We thank Janice Fischer for providing the UAS-EGFP::Msp-300KASH plasmid. The mAB24B10 antibody was obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by the University of Iowa, Department of Biology. The repo-GAL4 stock (BL7415) was obtained from the Bloomington Stock Center at Indiana University. Support from the American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53) to the Purdue University Center for Cancer Research is gratefully acknowledged. Jingqun Ma is supported by an Agricultural Research at Purdue Assistantship in Food and Agriculture from Purdue University.

1. Erzeugung und Charakterisierung von EGFP :: Drosophila KASH <ol><li> Kreuz Gal4-Treiber fliegt UAS-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt. Alternativ können rekombinante Fliegen, die sowohl die Gal4-Treiber und den UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen tragen mit Standard-genetische Techniken erzeugt werden. Dieser zweite Ansatz ist vorteilhaft, wenn eine große Zahl von Nachkommen erforderlich sind. </li><li> Charakterisierung der Expression des EGFP :: KASH Marker mit Standard-Mikroskopie-Techniken. Hinweis: EGFP-Expression kann durch Standardtechniken in der Mikroskopie präpariert, fixiert Drosophila Geweben beobachtet werden, ganz oder Larven, und die Verwendung eines Antikörpers nicht erforderlich. <ol><li> Bestimmen Sie die Expressionsmuster der EGFP :: KASH Marker im gesamten Organismus unter einem Fluoreszenzmikroskop seziert (siehe Materialien PDF). Hinweis: Viele Gal4 Treiber, darunter auch der in Abbildung 1 dargestellt Repo-GAL4-Treiber, Ausstellungs nonspecific Expressionsmuster in anderen Larvengewebe wie der Speicheldrüse (siehe Ergebnisse). </li><li> Analysieren Sie den EGFP :: KASH Expressionsmuster in der sezierten Gewebe von Interesse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. <ol><li> Fix das Gewebe von Interesse unter Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 4%, und DNA mit DAPI-Färbung in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, um die Lokalisation des EGFP :: KASH Tag bezogen auf DNA sichtbar. </li><li> Erwerben Sie Bilder entweder mit einem 40X / 1,30 Ölimmersionsobjektiv oder ein 20X / 0,75 Ölimmersionsobjektiv, abhängig von der Größe des Gewebes von Interesse. Die folgenden Anregung / Emissionsbedingungen können für die Bildaufnahme verwendet werden: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525 bis 550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolieren Kerne von Drosophila Larven Gewebe <ol><li> Bereiten Ausrüstung für die Larven Gewebedissektion Kerne und anschließende Isolation. Beachten Sie, dassganze dechorionated Embryonen können auch als Ausgangsmaterial verwendet werden, falls gewünscht. Es wird empfohlen, teilweise zerlegt Larven Gewebe statt ganzer Larven verwenden, wenn der Zelltyp von Interesse in einem spezifischen Gewebe, wie Imaginalscheibe vorliegt. Dies reduziert die unspezifische Bindung und beseitigt Probleme, die durch die Expression von Gal4 Treiber in einigen Nicht-Zielzellen verursacht werden können auch. <ol><li> Bereiten Sie zwei Paar scharfe Zange (siehe Materialien PDF), eine silikonisierte 9-Loch-Glasplatte (siehe Materialien PDF) und PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% Tween-20). </li><li> Vorausbindung der GFP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen. Dieser Schritt vor Beginn der Präparation begonnen werden. Werden 10 ul der magnetischen Beads (Invitrogen, siehe Materialien PDF) und 2 ug des GFP-Antikörper (Roche, siehe Materialien PDF) zu 400 &amp;mgr; l Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2) in einem 1,5-ml-Röhrchen . Die Menge an Perlen und Antikörper verwendet werden, können gegebenenfalls auf der Grundlage der Menge an Target in der sam optimiertPLE und die Bindungsaffinität des Antikörpers an die Beads. </li><li> Inkubieren der Kügelchen und der Antikörper mit einer Drehung von mindestens 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen und Antikörper in der Magnetstange (siehe Materialien PDF) und lassen Sie die Perlen auf die Magnet für ca. 1-2 min zu binden. Entfernen Sie den Überstand, der nicht gebundenen Antikörper und Waschpuffer mit einer 1 ml Pipette. Die Perlen bleiben an der Wand des 1,5 ml-Röhrchen auf der Seite benachbart zu dem Magneten gebunden. </li><li> Zweimal spülen Sie die Beads mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen aus der Magnetstange und kurz umzukehren, um die Perlen zu mischen und Waschpuffer bei jedem Waschschritt. </li><li> Bewahren Sie die Antikörper-gebundenen Perlen in Waschpuffer, bis bereit, mit Schritt 2.7 fort. Die Kügelchen sollten nicht in jeder Phase des Protokolls austrocknen. </li></ol></li><li> Dissect Larvengewebe in PBT und übertragen seziert Gewebeeine Vertiefung der 9-Loch-Schale. Typischerweise Dissektion der optischen Loben und Augen Imaginalscheibe 100 dritte Larvenstadium bietet genügend Material für Downstream-Genexpressionsanalyse folgende Kerne Isolation. </li><li> Spülen des isolierten Gewebes in Kernextraktionspuffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Übertragen isoliert Larvengewebe zu einer 1 ml Dounce Homogenisator (siehe Materialien PDF) auf Eis, 1 ml frisches Kernextraktionspuffer enthält. Inkubieren auf Eis für 5 min. Es ist nicht notwendig, um die Proteaseinhibitoren zuzusetzen, wenn RNA wird zu folgenden Kerne Isolierung gewonnen werden. </li><li> Stören das Gewebe durch 20 Schläge mit dem losen Stampfe und dann inkubieren Sie die Probe auf Eis für 10 Minuten, damit die Zellen zu schwellen. Extrahieren Sie die Kerne aus den Zellen mit 15 Schläge mit der engen Stößel. Die Anzahl der Schläge mit der locker und fest stampfen muss für die verschiedenen Geweben und Zelltypen optimiert werden, überschüssige Homogenisierung kann dazu führen,geschert Kerne, während unzureichende Homogenisierung werden alle Atomkerne aus dem Gewebe nicht extrahieren. </li><li> Filtern Sie die Homogenat, die die Kerne und Zelltrümmer enthält, durch ein 40 um Porengröße Sieb (siehe Materialien PDF), die mit der Kern Homogenisationspuffer vorgespült wurde. Sammeln Sie die gefilterten Homogenat in ein frisches Röhrchen. </li><li> Sammeln Sie vor Isolation Proben für die spätere Analyse, um Kerne Ertrag, Kerne Integrität zu bestimmen und Transkript Ebenen von Zielgenen vor der Isolierung Kerne zu bestimmen. <ol><li> Über 50 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Dies ist die Pre-Isolation Probe. In 500 ul Trizol-Reagenz (siehe Materialien PDF, VORSICHT), Invertzucker zu mischen, und bei -20 ° C für spätere RNA-Isolierung (Schritt 3.1). </li><li> Über 20 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Tube. <ol><li> Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, und incUbate Probe auf Eis für 10 min. </li><li> Übertragen DAPI-gefärbten Zellkernen an eine Poly-Lysin beschichtete Deckglas, und legen auf einen Objektträger. Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Überprüfen Sie die Kerne Integrität und Gegenwart von GFP-markierten Kerne von Interesse unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Es ist nicht notwendig, um die Kerne zu beheben, oder für GFP Fleck, wenn diese Folien sind recht schnell nach der Herstellung (innerhalb 24 Stunden) analysiert. </li></ol></li><li> Über 10 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 90 ul Waschpuffer (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2). Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml und Inkubation auf Eis für 10 min. Bestimmen Sie die Kerne Ausbeute in der Pre-Isolation Probe mit einer Zählkammer die DAPI-positiven Kerne rechnen mit Epi-Fluoreszenz unter einem 10X Luft Ziel. </li></ol></li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Kügelchen (in Abschnitt 2.1.6) hergestellt in einem magnetischen Träger,und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Antikörper-gebundenen Perlen mit einer 1 ml-Pipette, und fügen Sie die gefilterten Homogenat aus Schritt 2,5 bis 1,5-ml-Röhrchen mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig mehrmals zu mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min mit end-over-end Aufregung. Vermeiden Sie Luftblasen in die Röhre, wenn möglich, da diese in Verklumpung der Kerne führen. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Perlen und Homogenat in einem Magnetständer, und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie das Homogenat mit der ungebundenen Fraktion Kerne mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Waschen der Probe 3x mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen, gebunden Kernen und Waschpuffer aus dem Rack und invertieren mehrmals zu mischen, dann das Rohr in der magnetischen Rack wie beschriebenin Schritt 2.9 und den Überstand mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Mit 150 ul Waschpuffer zu den Kügelchen, die den Targetkerne gebunden sein sollte. Dies ist die post-Isolierung Probe. Bereiten Proben für die Mikroskopie-Analyse und anschließende RNA-Extraktion. <ol><li> Über 20 ul der Post-Isolierung Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Fleck mit DAPI und zu analysieren, wie in Abschnitt 2.6.2 beschrieben. Zählen Sie die GFP + / DAPI + und + GFP-/DAPI Kerne durch magnetische Kügelchen eingefangen, um die Reinheit der angereicherten GFP +-Kerne in der Post-Isolierung Probe zu bestimmen. </li><li> 1 ml Trizol-Reagenz, um den Rest des Post-Isolierung Probe, kehren zu mischen, und bei -20 ° C für die anschließende RNA-Isolierung (Schritt 3.1). Anmerkung: Die Proben in Trizol kann mehrere Wochen falls bei -20 ° C gelagert werden Es ist nicht notwendig, um die Kerne von den magnetischen Kügelchen vor RNA-Extraktion mit Trizol-Reagenz zu eluieren, because die Perlen nicht mit der nachfolgenden RNA-Isolierung stören. </li></ol></li></ol> 3. Bestimmen Transcript Levels in Nuclei Isoliert von Larven Gewebe <ol><li> Isolieren von RNA aus der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben in den Abschnitten 2.6.1 und 2.11.2 unter Verwendung des für Trizol-basierte RNA-Extraktion beschriebenen Standardprotokoll (siehe Materialien PDF) mit den folgenden Modifikationen hergestellt: <ol><li> Nach Fällung der RNA-Pellet, fügen 19,2 ul RNase-freies Wasser und 0,8 ul RNASecure Reagenz (siehe Materialien PDF) zum Pellet und Inkubation bei 60 ° C für 20 min auf RNAsen zu inaktivieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem fluoreszierenden Farbstoff-RNA-Bindung wie der Qubit-RNA-Assay-Kit (siehe Materialien PDF) mit dem QubitR 2.0 Fluorometer nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Synthese von cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase Verstärkung wie der EpiScript Reverse Transkriptase-Kit und oligodT Primer nach Herstellerangaben. Anmerkung: In der Regel werden 50 bis 100 ng RNA erzeugt ausreichend cDNA durchzuführen multiplen Genexpression analysiert. Äquivalente Mengen von Pre-und Post-Isolation RNA-Isolation verwendet, um cDNA zu erzeugen. </li><li> In 180 ul Nuklease-freies Wasser auf die 20 ul cDNA-Probe, um diese 10-fach vor der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) Analyse zu verdünnen. Diese Verdünnung ist ein wichtiger Schritt, denn unverdünnten cDNA-Proben können die qPCR hemmen. </li><li> Bereiten Sie eine qPCR Master Mix mit Polymerase und dNTPs, jeweils von Vorwärts-und Rückwärts-4 pmol Primer, gebildet mit sterilem Wasser auf die endgültige Reaktionsvolumen von 20 ul. <ol><li> Gestalten Sie qPCR-Primer, um Gene, die voraussichtlich in der Zelltyp von Interesse ausgedrückt werden gezielt und in der Entwicklungsphase, bei der das Gewebe gesammelt. Design-Primer eine Intron überspannen, wenn möglich, so daß genomische undcDNA-PCR-Produkten unterschieden werden. Hinweis: Wenn das Genexpressionsprofil der Zielzelltyp nicht bekannt ist, gegen eGFP Primern, die spezifisch in dem markierten Keimpopulation exprimiert werden soll, kann verwendet werden, um das Protokoll für einen bestimmten Zelltyp und Gewebe (Tabelle 1) zu optimieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die relativen Transkript-Gehalte von jedem Gen von Interesse in der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben durch Vergleich mit einer Verdünnungsreihe von cDNA aus dem gesamten Gewebe hergestellt. Transcript Ebenen von Zielgenen sollte zu einem Referenzgens wie Rpl32 (oder besser mehrere Referenzgene) normalisiert werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

This protocol can be used to isolate or highly enrich specifically tagged nuclei from mixed cell populations in Drosophila embryonic or larval tissues. Using this protocol, nuclei can be isolated from dissected tissues in approximately 1 hr. The purity and yield of the isolated nuclei must be experimentally determined for each cell type. It can be difficult to quantify the bead-bound nuclei at the post-isolation stage of the protocol using a hemocytometer because of the beads present in the sample. Thus, if exac...

Drosophila-Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem enthalten ein komplexes Gemisch von Zelltypen. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, ist es zunächst notwendig, eine homogene Population von spezifischen Zellen in ausreichenden Mengen zu isolieren, um Downstream-Anwendungen zu ermöglichen. Verfahren, um Zellen von intakten Geweben zu isolieren, umfassen Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von ganzen Zellen. Während FACS wurde verwendet, um Zellen und Zellkerne von Drosophila-Embryonen und aus Caenorhabditis elegans zur Genexpression und Chromatin Profilierung 1-3 isolieren kann FACS und Laser Mikrodissektion schwierig sein, in Geweben, die stark vermischten Zelltypen oder enthalten, dass die Zellen mit enthalten, erfolgreich durchführen unregelmäßige Morphologie, wie Neuronen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, können Kerne anstatt Zellen aus spezifischen Zelltypen isoliert und für die nachfolgende Generation verwendet werden,e Expression Profiling. Wichtig ist, Microarray-basierte mRNA-Expressionsanalyse, die Kern RNA-Proben zeigt allgemein vergleichbare Ergebnisse bei der Verwendung von Gesamt-RNA, 4, 5 durchgeführt. Darüber hinaus hat die Genexpressionsanalyse mit Kern-RNA wurde erfolgreich eingesetzt, um die Genexpression in mehreren Organismen einschließlich C. studieren elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila und Menschen 4, 5 2, 3. Mehrere Ansätze wurden kürzlich für die Isolierung von spezifischen Populationen von markierten Kerne aus Drosophila Gewebe, geeignet für Genexpressionsanalyse und / oder Chromatinimmunpräzipitation sind beschrieben worden. Die Batch-Isolierung von Gewebe-spezifische Chromatin für die Immunpräzipitation (BiTS-Chip-) Verfahren nutzt FACS festen Kerne auf der Basis von Zelltyp-spezifische Expression von Kern lokalisierte GFP 2 isolieren. Dieser Ansatz war successfully verwendet, um die Verteilung von Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation von isolierten Kernen aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen 2 analysieren. Jedoch kann FACS-basierte Ansätze zur Isolierung markierten Kerne, die nur einen geringen Anteil an einer gemischten Population aufgrund der erhöhten Zeitaufwand für die Art geeignet Nummern für Downstream-Anwendungen zu erhalten, machen weniger geeignet sein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Gruppen Affinitäts-Isolationstechniken genutzt werden, um Kerne, die mit einem bestimmten Epitop in einem bestimmten Zelltyp gekennzeichnet sind, zu reinigen. Die Isolierung von Zellkernen in spezifischen Zelltypen (intakt) Verfahren zur Verwendung in Arabidopsis thaliana 6, 7 entwickelt markiert wurde kürzlich für die Verwendung in Drosophila 8 angepasst. Bei diesem Verfahren ist eine Kernhülle Fusionsprotein, das ein Substrat für die in vivo-Biotinylierung coexpressed mit dem Escherichia coli Biotinligase BirA in bestimmten Zelltypen. Biotin-markierte Kerne kann anschließend von Mischpopulationen unter Verwendung von Streptavidin-basierte Affinitätsisolierung gereinigt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden Kerne erfolgreich markiert und aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen, in dem eine Kernhülle-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Mesoderm-spezifischen Enhancer exprimiert 8 isoliert. Die Autoren erzeugten Kernhüllenfusionsproteine, die in jedem Zelltyp unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS 9 ausgedrückt werden kann. Dieser Ansatz ist in der Lage, schnell zu isolieren Teilmengen von markierten Kerne von Mischpopulationen, erfordert aber drei separate transgene Konstrukte und kann daher für bestimmte genetische Anwendungen ungeeignet sein. Vor kurzem wurde ein Ansatz beschrieben, bei dem so (S ad1 und UN-C-84)-Domäne enthalten Proteine, die an der inneren Membran der Kernhülle zu lokalisieren, wurden mit dem Stichwortfluoreszierende Proteine ​​und unter der Steuerung des Systems 10 GAL4/UAS ausgedrückt. Kerne wurden in Gegenwart von nichtionischen Detergens isoliert, um die äußere Membran von der Kernhülle zu entfernen, und affinitätsgereinigt unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Anti-GFP-Antikörper gekoppelt. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um kleine Populationen von markierten Kerne von spezifischen neuronalen Subtypen im erwachsenen Gehirn von Drosophila 10 zu isolieren. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung der markierten Kerne aus einer gemischten Population von Zellen von Drosophila-Larven Gewebe beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, unabhängig, aber ist ähnlich dem von Henry et al. 10 zuerst beschriebenen Ansatz wurden Kerne mit einer fluoreszierenden Markierung, die nur in bestimmten Zelltypen in Drosophila exprimiert wird, um die anschließende Trennung von markierten Kerne aus gemischten Populationen erleichtern markierten mit einer Affinität-basierten Ansatz. Um Keime zu kennzeichnen,die KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology)-Domäne wurde eingesetzt. Die KASH Domäne eine Transmembrandomäne, die an die äußere Membran der Kernhülle, teilweise durch Wechselwirkung mit SUN-Domäne enthaltenden Proteinen innerhalb der perinukleären Raum 11 lokalisiert. Die C-terminale Domäne von KASH Proteine ​​wie Drosophila Msp-300 und Klarsicht verankert diese Proteine ​​an der äußeren Kernmembran, während die N-terminalen Domänen interagieren mit Cytoskelett-Proteine ​​wie Aktin oder Mikrotubuli im Zytoplasma 12-14. Konstrukte wurden erzeugt, in dem die KASH Domäne von Drosophila Msp-300 wurde unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS in der pUAST attB-Vektor 15, 16 an den C-Terminus von EGFP fusioniert. Mit phiC31 ortsspezifische Integration wurden transgene Fliegen erzeugt, in dem die UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen wurde in der attP2 Loci auf Chromosom eingefügt3L 17. Die FH-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt mit Fliegen, die das Gal4-Treiber zum Ausdruck in einem bestimmten Zelltyp, was die gezielte Expression von EGFP auf der äußeren Kernmembran in den Zelltyp von Interesse überquert werden. Markierte Kerne können dann aus gemischten Zellpopulationen mit Antikörpern gegen GFP an magnetische Kügelchen gekoppelt gereinigt werden. In diesem Ansatz wird die Verwendung von nichtionischen Detergens nicht erforderlich, da das EGFP-Tag an der zytoplasmatischen Seite der äußeren Kernmembran lokalisiert, und ist daher für Antikörper zugänglich. Die unten beschriebene Protokoll kann zur Isolierung / bereichern EGFP-markierten Kerne von bestimmten Zelltypen in Drosophila Larvengewebe, um die Reinheit und Ausbeute der isolierten Zellkernen zu quantifizieren und Kern-RNA zu extrahieren geeignet für quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT werden -PCR) Genexpressionsanalyse. Die Isolierung und Reinigung von Affinität-Kerne (ohne tissuPräparation E) kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Ergebnisse dargestellt, die die Gliazellen Kerne erfolgreich vom Larvenoptischen Keule und Augen Imaginalscheibe isoliert werden und für nachfolgende Genexpressionsanalyse verwendet. Es ist zu erwarten, dass dieser Ansatz nützlich für die Isolierung / Anreicherung der markierten Kerne aus embryonalen und larvalen Geweben, in denen die Zielzellen weniger als 5% der Gesamtpopulation darstellen können. Alle Drosophila Aktien und Plasmide in dieser klinischen Studie sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich.

<table><tbody><tr><td>Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td></tr><tr><td>2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td></tr><tr><td>EpiScript Reverse Transcriptase</td><td>Epicentre</td><td>ERT12910K</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf&quot;&gt;http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Falcon cell strainers, 40 &amp;mu;m pore size</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td></tr><tr><td>Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini tube rotator</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit starter kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. &lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf&quot;&gt;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td></tr><tr><td>RT-PCR machine Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized 9-well glass plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier</td><td>Nightsea</td><td></td><td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td></tr><tr><td>StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. &lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf&quot;&gt;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Drosophila melanogaster und embryonalen Geweben der Larven enthalten oft ein sehr heterogenes Gemisch von Zelltypen, die die Analyse der Genexpression in diesen Geweben erschweren kann. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, kann es notwendig sein, bestimmte Zelltypen mit hoher Reinheit und in Ausbeuten ausreichend für nachfolgende Anwendungen wie Transkriptionsprofiling und Chromatin-Immunopräzipitation isoliert. Jedoch kann die unregelmäßige Zellmorphologie in Geweben wie dem zentralen Nervensystem, verbunden mit der seltenen Population von spezifischen Zelltypen in diesen Geweben, Herausforderungen für herkömmliche Methoden der Zellisolierung wie Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung darstellen (FACS) . Hier wird ein alternativer Ansatz zur Charakterisierung zellspezifische Genexpressionsprofilen unter Verwendung von Affinitäts-basierte Isolierung von markierten Kerne, anstatt ganzer Zellen, beschrieben. Kerne in der spezifischen cell Art von Interesse sind genetisch mit einer Kernhülle lokalisierte EGFP-Tag mit der GAL4/UAS binären Expressionssystem gekennzeichnet. Diese EGFP-markierte Kerne können mit Antikörpern gegen GFP, die an magnetische Kügelchen gekoppelt sind, isoliert werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansatz ermöglicht eine konstante Trennung der Kerne von spezifischen Zelltypen in Drosophila Larven des zentralen Nervensystems bei hoher Reinheit und in ausreichenden Mengen für die Expressionsanalyse, auch wenn diese Zelltypen enthalten weniger als 2% der Gesamtzellpopulation in der Gewebe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Kerne aus einer Vielzahl von embryonalen und larvalen Drosophila Zelltypen mit spezifischen Gal4 Treiber zu isolieren, und kann zur Isolierung von Kernen von Zelltypen, die nicht geeignet für die FACS oder Laser Mikrodissektion werden können.

Der Repo-GAL4-Treiber (Bloomington Bestandsnummer 7415) ist speziell in Gliazellen im Nervensystem Drosophila an mehreren Entwicklungsstufen 18 ausgedrückt. Die Fliegen wurden erzeugt, stabil exprimieren UAS-EGFP :: Msp-300-KASH unter der Kontrolle des Repo-GAL4-Treiber mit Standard-genetische Techniken. Um das Expressionsmuster des Transgens EGFP :: KASH in dieser entfernt zu charakterisieren, wurde das Muster der GFP-Expression in den eingeschnittenen Lappens ...

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Affinitätsbasierte Isolierung markierter Kerne aus Drosophila-Geweben für die Genexpressionsanalyse | Biologie | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

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14.7K Aufrufe.  Purdue University.  Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden. 

Serie: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Forschung

Genetik

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Biologie

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Isolierung von Zellkernen aus kardialen Vorläuferzellen der Maus mit Einzelzellauflösung

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

Autor im Rampenlicht: Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Entwicklungsbiologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus

Zusammenfassung

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Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

Whole Berg RNA Fluorescent

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in