und stellen Sie das System in den kontinuierlichen Modus, um den Laserscan zu ermöglichen. Legen Sie eine 30-Sekunden-Zeitsammlung fest, und überprüfen Sie, ob der konstante Bruchdiskriminator zwischen einem Mal 10 bis dem vierten und ein mal 10 bis dem sechsten liegt. Wählen Sie dann den Messbereich in der Probe aus und klicken Sie auf Start.
Speichern Sie am Ende der Messung die Sdt-Datei und wiederholen Sie die Messung für mindestens neun weitere Proben. Es muss ein Gleichgewicht gefunden werden zwischen der Erreichung ausreichender gesammelter Photonen für das Photon und der Vermeidung von Pulsaufkauf und fotoinduzierten Effekten, die die Blütezeit verändern können. Top analysieren Sie die erfassten sFLIM-Daten, importieren Sie die nativen Weizenstroh-Datendateien allein in die Einzelne Photonenzähler-Software und öffnen Sie Option und Modus, um Unvollständige Multi exponential 12,5 Nanosekunden auszuwählen.
Wählen Sie unter Optionen und Einstellungen die Option Instrumentadien automatisch berechnen aus, und wählen Sie das Modell zur exponentiellen Anpassung aus. Wenden Sie für jeden Kanal das Anpassungsmodell an, und speichern Sie die Anpassungsparameter in einer Kalkulationstabelle. Für einen Vergleich zwischen den Kanälen und Experimenten berechnen Sie die Hauptfluoreszenzlebensdauer in einer Kalkulationstabelle.
Um die mittlere Lebensdauer von mindestens 10 Proben in allen Kanälen zu berechnen, analysieren Sie die Hauptfluoreszenzlebensdauer auf den Spenderkanälen, um den dedizierten Kanalwert zu bestimmen, der die höchste Photonenzahl wählte und der ligurenmaximalen Emission entspricht. Um die sFLIM- und EFRET-Werte zwischen der kontrollierbaren Weizenstrohprobe und einer experimentellen Probe zu vergleichen, sollten Sie eine positive EFRET berücksichtigen, die mit einer homogenen Lebensdauerabnahme zwischen der Kontrolle und den zu analysierenden Versuchsproben als FRET-Ereignis verbunden ist. In diesem repräsentativen Experiment zeigen sFLIM-Kurven einige der Änderungen, die zwischen der Referenzstichprobe und den beiden Interaktionsfällen erreicht werden können.
Tatsächlich ist die Fluoreszenzzunahme in Spektralregionen, die dem Rhodamine-Emissionsbereich entsprechen, leicht zu visualisieren. Sorgfältige Beobachtung der drei ersten Kanal Photonen Zerfall Kurven, zeigt auch eine stärkere Beugung für einheimische Weizenstroh mit Dextrin mit Rhodamine markiert, als für nativen Weizenstroh mit PEG mit Rhodamine markiert. Nach dem Anpassen der Photonenzerfallskurven und der Berechnung der Hauptfluoreszenzlebensdauer jedes Kanals wird die FRET-Signatur deutlicher.
Während beispielsweise die Fluoreszenz-Lebensdauer alternativ entlang des Fluoreszenzspektrums für die einheimische Weizenstrohprobe zunimmt und abnimmt, wird eine klare FRET-Signatur sowohl für einheimische Weizenstrohabschnitte beobachtet, die mit PEG mit Rhodamine und nativem Weizenstroh mit Dextrin-Tags mit Rhodamine-Proben begliedert sind. Im Rahmen der lignozellulosehaltigen Biomassehydrolyse kann diese Methode leicht auf Enzyminteraktionsstudien in verschiedenen Biomasseproben übertragen werden, die eine rigorose Charakterisierung jeder neuen Biomasse erfordern. Da sFLIM keine Fixierung der Probe erfordert, ebnet es den Weg für dynamische Enzym-Lignin-Interaktionsstudien und ist wahrscheinlich, enzymtechnische Strategien und Biomasse-Vorbehandlungen zu leiten.
Wie die meiste Zeit erfordern Lebensdauermessungen den Einsatz von Puls-Infrarot-Laserquellen. Die entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen müssen entsprechend getroffen werden.
