Diese Arbeit wurde durch ein NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakultät Transition Award (K22 HG002908), um AMD und eine strategische Partnerschaft zwischen dem Institut für Systembiologie und der Universität Luxemburg unterstützt. Anträge für die Stämme oder Plasmide sollte Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com) gerichtet werden.

1. Dehnungs Konstruktion und Charakterisierung <ol><li> Konstruieren die heterozygoten diploiden Stamm in die Quer durch Paarung haploiden Stämmen und Auswählen Diploide 2 oder unter Verwendung eines natürlich vorkommenden heterozygoten Stamm verwendet werden. Die Stämme sollten nicht bergen GFP. </li><li> Zu bestätigen, dass der Stamm nicht auf YPD 2 + 200 &amp;mgr; g / ml G418 wachsen. </li><li> Bestätigen Sie, dass der Stamm ist in der Lage, Sporen zu bilden. BEST ist mit Effizienz Kreuze niedrigen Sporenbildung kompatibel, aber niedrige Sporenbildung Frequenz erhöht FACS-Sortierzeit erforderlich. <ol><li> Richten Sie eine O / N-Kultur des Stammes in 5 ml YPD und wachsen unter Rühren bei 30 ° C </li><li> Mit PBS (pH 7,4) waschen 0,5 ml des O / N-Kultur dreimal. </li><li> Pellet die Zellen gewaschen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 2 ml Sporulationsmedium 7. </li><li> Man schüttelt Zellen bei RT und prüfen täglich für tetrad Bildung unter Verwendung eines Phasenkontrast-Lichtmikroskop mit einer 40X-Objektiv. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Schätzen Sie die Lebensfähigkeit der Sporen des Kreuzes durch konventionelle Dissektion 2,3 von einer geringen Anzahl (~ 20) Tetraden. Die Lebensfähigkeit der Sporen in Kreuzungen zwischen verschiedenen Hintergründen Belastung sehr unterschiedlich und unvorhersehbar. Jedoch a priori Erwartungen Lebensfähigkeit der Sporen verwendet werden, um die Effizienz eines beste Experiment vor der arbeits-und kostenintensiven Schritte des Speicherns und Genotypisierung der Stämme zu bewerten. Daher wird dieser Schritt sehr empfehlenswert. </li></ol> 2. Transformation von Diploiden mit Bibliothek Barcode Plasmide <ol><li> Legen Sie die pCL2_BC Barcode-Plasmid in die heterozygot diploide Stamm mit der in Gietz und Woods 8 beschrieben Transformationsprotokoll mit folgenden Änderungen. <ol><li> Nachdem die Zellen wurden mit dem Transformationsgemisch bei 30 ° C für 20 min inkubiert wurden, fügen DMSO bis 8% des Volumens der Transformationsmischung. Zugabe von DMSO wurde gefunden, daß die Transformationseffizienz zu verbessern in einige Dehnungshinter 9. </li><li> Nach dem Hitzeschock-Schritt, die Zellen zu pelletieren, mit einer kurzen Zentrifugation dekantiert die Transformationsansatz, und waschen Sie die Zellen vorsichtig in YPD. Dann Resuspendieren der Zellen in 1 ml YPD und es ihnen ermöglichen, bei RT für 3 h ohne Rühren erholen. </li></ol></li><li> Wählen Transformanten durch Ausplattieren auf YPD + G418 (200 ug / ml)-Agarplatten. Um eine komplexe Pool von Plasmid-Barcodes zu gewährleisten, ernten, eine große Anzahl von Kolonien, z. B. 5-Platten mit ~ 2500 Kolonien pro Platte. </li><li> Sobald Kolonien sichtbar sind (2-3 Tagen Wachstum bei 30 ° C), bündeln die Transformanten durch vorsichtiges Schaben sie von der Platte in flüssiges YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% Glycerin. Vortex diese Zellsuspension, Transfer in ein Kryokonservierungsfläschchen, und frieren bei -80 ° C eingefroren Einen separaten Lager für jede Platte. Diese froren Bestände dienen als Ausgangsstämme für Schritt 3.1 und kann auch verwendet werden, um mehr Tetraden zu einem späteren Zeitpunkt zu erzeugen, wenn gewünscht. </li&gt; </ol> 3. Sporulierenden die Bibliothek von transformierten Zellen zu erhalten Barcode Tetrads <ol><li> Revive-Zellen aus den gefrorenen Aktien in 2.3 von O / N Wachstum in 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) unter Rühren erzeugt bei 30 ° C. </li><li> Waschen der Zellen von dem O / N Kulturen 3x in PBS (pH 7,4) und anschließend hat ein Resuspendieren der Zellen in Sporulationsmedium 7 plus 200 ug / ml G418. </li><li> Man schüttelt die Sporenbildung Kulturen bei RT und tägliche Überwachung der Sporenbildung Fortschritte, bis neue Tetraden haben aufgehört zu bilden. </li><li> Sobald die Kultur enthält gut ausgebildeten Tetraden und relativ wenigen Dyaden, Kulturen entfernen Agitation und lassen bei RT für mindestens 7 Tage. Während einige Kreuze können zugänglich auf Platte Verdauung und Störung so schnell wie Tetraden gebildet haben sein (gemessen als in 7.3), ist die zusätzliche Inkubation (7-10 Tage in unseren Versuchen) die für andere Kreuze. Daher wird dieser Schritt sehr empfehlenswert. </li></ol> 4. Stellendie Tore für FACS Tetrad Sortierung Die meiotisch ausgedrückt SPS2-GFP-Fusions auf dem Plasmid ermöglicht pCL2_BC Tetraden in der Sporulation Kultur detektiert und aus der Kultur isoliert werden durch Fluoreszenz. Das folgende Protokoll wurde für eine FACSAria II entwickelt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> 2. FACS-Gatter. Eine Reihe von vier aufeinanderfolgenden Toren verwendet wird, um Tetraden isolieren. Die in (A) gezeigt, Toren und (B) zur Verringerung der Anzahl von Klumpen. Fluoreszenzereignisse mit der Gate-in (C) ausgewählt. Das Histogramm in (D) zwei Peaks. Veranstaltungen in der linken Spitze sind in erster Linie Tetraden (linkes Bild Einschub) und Ereignisse in die richtige Spitzen Tetraden sind in der Regel mit einem angeschlossenen Kopfhörer (Bild rechts im Bild). Eine letzte Tor istangewandt, um diesem Histogramm, an Veranstaltungen, die meist Tetraden (rote Balken) sind zu wählen. Diese Zahl hat sich von Ludlow et al 1 geändert worden. <ol><li> (2A und 2B) Legen Sie das sporenbildenden Kultur auf eine FACS-Sorter und zwei Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung Tore gesetzt, um Schmutz, verklumpte Zellen und mehreren Zellen pro Tröpfchen auszuschließen. </li><li> Es sollte eine Bevölkerung von fluoreszierenden Zellen, die bei der Verwendung der SPS2-GFP-Reporter-Konstrukt gehören Dyaden und Tetraden 10 sein. Tor der GFP gegen FSC, diese Leuchtstoff Ereignisse (2C) enthalten. </li><li> Je nach Beanspruchung Hintergrund kann es notwendig sein, eine zusätzliche Gate Klumpen, die Tetraden und andere Zellen umfassen auszusortieren. Wenn dies erforderlich ist, prüfen einen FSC-Histogramm der Fluoreszenz Ereignisse und geben ein Tor, das Ereignisse mit geringeren FSC (2D, gated Veranstaltungen sind in rot) umfasst. </li><li> Prüfen Sie die Effizienz der t<html> er Anschnittregelung ordnen ~ 1.500 Tetraden auf einen Objektträger und zum Zählen der Anteil der nicht-Tetraden Tetraden mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Der Prozentsatz der Tetraden genau durch Zählen nur ~ 200 sortiert Ereignissen abgeschätzt werden, aber Sortier ~ 1500 verringert die Menge an Zeit für die Suche nach Zellen auf dem Objektträger. Alternativ kann das Verhältnis der Tetraden nicht-Tetraden in Schritt 4.5 geprüft werden. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig, dass die Sortier genau die Berichterstattung über die Zahl der Veranstaltungen von 25 Sortier Tetraden auf einen Objektträger und die Prüfung der in den Tropfen enthaltenen Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. Es sollte 25 Tetraden im Tropfen sein. 3-4x wiederholen, um die Varianz des FACS Instruments beurteilen. </li></ol> 5. Sortierung Tetrads auf eine Agarplatte p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Platzierung des Agar-Platte auf der FACS-Sorter. Um Tetraden in einen kleinen Tropfen der Lösung Zymolyase in der Mitte von einem Standard-(Kreis-) Agar-Platte, ein Standard-(100 mm rechteckig) platziert sortieren 96-Well-Platte ist das erste auf der Stufe des Zellsortierer angeordnet, und die Sortiereinrichtung so programmiert ist, Tetraden in einem bestimmten gut deponieren (in diesem Fall D5). Dann wird die kreisförmige Agarplatte auf der Oberseite der Platte mit 96 Vertiefungen platziert und ausgerichtet, so dass die Tropfen Zymolyase über die vorgegebene gut zentriert. <ol><li> Erwärmen die gewünschte Anzahl von YPD + G418 (200 ug / ml)-Platten für mindestens 1,5 Stunden in einem 37 ° C-Inkubator in der Nähe der FACS-Sorter angeordnet. </li><li> Ein Schlüsselmerkmal des Sortier Protokoll ist die Fähigkeit, genau zu zielen FACS sortiert Tetraden zu einer bestimmten Stelle auf einer Agar-Platte, die einen Pool von Zymolyase Lösung enthält. Um dies zu tun, setzen Sie ein &quot;Wahrzeichen&quot; 96-Well-Platte auf Ter automatisierten Zellablageeinheit (ACDU) der Sorter. Bereiten Sie eine Art Layout, das 25 Tetraden in eine Vertiefung einer 96-Well-Format zu sortieren wird. Wählen Sie ein gut in der Nähe der Mitte der Platte, z. B. auch D5. Abbildung 3 zeigt eine Petrischale und 96-Well-Platte auf einen Zellsortierer geladen. Sortierung 25 Tetraden pro Platte ergibt gut getrennten Kolonien. </li><li> Bringen Sie einen Stapel von 10-Agar-Platten aus dem 37 ° C Inkubator zum Sortierer. </li><li> Nehmen Sie eine Agar-Platte und Pipette 25 ul Zymolyase-Lösung (1 mg / ml in 0,7 M Sorbit) auf dem Agar in der Nähe der Mitte der Platte. Dann wird die Platte auf dem Wahrzeichen 96-Well-Platte, richten Sie die Zymolyase Tröpfchen über dem Ziel gut aus Schritt 5.2, z. B. auch D5. </li><li> Starten Sie die Art und abzuscheiden 25 Tetraden in der Mitte der Zymolyase Tröpfchen auf der Agarplatte. Dann entfernen und die Platte abgedeckt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5 bis 25 Tetraden wurden in Zymolyase Tröpfchen auf jeder Platte im Stapel sortiert worden. </li&gt; <li> Rückgabe den Stapel von Tetraden-enthaltenden Platten zu dem 37 ° C Inkubator. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.3 bis 5.7, bis alle Platten Tetraden. </li></ol> 6. Trenn-Sporen <ol><li> Inkubieren jeder Stapel Tetrade Agarplatten bei 37 ° C für 1,5 Stunden. </li><li> Platten entfernen aus dem Inkubator, fügen 15-25 sterile Glasperlen 3 mm pro Platte, und schütteln Sie die Platten als Stapel (oder als zwei Stapel von 5 Platten) für 3-5 min. Die beste Trennung wird durch Sporen starr bewegen die Platten von Seite zu Seite, um zurück-oder Front erreicht. Die Platten, so dass die Perlen &quot;Wirbel&quot; um den äußeren Rand der Platte nicht bewegen. Lassen Sie die Perlen auf den Platten, wenn Sie fertig. </li><li> Legen Sie den Stapel von Platten mit Perlen stehen in einem 30 ° C-Inkubator. Rufen Sie die nächste Stapel Platten aus dem 37 ° C-Inkubator, und wiederholen Sie Schritt 6.2. </li><li> Platten O / N inkubieren bei 30 ° C. </li></ol> 7. Ernten Kolonien <ol><li> Nachein O / N-Inkubation bei 30 ° C sollten kleine Kolonien auf den Platten gebildet sind. Die Platten vorsichtig aus dem Inkubator zu entfernen, ohne die Glasperlen zu stören. </li><li> Entfernen Sie die Glasperlen durch sorgfältig und schnell über ein tiefes Gefäß Umdrehen der Platten. Der Behälter sollte tief genug, um die Perlen ohne dass sie hüpfen auf und traf den Agar-Platte zu fangen. Durch Tippen auf die Unterseite der Platte, während es umgekehrt ist, kann helfen, zu vertreiben Perlen, die auf die Platte geklebt werden. Diese Perlen können durch gründliches Waschen mit Seife wiederverwendet werden, Spülen und mit VE-Wasser und Sterilisieren durch Autoklavieren. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte und verwenden Sie die Anzahl der Kolonien, die Effizienz der Sporen Trennung und Rückgewinnung zu schätzen. Zum Beispiel könnte 25 Tetraden pro Platte für ein Kreuz mit nahezu 100% Lebensfähigkeit insgesamt 100 Kolonien pro Platte. </li><li> Von Platten mit einer ausreichenden Zahl von Kolonien (&gt; für ein Hoch Lebensfähigkeit Kreuze 65), Transfer-Zellen aus jeder colony in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte mit YPD Flüssig + G418. Außerdem notieren die Vertiefungen mit Kolonien von der gleichen Agar-Platte; Diese Informationen werden verwendet, um die Zuordnung tetrad Software zu unterstützen. </li><li> Verwenden Sie die 96-Well-Platten flüssigen Kulturen für die Genotypisierung und für die Rettung Stämme als Glycerin eingefroren Aktien Saatgut. Details zu RAD-Tag-Sequenzierung und Sequenzanalyse kann in Ludlow et al 1 gefunden werden. </li></ol>

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	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Viele Bereiche der Genetik Forschung, die von komplexen Abbildungsmerkmal 11 auf die Untersuchung der Mechanismen 12 zugrunde liegenden DNA-Rekombination, erfordern eine extrem große Anzahl von Nachkommen und große Mengen von DNA-Sequenzierung. Techniken, die die Leistung von herkömmlichen Ansätzen mit der Kapazität von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung zu heiraten haben das Potenzial, Studien, die vorher unlösbar waren zu ermöglichen. Obwohl mehrere Hochdurchsatz-Methoden haben Hefegenetik tatsächlich auf spezifische Probleme angewendet hat jede Einschränkungen, die kurz von der breiten Anwendbarkeit der konventionellen Tetradenanalyse fallen. BEST-Adressen diese Herausforderungen durch den Einsatz einer Hochdurchsatz-Ansatz, der Tetrade Dissektion und Genotypisierung des Nachkommen von Hefe-Kreuze. In Verbindung mit Multiplex-RAD-Tag-Sequenzierung, bietet BEST eine kostengünstige Möglichkeit, Genotyp Informationen für jeden Nachkommen Stamm aufzulesen Wahrung tetrad Beziehungen durch einzigartige tetrad Barcodes.0; Von allen derzeit verwendeten Hochdurchsatzverfahren, am nächsten BEST rekapituliert die Informationen durch eine manuell zerlegt Hefe Kreuz zur Verfügung gestellt. BEST hat zwei wichtige Funktionen. Die erste ist die Verwendung von FACS, um schnell zu isolieren unsporulated Tetraden von Zellen in der Kultur (Protokoll Schritte 5-6). Die Möglichkeit, Tausende von fluoreszierenden Ereignisse (Tetraden) zu isolieren gibt BEST größten Gewinn an Durchsatz. Diese Automatisierung bietet einen noch größeren Vorteil gegenüber der manuellen Zerlegung für Kreuze mit geringer Sporenbildung Effizienz, aufgrund der erhöhten Zeit, um visuell zu identifizieren seltene Ereignisse benötigt. Die zweite wichtige Merkmal ist die Verwendung eines hoch komplexen molekularen Barcode (Protokoll Schritt 2), die für jede Schwester Sporen einer Tetrade übertragen wird. Da diese Barcodes verwendet werden, um rechnerisch zu rekonstruieren, die Tetrade Beziehungen zwischen Sporen, die zufällig auf einer Agarplatte verteilt wurden, die Notwendigkeit, manuell Arrayzellen in einem geordneten Raster gelindert werden. Schließlichda das Molekular Barcode und die Sporenbildung spezifischen GFP-Reporter-Gen physikalisch (auf dem gleichen Plasmid) verbunden werden nur Tetraden, die die molekulare Barcode beibehalten wurden durch FACS-Sortierung ausgewählt. Es gibt zwei Aspekte, die Länge der Zeit, die Kulturen sollte in der Sporulation Medium inkubiert werden, zu regeln. Erstens, weil die Sporenbildung spezifische Reporter (SPS2-GFP) früh in der Meiose ausgedrückt, allein GFP unterscheidet nicht komplett 4-Sporen Tetraden aus Zellen, die noch nicht abgeschlossen haben Meiose (dh Dyaden). Während zusätzliche FACS-Gating kann die Zahl der fluoreszierenden, unvollständige Tetraden zu verringern, ist der einfachste Weg, um diese unerwünschten Ereignisse verringern einfache Überwachung des Sporenkultur (Schritt 3.3) und fort einmal neue Tetraden haben aufgehört zu bilden. In unseren Experimenten ist die Frequenz der Dyaden sortiert weniger als 1%. Zweitens, für einige Kreuze zusätzliche Zeit in Sporulationsmedium verbrachte bei RT ohne Rühren (Schritt 3.4) significantly verbessert die Trennung von Tetraden, die von den Glasperlen während des Plattierens ((Protokoll Schritt 6). In der Tat ist dieser Schritt für die Unterbrechung einiger Kreuzungen unbedingt erforderlich. Wie alle Hochdurchsatz-Methoden ist BEST &quot;lauter&quot; als die entsprechenden konventionellen Ansatz. Die leichte Reduktion der Effizienz der BEST Vergleich zu herkömmlichen tetrad Dissektion konnte aus Kombinationen von verschiedenen Faktoren führen. Ein Faktor ist der erhöhte Verlust an sich lebensfähiger Sporen, die von Haftung an den Glasperlen während des Streuens oder erhöhte Sporen Tod aufgrund der mechanischen Beanspruchungen des Prozesses führen kann. Ein zweiter Faktor könnte einfach Plasmid-Verlust während der Meiose werden. Ein dritter Faktor könnte eine wirksame Abnahme der nutzbaren Kolonien aus Kolonien mit gemischten Genotypen ergeb sein, Kreuze schätzungsweise ca. 5% der Kolonien in unserer Pilot ein. Es ist wahrscheinlich, dass diese Kolonien repräsentieren Ausfälle von Schwester Sporentrennung. Da die schnelle Fluorescence Sortier-und Sporen Trennung erlauben die Sammlung von riesigen Mengen von Tetraden wird BEST gut gerüstet, um Rückgänge in Effizienz auf dieser Skala zu überwinden. Während künftige Iterationen des BEST könnten Wirkungsgrade, die der von manuellen Präparation zu erhöhen, ist es vielleicht eher, dass die aktuelle Flugbahn des exponentiellen DNA-Sequenzierung Kapazität schnell zu kompensieren für diese Ebene der nutzbaren Stamm Verlust. Unabhängig davon, wird die Fähigkeit, Tetradenanalyse auf die Waage, um die am besten angewendet werden kann, führen Studien zu ermöglichen, die derzeit nicht machbar durch manuelle Methoden sind.

Meiotische Gen-Kartierung, die gemeinhin als Tetradenanalyse bekannt, ist von zentraler Bedeutung für Hefe-Genetik. Kurz gesagt, werden zwei haploiden Stämme, die jeweils eine einzelne Kopie jedes Chromosoms enthalten, zusammengefügt, um einen heterozygot diploide Stamm mit zwei Kopien von jedem Chromosom, eine von jedem Elternteil zu bilden. Hungernde diploiden Zellen für Stickstoff induziert Meiose (Sporenbildung), in dem Chromosomen duplizieren, Umlagerung, und teilen sich in vier haploide Zellen (Sporen oder Abkömmlinge) mit neuen Kombinationen von Allelen von jedem Elternteil. Die vier Sporen aus einer Meiose ergeben, können durch einen manuellen Prozess namens tetrad Dissektion isoliert werden. Konventionelle tetrad Dissektion 2,3, die relativ wenig seit der ursprünglichen Veröffentlichung im Jahr 1937 4 geändert hat, hat drei Ziele. Zunächst müssen Zellen, die Meiose (Tetraden) unterzogen wurden, von einem Hintergrund von vegetativen Zellen isoliert werden. Bei herkömmlichen Analyse, wird dies durch einen Forscher, der erreicht, mitein Mikroskop visuell identifiziert Tetraden auf einer Agar-Platte und beschäftigt ein Mikromanipulator Gerät visuell identifizieren Tetraden auf einer Agar-Platte und mit einem Mikromanipulator, um die Tetrade auf einem zellfreien Bereich der Platte zu bewegen. Weiter müssen die vier Sporen in der Tetrade physikalisch getrennt werden, um interspore Stecken. Sporen innerhalb einer Tetrade werden sowohl von einem Ascus, der Rest der Zellwand des ursprünglichen diploiden Zelle, und eine Reihe von Brücken interspore 5 zusammengehalten werden. Bei herkömmlichen Tetradenanalyse die Ascus durch enzymatische Verdauung entfernt und ein Forscher nutzt die Mikromanipulator, um die interspore Brücken brechen auseinander und necken die Sporen. Schließlich werden die einzelnen Sporen in einem Gittermuster, das die Beziehung zwischen der Sporen unterhält angeordnet sind, dh alle Nachkommen in einer Reihe von vier Schwester Sporen des gleichen ursprünglichen Tetrade. Ein erfahrener Hefe-Forscher können den Prozess der Zerlegung 10 Tetraden (eine allgemein akzeptierte Mindestzahl vervollständigenpro Quer) in ca. 15 min. Wir haben einen neuen Hochdurchsatz-Genotypisierung tetrad Methode, die wir als B arcode E Enabled S equencing von T etrads (BEST) 1 entwickelt. BEST baut auf aktuellen Methoden in der Hochdurchsatz-Genetik, indem du die Generierung und Genotypisierung einer großen Zahl von Nachkommen, die isoliert sind, Genotyp, und als Individuen in einer Weise, die Schwester Sporen Beziehungen aller vier meiotischen Produkte gewonnen werden können gehalten werden. Dies wird unter Verwendung von drei Hauptstrategien (Fig. 1) erreicht. Zuerst ist die Einführung eines Reporterkonstrukt, das Zellen, die mit GFP Meiose durchlaufen haben Etiketten und ermöglicht es ihnen, durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Zweitens ist der Einbau eines hochkomplexen DNA Barcode (eine Kette von 15 zufälligen Nukleotiden) in einer Form, die an allen vier Sporen einer Tetrade übertragen wird und durch DNA-Sequenzierung des rekombinanten PROGEN leseny und damit identifiziert Schwester Sporen aus der gleichen Tetrade. Drittens ist die Genotypisierung Schritt, und am besten mit zahlreichen Plattformen, die Genotypisierung Capture sowohl eine Reihe von genomischer Marker sowie die Tetrade spezifische Barcode-kompatibel ist. Wir beschäftigen eine Restriktions-assoziierten DNA-Tag-Sequenzierung (RAD-Seq) 6 Methode, die Genom-Sequenzierung, um spezifische Restriktionsstellen 1 leitet, wodurch eine konsistente 2-3% des Genoms von Nachkommen der Stämme sowie die Erfassung der plasmidgetragenen Barcode . Die Erholung der Tetrade Beziehungen zusammen mit der empirisch abgeleiteten Genotypisierung Daten aus der Quer ermöglicht die genaue Rückschlüsse auf fehlende Informationen, einschließlich des Status von Markern mit geringer Sequenzabdeckung und das komplette Erbgut von nicht lebensfähig (und damit nicht behebbarer) Individuen. Hier beschreiben wir die Anwendung des Verfahrens in dem am häufigsten verwendeten Mikroorganismus für meiotischen Zuordnung der Hefe S. cerevisiae. jedoch mit geringfügigen Substitutionen von Organismus-spezifischen GrundHerren, z. B. verschiedene Sporulation-spezifische Proteine ​​mit GFP fusioniert ist, sollte das Verfahren ohne weiteres übertragbar auf andere Mikroorganismen, einschließlich Organismen, in denen meiotischen Zuordnung ist wesentlich arbeitsintensiv oder momentan unlösbar sein. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Abbildung 1. BEST-Methode. (A) Die pCL2_BC Plasmid ist ein 2-Mikron-Plasmid mit einer Sporenbildung spezifische GFP-Fusions, Resistenz gegen G418, und ein 15-mer Zufalls Barcode. Der Bau der Plasmid-Bibliothek wird in Ludlow et al 1 beschrieben. (B) Ein Pool von Barcode-Plasmide in die diploide Stamm aus einer Kreuzung umgewandelt. (C) Die Transformanten werden dann zur Auswahl gezüchtet und ~ 10.000 transformierten Kolonien werden vereinigt und mit Sporen. Während der Meiose jeweils Sporen einer Tetrade erbt eine Zusammenarbeitpy der Barcode-Plasmid. (D) Tetrads aus unsporulated Zellen durch FACS getrennt und auf Agar-Platten, wo sie verdaut werden und gestört, dass die einzelnen Sporen, um eine Kolonie zu bilden gesammelt. (E) Die Kolonien werden dann nahm in 96-Well-Platten, phänotypisiert und genotypisiert. Während Genotypisierung das Plasmid Barcode gelesen und verwendet werden, um die vier Mitglieder jeder Tetrade identifizieren. Diese Zahl hat sich von Ludlow et al 1 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Tetrad Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für Hefe-Genetik, aber die aufwändige manuelle Art des Verfahrens hat seine Anwendung auf großen Skalen behindert. Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) 1 ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden aufgrund einer Sporenspezifische GFP-Fusionsprotein, das Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Tetraden ermöglicht direkt auf Agar-Platten, wo der Ascus enzymatisch verdaut, und die Sporen zerstört werden und zufällig durch Glasperlenbeschichtung angeordnet. Die haploiden Kolonien werden dann Schwester Sporen Beziehungen zugeordnet, also Informationen darüber, welche Sporen stammten aus der gleichen tetrad, mit molekular Barcodes während Genotypisierung lesen. Durch das Entfernen der Flaschenhals der manuellen Zerlegung, können Hunderte oder sogar Tausende von Tetraden in Minuten isoliert werden. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung der erforderlich ist, um BEST in der Hefe durchzuführen experimentellen VerfahrenSaccharomyces cerevisiae, die mit einem heterozygoten diploiden Stamm durch die Isolierung von Kolonien aus der haploiden Nachkommen meiotischen abgeleitet.

BEST können die Geschwindigkeit, mit der Sporen von Tetraden isoliert werden können erheblich verbessern. Als ein Beispiel für den Durchsatz dieses Verfahren liefern kann, durchgeführt, ein Forscher die FACS-Sortierung und Trennung Sporen (Schritte 5.1 bis 6.3) mit 149-Agar-Platten in 3 h 1. Eine äquivalente Ausbeute (ca. 3.725 Tetraden) würden mehr als 90 Stunden der manuellen Zerlegung erfordert. Wie bei vielen Hochdurchsatzverfahren, die aktuelle Iteration des Verfahrens hat jedoch einen gewissen Verlust an Effizienz im Vergleich zur manuellen Dissektion. Dieser Verlust manifestiert sich als eine geringere Anzahl von Kolonien gewonnen, verglichen mit der Erwartung, berechnet auf der Basis der Lebensfähigkeit der Sporen der Quer durch manuelle Dissektion (Schritt 1.4) ermittelt. Unter der Annahme, dass die Ursachen der Sporen Verlust (Diskussion) beeinflussen Sporen zufällig kann Schätzungen, wie viele Kolonien gewonnen werden Mitglieder der Tetraden in dem 1, 2, 3 oder 4 Sporen wurden gewonnen (Fig. 4) ermöglicht werden. Abbildung 4. Simulation der Verfahren die Effizienz im Tetradenstadium Ebene. Nicht erfolgreiche Sporen zu erholen (wie Kolonien) kann aufgrund Sporen inviability, sporen Haftung auf den Glasperlen, das Versagen der Sporen voneinander zu trennen, etc. Die Binomialverteilung verwendet wurde um den erwarteten Anteil der Tetraden (mit mindestens einer erfolgreich wiederhergestellt Sporen) Herstellung von 4, 3, 2 oder 1 Kolonien bezogen auf den Anteil aller Sporen erfolgreich wiederhergestellt berechnen. Oder - 4 - Sporen Tetraden Dieser Graph kann als grobe Richtlinie für die Anzahl von Stämmen, die letztlich in 3 montiert werden dienen. Da die Anzahl der Kolonien pro Platte zunimmt, nimmt die Anzahl der vollständigen Tetraden gewonnen. In dem oben beschriebenen Experiment, 25 Tetraden aus einer Kreuzung mit Lebensfähigkeit der Sporen in der Nähe von 100% (wie detdurch manuelle Zerlegung ermined) wurden auf 1 149 Agar-Platten. In diesem Experiment wurde die maximale Anzahl von Kolonien pro Platte zu beobachten war 80, was anzeigt, dass 20 Sporen konnte diskrete Kolonien bilden. Die mittlere Anzahl der Kolonien pro Platte betrug 62. Kolonien von den Platten 61, die 65 oder mehr Kolonien wurden geerntet und sequenziert. Oder - 4 - Von den 3.700-Stämme, die Sequenzierung Qualitätskontrolle durchlaufen, könnten rechnerisch 72% in 3 zugeordnet werden Sporen Tetraden.

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BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.

BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Aufrufe.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet. 

Serie: BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Forschung

Biologie

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' Ende Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung mit A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

Bewertung der metabolischen Wirkungen des isokalorischen 2:1 Intermittierendes Fasten bei Mäusen

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

Erstellung robuster Bisulfit-mRNA-Bibliotheken für die transkriptomweite Kartierung

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA 5-methylcytosine modifications and the dysregulated expression of RNA methyltransferases have been shown to be associated with various diseases, including cancers. Transcriptome-wide bisulfite-sequencing was developed to characterize the positions and the quantitative cytosine methylation levels in the bisulfite-converted RNA at the base-pair resolution. Herein, this protocol presents the procedures of two rounds of poly(A) RNA purification, three cycles of bisulfite reaction, and library preparation in detail to allow the transcriptome-wide mapping of mRNA 5-methylcytosine modification sites. The assessment of RNA quantity and quality after the main reaction is essential to monitor RNA integrity and is a critical step for ensuring high-quality sequencing libraries. Ideally, the procedures can be completed within three days. With this protocol, using high-quality total RNA as the input can practically build up robust bisulfite-mRNA libraries for next-generation sequencing from the sample of interest.

Autor im Rampenlicht: Die Rolle der Entschlüsselung der RNA-Methylierung bei Bauchspeicheldrüsenkrebs - Eine Studie mit Einzelbasenauflösung 

This protocol provides an easy-to-follow workflow to conduct poly(A) RNA purification, bisulfite conversion, and library preparation using standardized equipment for a biological sample of interest.

Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...