Wir bedanken uns bei Ron Davis, Adam Deutschbauer, und die ganze HIP HOP Labor an der University of Toronto für Gespräche und Beratung. CN wird durch Zuschüsse aus dem National Human Genome Research Institute (Grant Number HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, und der kanadischen Krebsgesellschaft (# 020380) unterstützt. JO wurde von der Stanford Genome Training Program (Grant Number T32 HG00044 vom National Human Genome Research Institute) und die National Institutes of Health (Grant Number P01 GH000205) unterstützt. GG wird durch die NHGRI RO1 HG003317 und der kanadischen Krebsgesellschaft, Grant # 020380, TD und der Donnelly Sequencing Center unterstützt wird zum Teil durch Zuschüsse aus dem kanadischen Stiftung für Innovation zu Drs unterstützt. Brenda Andrews und Jack Greenblatt. AMS wird von der Universität von Toronto öffnen Fellowship unterstützt.

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	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier erörtern wir ein Protokoll, mit bescheidenen Modifikation, leicht zu einer Vielzahl von bestehenden Sammlungen von Barcode-Mutante Sammlungen von verschiedenen Mikroorganismen getaggt mutierten Sammlungen erstellen angepasst werden kann. Wir betonen, dass wir zwar ein Protokoll über den markierten Transposon-Mutagenese haben berichtet, für den humanpathogenen Hefepilz C. albicans, ein sehr ähnliches Protokoll könnte zu einer Vielzahl von einzelligen Pilze angepasst werden. Geändert arbeitet dieses Protokoll auch in Bakterien 13, und derzeit Kollektionen für eine Reihe von zusätzlichen Pilz-und bakterielle Genome sind im Bau. Derzeit bietet dieser Test die einzige umfassende, genomweite unvoreingenommene Bildschirm für die Gen-kleine Molekül-Wechselwirkungen. Eine besonders nützliche Funktion des Tests ist, dass keine Vorkenntnisse des Gens oder kleines Molekül erforderlich ist. Trotz des Umfangs und der Macht dieser Tests hat ihre Übertragbarkeit auf andere Labors wurde ein wenig durch die Erstinvestition und Informatik-Werkzeuge für die Analyse der Ergebnisse erschwert. Mit der Verabschiedung der nächsten Generation Reihenfolge Auslesen mit robuster Werkzeuge für die Analyse kombiniert, erwarten wir ihre Annahme zu erhöhen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibiotika </td><td> Hersteller und Katalog-Nummern </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Sigma, Teil # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Sigma, Teil # K1876 </td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Sigma, Teil # S0692 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> Sigma, Teil # C0378 </td></tr><tr><td> DNA Clean-up und die Konzentration Kits </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, Teil # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit </td><td> Qiagen, Teil # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, Teil # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, Teil # 28704 </td></tr><tr><td> PCR und Elektrophorese-Reagenzien </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase (Mg-free) Buffer </td><td> New England Biolabs, Teil # M0320L </td></tr><tr><td> Desoxynukleotid Lösung Mix </td><td> New England Biolabs, Teil # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, Teil # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose, Loading-Farbstoff und Nukleinsäure-Fleck geeignet für Gel-Elektrophorese </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 10x TAE-Puffer </td><td> Sigma, Teil # T8280 </td></tr><tr><td> 1 Kb Plus-DNA Ladder </td><td> Invitrogen, Teil # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD Brühe </td><td></td></tr><tr><td> 10 g Hefe-Extrakt </td><td> Sigma, Teil # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g Bacto Pepton </td><td> BD Biosciences, Teil # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g Dextrose </td><td> Sigma, Teil # D9434 </td></tr><tr><td> Labware </td><td></td></tr><tr><td> Mehrkanalpipetten (1000, 200, und 20 ul) </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Einweg Pipettieren Stauseen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 15 und 50 mL Zentrifugenröhrchen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> 96 - und 384-Well Deep Well Platten </td><td> Axygen Scientific, Teil # P-2ML-SQ-CS &amp; P-384240SQCS </td></tr><tr><td> 96-well und 384-well PCR-Platten und Dichtung Film </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Plattenroller zur Abdichtung Multi-Well-Platten </td><td> Sigma, Teil # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C und 37 ° C Schüttelinkubatoren für den Anbau von Bakterien und Hefen auf Platten und in Rohren </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> In-vitro-Transposon-Mutagenese </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 Transposase </td><td> Epicentre Biotechnologies, Teil # TNP92110 </td></tr><tr><td> High-Throughput-Transformation </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit </td><td> Edge-Biosystems, Teil # 84359 </td></tr><tr><td> Polyethylenglykol, Molekulargewicht 3350 </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Lithiumacetat </td><td> Sigma, Teil # 517992 </td></tr><tr><td> 6-Well-Platten, steril </td><td> Corning, Teil # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / mL Uridin </td><td> Sigma, Teil # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA-Pufferlösung </td><td> Sigma, Teil # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Lachs testis DNA </td><td> Sigma, Teil # 1626 </td></tr><tr><td> Das Wachstum der Barcode-Sammlungen </td><td></td></tr><tr><td> 48-Well-Platten, wenn wachsenden Kulturen in Platten </td><td> Greiner, Teil # M9437 </td></tr><tr><td> Klebeplatte Dichtungen </td><td> ABgene, Teil # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml Kulturflaschen </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Spektrophotometer für die Absorption </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Temperaturgeregelte Schüttler für 250 ml Flaschen oder Schütteln Spektralphotometer </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL </td><td> Eppendorf, Teil # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hybridisierung Ausrüstung </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisierungsofen 640 </td><td> Affymetrix, Teil # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic-Station 450 </td><td> Affymetrix, Teil # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, Teil # 00-0212 </td></tr><tr><td> Kochenden Wasserbad mit schwimmenden Rack </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Hybridisierung Verbrauchsmaterialien </td><td></td></tr><tr><td> Genflex Tag 16K Array v2 </td><td> Affymetrix, Teil # 511331 </td></tr><tr><td> Denhardt-Lösung, 50X Konzentrat </td><td> Sigma, Teil # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin, R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE) </td><td> Invitrogen, Teil # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL </td><td> Eppendorf, Teil # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversified Biotech, Teil # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> BioRad, Teil # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% Tween </td><td> Sigma, Teil # T2700 </td></tr><tr><td> MES free-Monohydrat </td><td> Sigma, Teil # M5287 </td></tr><tr><td> MES Natriumsalz </td><td> Sigma, Teil # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, Teil # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> Sigma, Teil # S2015 </td></tr><tr><td> Molekularbiologie Wasser </td><td> Sigma, Teil # W4502 </td></tr><tr><td> Hybridisierung Primer </td><td> Verschiedene Anbieter (Standard Entsalzung) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;Biotin-GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;Biotin-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;Biotin-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Sequenzierungsprimern: Illumina Plattform </td><td> Verschiedene Anbieter </td></tr><tr><td> UpTag Sturm (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Sturm (100um) </td><td> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3 &quot; </td></tr><tr><td> DownTag Reverse (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 ` </td></tr><tr><td> Lesen Sie 1 UP-tag seq-Primer (100 um) </td><td> 5 &#39;GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lesen Sie 1 AB-tag seq-Primer (100 um) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lesen Sie 2 Index-Sequenzierung Primer (Standard Illumina R1 Primer) (100 um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Zusätzliche Sequencing Reagenzien / Equipment </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF PCR Purification Kit </td><td> Qiagen, Teil # 29051 </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Jeder Anbieter </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel Vacuum Manifold </td><td> Macherey-Nagel, Teil # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit </td><td> Invitrogen, Teil # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit Teströhrchen </td><td> Invitrogen, Teil # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% Acrylamid plus 1% N, N&#39;-Methylen-bis-Acrylamid, 37,5:1 </td><td> Bio Rad, Teil # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, Teil # T1503-1KG </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Sigma, Teil # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, Teil # E0306 </td></tr><tr><td> Ammoniumpersulfat </td><td> Sigma, Teil # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop, Teil # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromidlösung </td><td> BioShop, Teil # ETB444.10 </td></tr><tr><td> 0,5 M Ammoniumacetat </td><td> Teknova, Teil # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM Magnesium-Acetat-Tetrahydrat </td><td> Sigma, Teil # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Siehe 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Natriumacetat, pH 5,2 </td><td> Teknova, Teil # S0297 </td></tr><tr><td> Speed-Vakuum </td><td> Verschiedene </td></tr><tr><td> Single-Read Cluster-Generation Kit </td><td> Illumina, part # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Sequencing Kit v4 </td><td>Illumina, part # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10x TBE Rezept <table border="1"><tbody><tr><td> Beträge </td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 108 Gramm </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 Gramm </td><td> Borsäure </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Add dH 2 O auf 1L markieren </td></tr></tbody></table> 12% Polyacrylamidgel Rezept <table border="1"><tbody><tr><td> Volumes </td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% Acrylamid plus 1% N, N&#39;-Methylen-bis-Acrylamid, 37,5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> 10x TBE </td></tr><tr><td> 140 ul </td><td> 10% Ammoniumpersulfat </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: 20 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag Primer-Mix: Resuspendieren Uptag und Buptagkanmx4 jeweils in ddH 2 O bei 100 nM, dann in einem Verhältnis von 1:1 mischen für eine Endkonzentration von 50 uM jeder. Lagerung bei -20 ° C. Downtag Primer-Mix: Resuspendieren Dntag und Bdntagkanmx4 jeweils in ddH 2 O bei 100 nM, dann in einem Verhältnis von 1:1 mischen für eine Endkonzentration von 50 uM jeder. Lagerung bei -20 ° C. Mixed-Oligonukleotide: Resuspendieren jedem der folgenden acht Oligos (Standard entsalzt) in ddH 2 O bei 100 uM: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mix ein gleiches Volumen der acht Oligonukleotide für eine Endkonzentration von 12,5 uM jeder. 12X MES Lager: Für 10 ml, lösen sich 0,7 g MES free-Monohydrat und 1,93 g MES Natriumsalz in 8 ml Molekularbiologie Wasser. Nach dem Mischen gut, pH-Wert prüfen und einstellen, wenn bis zu einem pH von 6,5 bis 6,7 erforderlich. Fügen Sie Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 10 ml. Filter sterilisiert und bei 4 ° C vor Licht (zB Wickeln Sie das Rohr in Folie) geschützt. Ersetzen Sie, wenn Lösung wird sichtbar gelb oder nach 6 Monaten. 2X Hybridisierungspuffer: Für 50 ml, Mix 8,3 ml 12X MES Lager (ab 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Tween 20 (vol / vol) und 19,9 ml gefiltert ddH 2 O. Filter sterilisieren. Wash A: 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 699 ml ddH 2 O. Filter sterilisieren. Wash B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 849 ml ddH 2 O. Filter sterilisieren. Barcode Sequenzierungsprimern In UP-tag Primersequenzen die 5 &#39;tail (fett) sind Illumina Adapter-Sequenzen in der F-und R-Primer enthalten. Die variable Sequenz (kursiv) stellt die 5-mer Indizierung Tag in Multiplexen / index Auslesen verwendet. Die 3 &#39;tail (unterstrichen) vertritt die gemeinsamen Primer flankieren die uptag Barcode und wird benötigt, um die Hefe Barcodes zu verstärken. In AB-tag Primersequenzen der 5 &#39;Schwanz ist identisch mit 5&#39; Schwanz des UP-tag-Primer (Illumina bestimmten Reihenfolge), aber die 3 &#39;tail (unterstrichen) ist mit dem Gemeinsamen Primer, die verwendet werden, um die Verstärkung ersetzt DOWN- tag Barcodes.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

Durch Fortschritte in der Sequenzierung der nächsten Generation Technologien haben wir Zugang zu neuen Genom-Sequenzen fast täglich. Das Tempo dieser Fortschritte ist die Beschleunigung, vielversprechende größere Tiefe und Breite. In Anbetracht dieser außergewöhnlichen Fortschritte, wird die Notwendigkeit für eine schnelle, parallele Methoden zur Gen-Funktion zu definieren immer mehr an Bedeutung. Sammlungen von genomweiten Deletionsmutanten in Hefe und E. coli wurden als Arbeitstiere für die funktionelle Charakterisierung der Genfunktion serviert, aber dieser Ansatz ist nicht skalierbar, erfordern aktuelle Gen-Deletion Ansätze jeder der Tausenden von Genen, die ein Genom zu löschen und überprüft werden sollen, umfassen. Erst nachdem diese Arbeit abgeschlossen ist können wir verfolgen, High-Throughput-Phänotypisierung. In den vergangenen zehn Jahren hat unser Labor ein Portfolio von wettbewerbsfähigen, miniaturisierte, High-Throughput-genomweite Tests, die in parallel ausgeführt werden können, verfeinert. Diese Parallelisierung ist wegen der Aufnahme von DNA &#39;Tags&#39; oder &#39;Barcodes, &quot;in jeder Mutante möglich, mit dem Barcode dient als Proxy für die Mutation, und man kann den Barcode Fülle Maßnahme zur mutierten Fitness zu bewerten. In dieser Studie wollen wir die Lücke zwischen DNA-Sequenz und Barcode-Mutante Sammlungen zu füllen. Um dies zu erreichen führen wir eine kombinierte Störung Transposon-Barcoding Ansatz, der sich öffnet parallel Barcode-Assays neu sequenziert, aber schlecht charakterisiert Mikroben. Zur Veranschaulichung dieses Ansatzes präsentieren wir eine neue Candida albicans Barcode Störungen Sammlung und beschreiben, wie beide Microarray-basierte und Sequenzierung der nächsten Generation-Plattformen verwendet werden kann auf 10.000 zu sammeln - 1.000.000 Gen-Gen-und Drogen-Gen-Interaktionen in einem einzigen Experiment.

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Aufrufe.  University of Toronto. Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.