The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.

1. Hochdurchsatz-Bestimmung von Glucose und Xylose Renditen nach enzymatischer Verzuckerung 9,29 <ol><li> Probenvorbereitung (Schleifen, De-starching, Gewinnung, Vorbehandlung) <ol><li> Schleifen mindestens 300 mg jeder Biomasse Probe unter Verwendung einer Wiley-Mühle, so daß die Teilchen durch ein 20 mesh passieren (850 um) Bildschirm. Transfer zum antistatischen zip-Top-Taschen (typischerweise Strichcode) und Plattenprobeninformationen zum Barcode-Datenbank. </li><li> In etwa 250 mg oder mehr des Grund Biomasse aus antistatischen Beutel mit einem nummerierten (mit Bleistift, verwenden Sie keine Tinte oder Marker) Teebeutel vorsichtig rollen die Teebeutel, dass auf jeden Fall die Enden über die Biomasse zu falten, um zu verhindern, Verlust während de-starching und Extraktion. </li><li> Wickeln Sie den Teebeutel geschlossen mit verzinnten Kupferdraht. Nehmen Sie den Teebeutel Nummer für jede Probe mit Strichcode. </li><li> Vorbereitung de-Stärkeenzymlösung aus kommerziellen Enzyme (typischerweise 0,25% (v / v) Glucoamylase (~ 1.600 AGU / l) und1,5% (v / v) alpha-Amylase (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0)). Bereiten Sie 16 ml pro g des Groß Biomasse oder 500 ml pro 120 Teebeutel-Proben. Anmerkung: Die Beladungen entfernen kann Stärke aus irdische Biomasse sollte empirisch durch Testen der Stärke nach der Verdauung mit einer Reihe von Enzymbeladungen und Verhältnisse bestimmt werden. </li><li> In einem Kunststoffbehälter, fügen Sie 16 ml de-Stärkeenzymlösung pro 1 g des Großirdischen Biomasse. Für eine Charge de-Appretur Protokoll hinzufügen 120 Teebeutel auf 500 ml der Puffer-Enzymlösung. </li><li> Inkubieren in einem Schüttler bei 55 ° C für 24 (± 4) Stunden, bei 120 UpM auf mögliche Stärke zu entfernen. </li><li> Nach der de-Stärke Inkubation spülen Sie und genießen die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, um Puffersalze, die Stöße (Bildung von Gasblasen in der Lösung, die in einer plötzlichen und heftigen Anstieg des Niveaus der Lösung führen kann, was zu heißen flüssigen Ethanol, um Kaskaden verursachen können, zu entfernenaus dem Reaktionsgefäß) während der Extraktion. </li><li> Nach der Vollständigkeit Spülen der de-gestärkten Biomasse, legen Sie die Teebeutel in die Soxhlet-Säule für die Extraktion. Kein Kausche ist für diesen Schritt erforderlich. </li><li> Einrichten der Soxhlet Reflux, mit 95% Ethanol und extrahieren Sie die Proben für 24 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Teebeutel aus der Soxhlet-Reaktor und verteilt in einer einzigen Schicht auf einem flachen Fach. </li><li> Man lässt die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug trocknen. </li><li> Rollen Sie die Teebeutel und gibt die getrocknete Biomasse zur Original barcodierte antistatischen Beuteln. Hinweis: Die Anti-Statik-Taschen sind effizienter bei der Reduzierung statischer Elektrizität in der Biomasse, die Verbesserung der Fahreigenschaften. Wenn andere Speicheroptionen verwendet werden, können zusätzliche Biomasse aufgrund der Biomassefesthalten an der Seite des Vorratsbehälters erforderlich sein. </li><li> Übertragen mindestens 50 mg der getrockneten Biomasse mit einem Barcode versehene Trichter (unter Verwendung von mehr Material ist besser für eine genaue Abgabe). Skann Barcodes von den antistatischen Beuteln und dem Aufnahmetrichter, um genaue Probenverfolgung zu gewährleisten. </li><li> Last Trichtern auf Feststoffe mit einem Gewicht von Roboter, aufmerksam auf die Reihenfolge der Proben in den Racks. Laden Sie genug Reaktorplatten, alle Proben enthalten und wählen Sie das Ausgabeprotokoll auf der Basis der Anzahl der Platten verwendet. </li><li> Roboter wiegen 5 mg der getrockneten Proben (± 0,3 mg) in säurebeständigen Edelstahl-Platten mit 96 Vertiefungen. Abwiegen 3 Wiederholungen jeder Probe auf der Platte verteilt auf jede lokalisierte Variationen zu minimieren. </li><li> Fügen 8 Steuer Biomasse Proben eines gut charakterisierten Biomasse Standard-Material, um die Assayleistung zu verfolgen. Für mehrere Platten, wird die Verwendung von mehreren Standard Biomasse Trichtern Teilchengröße Drift durch Sieben in den Trichtern über wiederholte Abgabezyklen zu minimieren. Anmerkung: In jeder Platte, sollte 24 Proben mit 3 Wiederholungen, 4 Rohlinge bestehend aus deionisiertem Wasser und Enzym und 8 contro seinls, mit der zuvor gekennzeichnet Standard Biomasse. Die 3 Ecke Vertiefungen von jeder der 4 Ecken der Platte sind für die Zuckerstandards vorbehalten. </li><li> Überprüfen blank und Zucker Standard Brunnen für fehlerhafte Biomassepartikel und falls vorhanden entfernen. </li><li> Fügen Sie 250 ul entionisiertem Wasser in jedes Loch, und verschließen Sie die Platten mit Silikon-selbstklebenden Polytetrafluorethylen (PTFE) Band. </li><li> Unter Verwendung eines 1/8 &quot;Lötkolbenspitze, durchbohren die PTFE-Band an jedem Dampfanschluss (117 gesamt) für jede Platte. Verwenden Sie eine leere Platte auf versiegelten Reaktorplatte als Führung gestapelt und zu beschränken, PTFE-Filmbewegung. </li><li> Klemmen Sie die Platten fest mit 0,031 &quot;dicken glasfaserverstärktem PTFE-Dichtungen (mit Löchern für Dampföffnungen vorgestanzt) zwischen den Platten und leere Teller auf Ober- und Unterseite des Stapels. Vorbehandlung der Proben mit einem Dampfreaktor auf 180 ° C für 17,5 min, oder eine andere Temperatur / Zeit-Kombinationen, basierend auf gewünschten Härte eingestellt. </li><li> Kühlen Reaktorplatten bis 50 °; C durch Hochwasser mit VE-Wasser. </li></ol></li><li> Enzymatischen Verzuckerung <ol><li> Vorbereitung einer enzymatischen Verzuckerung Lösung, bestehend aus 8% (v / v) Enzym-Lösung in 1,0 M Natriumcitrat, pH 5.0. Bereiten Sie 5 ml pro Reaktorplatte. Hinweis: Die Verdünnung erforderlich sollte basierend auf Aktivität und Proteingehalt der spezifischen Aktienenzymlösung bestimmt werden. </li><li> Wenn die Platten sind cool, zentrifugieren sie in einem Schwingbecher-Rotor bei 1.500 × g für 20 min. Entfernen Siegelfolie. Hinweis: Diese Platten sind schwer und die Zentrifuge Spezifikationen sollten auf Verträglichkeit überprüft werden. </li><li> In 40 ul der 8% Enzymstammlösung in jede Vertiefung (70 mg Enzym pro g Biomasse). </li><li> Verschließen Sie mit neuen PTFE-Band. Zeigen versiegelt Platte in Magnetplattenklemme. </li><li> Vorsichtig mischen die Proben durch Inversion (mindestens 15-fach), und Inkubieren bei 50 ° C für 70 Std. </li><li> Wenn die Verzuckerung zu dem Schluss gekommen, mischen durch Umdrehen und zentrifugieren Sie die Platten bei 1.500 xg für 20 min. </li></ol></li><li> Zucker Assay <ol><li> Einen Satz von 6 Glucose und Xylose kombinierten Kalibrierungsstandards in 0,014 M Citrat-Puffer (pH 5,0) von 0 bis 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 und 0,75 mg / ml empfohlen) und 0 bis 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 und 0,6 mg / ml empfohlen) für Glucose und Xylose sind. </li><li> Bereiten Sie die Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) und Xylose-Dehydrogenase (XDH) Reagenzien gemäß den Anweisungen im Kit. </li><li> Mit einer Pipette zu entfernen 200 ul Flüssigkeit aus den 4 Ecken Brunnen und Rand Brunnen neben der Ecke Kavitäten (12 insgesamt Wells) der Reaktorplatte. </li><li> Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrol Flachboden-Verdünnungsplatte. Kein Wasser auf die 12 Zucker Standard und Ecke Brunnen nicht hinzufügen (entfernen Sie diese Tipps, wenn unter Verwendung eines 96-Kanal-Kopf). </li><li> Verwendung eines Pipette jeweils 180 ul GOPOD in jede Vertiefung der Glucose-Assay plaß. </li><li> Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul XDH Reagenz in jede Vertiefung der Xylose Assayplatte. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots Hydrolysat aus dem 96-Loch-Reaktorplatte auf der Verdünnungsplatte. Pipette aus dem oberen Teil der Vertiefungen zur Biomasse-Feststoffe und Restflüssigkeit in der Ecke Vertiefungen zu vermeiden. Mischen durch Verreiben für mindestens 10 Zyklen. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 110 ul von Zucker-Standards, in zweifacher Ausfertigung an die Ecke Vertiefungen der Verdünnungsplatte. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots von der Verdünnungsplatte auf die Glucose und Xylose Assayplatten. Mischen Sie durch Verreiben. </li><li> Inkubieren Glucose und Xylose Assay-Platten bei Raumtemperatur für 30 min. Keine Oberflächenblasen vorsichtig brechen vor dem Lesen. Ein kurz über die Oberfläche der Platte vergangen Heißluftpistole funktioniert gut. </li><li> Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 510 nm und zeichnen Sie die Absorption gegen einen Reagenzienleer.Diese Messung überwacht die Bildung von Chinonimin, die proportional zur Glucosekonzentration ist. Die Glucosekonzentration wird aus der Eichkurve basierend auf den Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet. </li><li> Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 340 nm und zeichnen Sie die Absorption. Diese Messung überwacht die Reduktion von NAD + zu NADH, die proportional zur Xylose-Konzentration. Die Xylose-Konzentration von der Kalibrierungskurve auf Grundlage der Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet. </li></ol></li></ol> 2. Hochdurchsatz-Bestimmung von Gesamt Lignin und Lignin Monomere Inhalt Mit pyMBMS 28 <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Schleifen und extrahieren Sie die Biomasse unter Verwendung der in den Schritten 1.1.1 und 1.1.6-1.1.8 beschriebenen Methoden. Dazu gehören Mahlen und Extrahieren eines Satzes von Standards als experimentelle Kontrollen zu verwenden. Hinweis: Die pyMBMS measurements nicht Teilchengröße abhängig, so dass, wenn nur mit dem pyMBMS Protokoll sollte Biomasse Herstellung durchgeführt, um damit die Probe in den Probenhalter 4 mm passen, &lt;werden. </li><li> Mit einem kleinen Spatel Abgabe etwa 4 mg (3 bis 5 mg bevorzugt) der aufbereiteten Biomasse in eine 80 &amp; mgr; Edelstahl-Tasse für den Autosampler entwickelt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass mindestens 10% der Proben, die analysiert werden Kontrollstandards, wie sie aus dem Nationalen Institut für Standards und Technologie zur Verfügung (Bagasse-8491; Pappel-8492; Pinien 8493 oder Weizenstroh-8494). Der Standard kann auch jede Spezies analog zu den zu analysierenden Proben, die bereits mit Standardmethoden charakterisiert haben. </li><li> Die Proben in den Autosampler Becher mit einer Pinzette, um Verzerrungen zu vermeiden zufällig laden wegen möglicher Spektrometer Drift über die Zeit. Hinweis: Ein typisches Randomisierung der Proben würde die Messung aller Proben ein, gefolgt von einer Re-Randomisierung umfassender Reihenfolge der Proben, eine Zweitmessung. Randomisierung Programme sind online verfügbar. </li><li> Mit einem Standard-Loch manuell Glasfilterscheiben zu produzieren von A / D-Glasfaser-Platten, ohne Bindemittel. Halten Sie die runde Glasfaserfilter mit einer Pinzette, zentrieren sie über den Probenbecher, und drücken Sie in die Probe mit einem 3,5 mm Innensechskantschlüssel, um das Material in jeder Tasse während des Experiments zu beschränken. </li></ol></li><li> Instrumental-Protokoll <ol><li> Kalibrieren des Massenspektrometers mit einem bekannten Standard, der Peakintensitäten über den gesamten Bereich von Verbindungen, die für die experimentellen Proben bestehen kann, hat. Für typische Biomasseproben verwenden Perfluortributylamin (PFTBA). </li><li> Gesetzt den Heliumträgergasflussrate von 0,9 L / min mit einem Gasdurchflussmesser. </li><li> Die Auto- sampler Ofen auf eine Pyrolysetemperatur von 500 ° C und die Grenzflächentemperatur auf 350 ° C unter Verwendung der Autosampler Software. Hinweis: Ein 1/8 &quot;aus Edelstahl erwärmtÜbertragungsleitung in Wärmeband, das die Auto-Sampler zum Massenspektrometer verbindet wickelt wird unter Verwendung einer Wärmeregler bei 250 ° C geregelt. </li><li> Beginnen Sie die Datenerfassung auf dem Massenspektrometer und warten Sie mindestens 60 Sekunden, um ausreichend Daten für die Hintergrundspektren Sammlung zu erhalten. </li><li> Starten Sie den automatischen Autosampler-Methode mit den Spezifikationen von 2.2.2. Hinweis: Der Autosampler fällt jede Probe einzeln in den Autosampler Ofen. Die gesamte Datenerfassungszeit beträgt etwa 1,5 min; jedoch Pyrolyse eines typischen 4-mg-Probe nach 30 Sekunden abgeschlossen. </li><li> Nehmen Gesamtionengehalt (TIC) von jeder Probe mit Massenspektrometer-Software mit 0,5 sec Abtastrate. Nehmen Intensitäten zwischen m / z 30 bis 450. Hinweis: Typische Biomasse Verbindungen verwenden weiche Ionisierung bei 17 eV. Das Instrument kann größeren Abständen von m / z 1 bis 1000 aufzunehmen; jedoch wird Abtastrate von Computerrechenleistung begrenzt werden. </li><li> Entfernen Hintergrund aus den Spektren mit der maFeature Jahres zu verbessern in der Software. Anmerkung: Eine 60 abzutastenden Teil der Grundlinie zu Beginn der Datenerfassung verwendet, um eine durchschnittliche Hintergrundwert zu berechnen. Diese durchschnittliche Hintergrundspektren aus dem experimentellen Probenspektren automatisch im Massenspektrometer-Software entfernt. </li><li> Importieren Sie die einzelnen Spalte Textdatei, die durch den Massenspektrometer-Software, die die spektralen Daten für jede Probe in ein Datenbankprogramm und vereinen alle Proben in einer Datenbank. In geltendem Metadaten in die Tabellenkalkulation. Importieren Sie die formatierte Daten (Tabellenkalkulationsdatei / CSV) in eine Statistik-Software-Paket und bedeuten Normalisierung der Spektren für die Variation in den pyrolysierten Probe Massen zu berücksichtigen. </li><li> Verwenden Sie eine Statistik-Software-Paket, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Hilfe der spektralen Daten zur Gruppierung der replizierten Standardproben in den Messungen verwendet analysieren zuführen sowie zu beurteilen, welche Spitzen integral für die Einstufung chemischer sindVerbindungen in den Ladungsplot 28. Anmerkung: PCA-Gruppen der Proben auf der Basis der Ähnlichkeit ihrer Spektren, und ermöglicht eine Überprüfung der Normen auf experimentelle Fehler aufgrund von Instrumentendrift während des Laufs zu messen. </li><li> Um das Lignin Syringyl (S) / Guaiacyl (G-Verhältnis) zu berechnen, summieren die Bereiche der S Peaks (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 und 210) und dividiert durch die Summe von g Peaks bei 124, 137, 138, 150, 164 und 178. </li><li> Um die Gesamt Ligningehalt zu berechnen, summiere die Lignin Peaks mit m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 und 210. </li><li> Berechnen eines Korrekturfaktors für die Skalierung des pyMBMS Messung einer Standardmethode zur Schätzung der Gesamt Lignin, wie Klason Lignin. Teilen Sie die Klason Lignin Wert der einzelnen Standard durch die Gesamt Ligningehalt für die Standardprobe mit pyMBMS gemessen. </li><li> Wenden Sie diesen Korrekturfaktor für alle Gleich Arten im Datensatz. Wiederholen für jede Art von Biomasse analysiert. NAnmerkung: Der Korrekturfaktor kann wesentlich von der S / G der Biomasse analysiert variieren. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+prediction+of+Acacia+and+eucalypt+lignin+syringyl/guaiacyl+content+using+FT-Raman+spectroscopy+and+partial+least+squares+modeling.">High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling.</a> Bioenerg. Res. in press, (2015).</li><li>Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+tree+variability+of+lignin+composition+in+Populus.">Within tree variability of lignin composition in Populus.</a> Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).</li><li>Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.+High-Throughput+Screening+of+Plant+Cell-Wall+Composition+Using+Pyrolysis+Molecular+Beam+Mass+Spectroscopy.">Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy.</a> Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).</li><li>Decker, S., Himmel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+17.+Reducing+the+effect+of+variable+starch+levels+in+biomass+recalcitrance+screening).">Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening).</a> Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).</li><li>Evans, R. J., Milne, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+pyrolysis+of+biomass.">Molecular characterization of the pyrolysis of biomass.</a> Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die wichtigsten Schritte der Probenvorbereitung für den Erhalt von genauen und reproduzierbaren Daten bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Versuche sind wie folgt: Zucker Release Assay: Im Allgemeinen werden die Proben in Lose von wenigen Dutzend bis zu mehreren Tausend zu einem Zeitpunkt hergestellt. Jedem Hauptschritt wird typischerweise für alle Proben vor, um Schwankungen in der Zubereitung zwischen Proben zu minimieren Vorwärtsbewegung durchg...

Da die weltweite Versorgung mit nicht-erneuerbaren Energieträger und die dazugehörigen Produkte sinkt, haben Wissenschaftler herausgefordert, ähnlichen Kraftstoffen und Chemikalien aus pflanzlichen Quellen 1 zu erstellen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist zu bestimmen, welche Arten von Pflanzen können für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien 2,3 sein. Üblicherweise werden diese Einsatzstoffe für Lignin, Cellulose und Hemicellulose bewertet; sowie ihre Anfälligkeit für deconstruction (recalcitrance), durch thermische, mechanische und / oder chemische Vorbehandlung mit oder ohne anschließender Enzym Verzuckerung. Detailliertere Analysen werden verwendet, um die spezifische Zusammensetzung der Lignin und Hemicellulose-Fraktionen sowie eine optimale Enzymaktivitäten benötigt bestimmen. Transgene Modifikationen von Pflanzen, die nicht eigen Sie besitzen ideale Merkmale für biochemische oder thermochemische Umwandlung, um die gewünschten Rohstoffe haben die Forscher mit einer stark erweiterten Quelle Topf bereitgestelltzielle Ausgangsmaterialien 4. Die Standard-Analyseverfahren zum Quantifizieren der chemischen Eigenschaften einer Pflanze, während sehr nützlich für kleine Probenmengen, nicht geeignet sind für das schnelle Screening von Hunderten oder Tausenden von Proben 5-7. Die hierin beschriebenen HTP Methoden wurden entwickelt, um schnell und effizient auszuwerten zahlreiche Biomasse Varianten für Veränderungen in der Zellwand recalcitrance thermochemische und / oder enzymatischen Abbau. Es ist wichtig zu verstehen, dass die hier beschriebenen HTP-Screening-Assays wurden nicht entwickelt, um Wandlungs- oder Ertrag zu maximieren. Das Ziel ist der relative Unterschied in der intrinsischen recalcitrance verwandter Biomasseproben zu bestimmen. Als Folge sind viele der Analyseschritte von den &quot;typischen&quot; Umwandlung von Biomasse-Assays, wo das Ziel ist es, maximale Conversion-Rate oder das Ausmaß zu erhalten, abweichen. Beispielsweise werden geringer Vorbehandlung severities und kürzere Enzymhydrolyse verwendet zu maximieren abweichenschiede zwischen den Proben. In den meisten Fällen relativ hohe Enzymbeladungen verwendet werden, um Unterschiede, die durch experimentelle Variation der Enzymaktivität, die die Ergebnisse erheblich verfälschen könnte reduzieren. Schnelle Techniken zur Bestimmung der Zusammensetzung von Pflanzenzellwänden und den monomeren Zuckern freigesetzte folgenden enzymatischen Verzuckerung gehören Robotik, besonders angefertigt, thermochemisch kompatible 96-Well-Platten, und Modifikationen der Standard-Labormethoden 8-11 und Instrumental-Protokolle, wie Schwingungsspektroskopie (IR- (IR), im nahen Infrarotbereich (NIR) oder Raman) und magnetische Kernresonanz (NMR) 12-17. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Isolierung von Ausgangsmaterialien mit hoher Cellulose oder niedrigen Ligningehalt, oder diejenigen erwartet, die höchsten Glucose, Xylose, Ethanol Ausbeute usw. Diese Methoden wurden heruntergerechnet Analysen, die kleinere Mengen an Biomasse und Verbrauchsmaterialien verwenden aktiviert, was zu einer Senkung der Versuchs Kosten 18 </sup&gt;. Ein weiteres Merkmal dieser methodische Ansatz ist, dass verschiedene Versuchsbedingungen schnell zu sein, und in einigen Fällen gleichzeitig ausgewertet. Beispielsweise kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorbehandlungsstrategien oder Enzymcocktails getestet werden, so dass die optimalen experimentellen Parameter schnell identifiziert und verwendet werden. Beliebte Einsatzmaterialien, wie beispielsweise Maisstroh 9, Pappel 8,10, Bagasse 8 und Switch 8 wurden erfolgreich unter Verwendung dieser HTP Verfahren bewertet. Gesamt Lignin und Lignin Monomerzusammensetzung werden auch üblicherweise quantifiziert Biomasse Züge. Verringerungen der Ligningehalt haben gezeigt, dass die enzymatische Verdaubarkeit von Polysacchariden 19,20 erhöhen. Die Rolle, die das Lignin monomeren Verhältnis (oft als Syringyl / Guaiacyl (S / G) gemeldet) spielt in der Dekonstruktion der Pflanzenzellwand wird noch untersucht. Einige Berichte haben gezeigt, dass eine Verringerung des S / GQuote führte zu einer erhöhten Glucoseausbeuten nach der Hydrolyse 21, während andere Studien enthüllen den gegenläufigen Trend 19,22. Hochdurchsatz-Methoden zur Bewertung Lignin und seine Monomere sind Schwingungsspektroskopie (IR, NIR und Raman-23-26), die mit der multivariaten Analyse und Pyrolyse Molekularstrahl-Massenspektrometrie (pyMBMS) 27,28. Bei der Entwicklung von HTP Verfahren zum Screenen von Biomasse müssen mehrere integrale Überlegungen im Auge gehalten werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Komplexität des Verfahrens. Was ist die erforderliche Qualifikationsniveau für die Technik? Chemometrische Analysen zum Beispiel erfordern bestimmte Fähigkeiten für den Aufbau, Bewertung und Aufrechterhaltung der Vorhersagemodelle. Die Standardmethoden weisen unerwünschte Vor- oder Datenanalyseschritte oder beschäftigen toxischen Reagenzien. Entwicklung der Modelle ist ein laufender Prozess, wo neue Daten über die Zeit, um die Robustheit des Modells zu erhöhen in das Modell ein. Ein weiterer ConsIDmenarbeit ist die Kosteneinsparungen und verringerte experimentellen Analysezeiten der vorgeschlagenen Hochdurchsatzverfahren. Wenn die Methode ist sehr schnell, aber sehr teuer ist, kann es keine praktikable Methode für viele Labors, um anzunehmen. Die in dieser Handschrift dargestellten Verfahren sind Varianten von standardisierten Techniken modifiziert, um die Durchsatzfähigkeiten zu verstärken. Diese Protokolle quantitativ die Biomasse Merkmale von Interesse zu messen, ohne die Notwendigkeit der Entwicklung von Vorhersagemodellen. Dies ist ein Schlüsselattribut dieser Techniken, da Vorhersagemethoden, während sie eine starke Korrelationen mit den Standardanalysen verwendet, um die Modelle zu entwickeln, sind nicht so genau wie eigentlich Messung der Menge von Interesse für die Proben. Während die Verwendung von im wesentlichen nach unten Versionen von Standard-Labormaßstab Analysemethoden skaliert Verfahren werden Genauigkeit und Präzision für die Geschwindigkeit und Durchsatz gehandelt. Meist ist dieses Ergebnis aufgrund höherer Fehlern in kleinen Volumen Pipettieren und Wiegen; sowie erhöhte sreichliche Heterogenität als Stichprobengröße wird verringert. Während große Sample-Sets können gesiebt und verglichen werden, müssen große Sorgfalt, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen Kampagnen und den Labormaßstab Ergebnisse ausgeübt werden. Die zeitaufwendigsten Schritte erfordern die physikalische Manipulation der Biomasse. Schleifen Proben kann mehrere Minuten pro Probe, einschließlich Reinigung der Mühle zwischen den Proben zu nehmen. Manuelles Laden, Entladen und Reinigungstrichter und Befüllen und Entleeren Teebeutel und Probenbeutel ist auch sehr arbeitsintensiv. Während jeder Schritt kann eine Minute oder länger dauern kann dabei Tausende von Proben viele Stunden oder sogar Tage dauern. Die Roboter können eine typische Reaktorplatte mit Biomasse in etwa 3 bis 4 Stunden oder 6 bis 8 Platten Tag -1 Roboter laden -1. Diese Situation hängt von der Genauigkeit Parameter sowie der Art und der Menge an Biomasse zu prüfenden verwendet. Füllen Reaktorplatten mit Wasser, verdünnter Säure oder Enzym wird schnell mit einem Liquid-Handling-Roboters durchgeführt. PNachbehandlung von einem Plattenstapel (1 bis 20 Reaktorplatten) dauert zwischen 1 und 3 Stunden, wenn Montage, abkühlen und Demontage enthalten. Enzymhydrolyse dauert 3 Tage und die Zuckeranalyse benötigt etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit plus 10 min pro Reaktorplatte, um den Test abzuschließen und lesen Sie die Ergebnisse. Ein Wochenplan gesetzt Vorbehandlung und Analyse Tage nimmt eine vernünftige Arbeitszeiten, ungerade Stunden und am Wochenende Anstrengungen für die menschliche Komponente des Assays zu minimieren und ermöglicht die Verarbeitung ~ 800 bis 1000 Proben pro Woche auf kontinuierlicher Basis. Der maximale Durchsatz von mehreren Faktoren abhängig, vor allem, wie viel Hardware (Roboter, Reaktoren Platten, etc.) und wie viel &quot;Software&quot; (dh Personal) stehen zur Verfügung, um die manuelle Arbeit zu tun. Die praktische obere Grenze ist 2500 bis 3000 Proben / Woche; erfordert jedoch, dass Ausgangs 7 Tage in der Woche Betrieb und mehrere Praktikanten und Techniker. Im Vergleich dazu würden 3.000 Proben mittels HPLC etwa 125 Tagen sam erforderlichB. Analyse plus die zusätzliche Arbeit der Hand mit einem Gewicht von Proben in Reaktoren und Filterproben vor der Analyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wiley mill</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-static bags</td>
			<td>Minigrip*</td>
			<td>MGST4P02503</td>
			<td>2.5x3&#34;, multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tin-coated copper wire</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8871K84</td>
			<td>0.016&#34; diameter, bend-and-stay wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tea-bags</td>
			<td>Herbco</td>
			<td>press n&#39; brew teabags</td>
			<td>3.5x5 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gluco-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Spirizyme Fuel&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-amylase</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td>Liquozyme SC DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">
			<table cellpadding="0" cellspacing="0">
				<tbody>
					<tr>
						<td>sodium acetate trihydrate</td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof (95%) ethanol</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td>reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hoppers</td>
			<td>Freeslate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well C-276 Hastelloy plates</td>
			<td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td>
			<td>N/A (custom built)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#8221; soldering iron tip</td>
			<td>Sears</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone-adhesive backed Teflon tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>5180</td>
			<td>3&#34; wide (36-yard rolls)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzyme solution</td>
			<td>Novozymes</td>
			<td></td>
			<td>Cellic CTec2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>any chemical supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable, polystyrene 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>or equivalent; multiple suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase/peroxidase&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose dehydrogenase</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Gluc</td>
			<td>Megazyme D-glucose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylose standard solution</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-Xylose</td>
			<td>Megazyme D-xylose assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel sample cups</td>
			<td>Frontier Laboratories</td>
			<td>PY1-EC80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass fiber sheets</td>
			<td>Pall</td>
			<td>66227</td>
			<td>8x10&#34; sheets--circles punched with standard hole punch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monterey Pine Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Straw Whole Biomass Feedstock</td>
			<td>NIST</td>
			<td>8494</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of recalcitrance variations in lignocellulosic biomass: total lignin, lignin monomers, and enzymatic sugar release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Der kombinierte Effekt der thermochemischen Vorbehandlung und anschließende Enzym Verzuckerung wird als Funktion der Masse der Glucose und Xylose am Ende des Tests gemessen und errechnet. Die Ergebnisse sind in der Einheit Milligramm von Glucose und Xylose pro Gramm Biomasse frei gemeldet. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Daten aus Labormaßstab Assays, die üblicherweise als prozentuale theoretische Ausbeute, bezogen auf die Zusammensetzungs-Analyse des Ausgangsmaterials gemeldet wird, gemeldet. Da es noch nicht...

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High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

high-throughput-screening-recalcitrance-variations-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Environment

9.9K Aufrufe.  National Renewable Energy Laboratory. Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

Serie: High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Forschung

Umwelt

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

Hochdurchsatz-Fluorometric Messung der Boden Mögliche Extrazelluläre Enzymaktivitäten

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

Semi-High Throughput Screening für potentielle Dürre-Toleranz in Kopfsalat (<em&gt; Lactuca sativa</em&gt;) Keimplasmasammlungen

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of a variety of lignocellulosic feedstocks. Here we demonstrate the use of these low-cost protic ILs in the deconstruction of lignocellulosic biomass (Ionosolv pretreatment), yielding cellulose and a purified lignin. In the most generic process, the protic ionic liquid is synthesized by accurate combination of aqueous acid and amine base. The water content is adjusted subsequently. For the delignification, the biomass is placed into a vessel with IL solution at elevated temperatures to dissolve the lignin and hemicellulose, leaving a cellulose-rich pulp ready for saccharification (hydrolysis to fermentable sugars). The lignin is later precipitated from the IL by the addition of water and recovered as a solid. The removal of the added water regenerates the ionic liquid, which can be reused multiple times. This protocol is useful to investigate the significant potential of protic ILs for use in commercial biomass pretreatment/lignin fractionation for producing biofuels or renewable chemicals and materials.

The pretreatment of lignocellulosic biomass with protic low-cost ionic liquids is shown, resulting in a delignified cellulose-rich pulp and a purified lignin. The pulp gives rise to high glucose yields after enzymatic saccharification.

Die Vorbehandlung von Lignocellulose-Biomasse mit Low-Cost-ionischen Flüssigkeiten

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown energy crops (e.g., miscanthus, and switchgrass) that are available in large quantities to produce biofuels, biochemicals, and animal feed. Plant polysaccharides (i.e., cellulose, hemicellulose, and pectin) embedded within cell walls are highly recalcitrant towards conversion into useful products. Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment that increases accessibility of polysaccharides to enzymes for hydrolysis into fermentable sugars. These released sugars can be converted into fuels and chemicals in a biorefinery. Here, we describe a laboratory-scale batch AFEX process to produce pretreated biomass on the gram-scale without any ammonia recycling. The laboratory-scale process can be used to identify optimal pretreatment conditions (e.g., ammonia loading, water loading, biomass loading, temperature, pressure, residence time, etc.) and generates sufficient quantities of pretreated samples for detailed physicochemical characterization and enzymatic/microbial analysis. The yield of fermentable sugars from enzymatic hydrolysis of corn stover pretreated using the laboratory-scale AFEX process is comparable to pilot-scale AFEX process under similar pretreatment conditions. This paper is intended to provide a detailed standard operating procedure for the safe and consistent operation of laboratory-scale reactors for performing AFEX pretreatment of lignocellulosic biomass.

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia fiber expansion (AFEX) is a thermochemical pretreatment technology that can convert lignocellulosic biomass (e.g., corn stover, rice straw, and sugarcane bagasse) into a highly digestible feedstock for both biofuels and animal feed applications. Here, we describe a laboratory-scale method for conducting AFEX pretreatment on lignocellulosic biomass.

Ammoniakfaserausdehnung (AFEX) Vorbehandlung von lignozellulosehaltiger Biomasse

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Eine neue Methode für die Analyse von Pentosan in Jute Biomasse und deren Umwandlung in Zucker Monomere mit sauren ionischen Flüssigkeit

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

Hochdurchsatz-Microscale Protokoll für die Analyse der Verarbeitungsparameter und ernährungsphysiologischen Eigenschaften in Mais (Zea Mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

Siderophore Hochdurchsatz-Screening von Umweltproben: Pflanzen, Gewebe, lose Böden und Rhizosphäre Böden

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...