We thank Janice Fischer for providing the UAS-EGFP::Msp-300KASH plasmid. The mAB24B10 antibody was obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank developed under the auspices of the NICHD and maintained by the University of Iowa, Department of Biology. The repo-GAL4 stock (BL7415) was obtained from the Bloomington Stock Center at Indiana University. Support from the American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG #58-006-53) to the Purdue University Center for Cancer Research is gratefully acknowledged. Jingqun Ma is supported by an Agricultural Research at Purdue Assistantship in Food and Agriculture from Purdue University.

1. Erzeugung und Charakterisierung von EGFP :: Drosophila KASH <ol><li> Kreuz Gal4-Treiber fliegt UAS-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt. Alternativ können rekombinante Fliegen, die sowohl die Gal4-Treiber und den UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen tragen mit Standard-genetische Techniken erzeugt werden. Dieser zweite Ansatz ist vorteilhaft, wenn eine große Zahl von Nachkommen erforderlich sind. </li><li> Charakterisierung der Expression des EGFP :: KASH Marker mit Standard-Mikroskopie-Techniken. Hinweis: EGFP-Expression kann durch Standardtechniken in der Mikroskopie präpariert, fixiert Drosophila Geweben beobachtet werden, ganz oder Larven, und die Verwendung eines Antikörpers nicht erforderlich. <ol><li> Bestimmen Sie die Expressionsmuster der EGFP :: KASH Marker im gesamten Organismus unter einem Fluoreszenzmikroskop seziert (siehe Materialien PDF). Hinweis: Viele Gal4 Treiber, darunter auch der in Abbildung 1 dargestellt Repo-GAL4-Treiber, Ausstellungs nonspecific Expressionsmuster in anderen Larvengewebe wie der Speicheldrüse (siehe Ergebnisse). </li><li> Analysieren Sie den EGFP :: KASH Expressionsmuster in der sezierten Gewebe von Interesse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. <ol><li> Fix das Gewebe von Interesse unter Verwendung von Formaldehyd in einer Endkonzentration von 4%, und DNA mit DAPI-Färbung in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, um die Lokalisation des EGFP :: KASH Tag bezogen auf DNA sichtbar. </li><li> Erwerben Sie Bilder entweder mit einem 40X / 1,30 Ölimmersionsobjektiv oder ein 20X / 0,75 Ölimmersionsobjektiv, abhängig von der Größe des Gewebes von Interesse. Die folgenden Anregung / Emissionsbedingungen können für die Bildaufnahme verwendet werden: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525 bis 550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolieren Kerne von Drosophila Larven Gewebe <ol><li> Bereiten Ausrüstung für die Larven Gewebedissektion Kerne und anschließende Isolation. Beachten Sie, dassganze dechorionated Embryonen können auch als Ausgangsmaterial verwendet werden, falls gewünscht. Es wird empfohlen, teilweise zerlegt Larven Gewebe statt ganzer Larven verwenden, wenn der Zelltyp von Interesse in einem spezifischen Gewebe, wie Imaginalscheibe vorliegt. Dies reduziert die unspezifische Bindung und beseitigt Probleme, die durch die Expression von Gal4 Treiber in einigen Nicht-Zielzellen verursacht werden können auch. <ol><li> Bereiten Sie zwei Paar scharfe Zange (siehe Materialien PDF), eine silikonisierte 9-Loch-Glasplatte (siehe Materialien PDF) und PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% Tween-20). </li><li> Vorausbindung der GFP-Antikörper an die magnetischen Kügelchen. Dieser Schritt vor Beginn der Präparation begonnen werden. Werden 10 ul der magnetischen Beads (Invitrogen, siehe Materialien PDF) und 2 ug des GFP-Antikörper (Roche, siehe Materialien PDF) zu 400 &amp;mgr; l Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2) in einem 1,5-ml-Röhrchen . Die Menge an Perlen und Antikörper verwendet werden, können gegebenenfalls auf der Grundlage der Menge an Target in der sam optimiertPLE und die Bindungsaffinität des Antikörpers an die Beads. </li><li> Inkubieren der Kügelchen und der Antikörper mit einer Drehung von mindestens 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen und Antikörper in der Magnetstange (siehe Materialien PDF) und lassen Sie die Perlen auf die Magnet für ca. 1-2 min zu binden. Entfernen Sie den Überstand, der nicht gebundenen Antikörper und Waschpuffer mit einer 1 ml Pipette. Die Perlen bleiben an der Wand des 1,5 ml-Röhrchen auf der Seite benachbart zu dem Magneten gebunden. </li><li> Zweimal spülen Sie die Beads mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen aus der Magnetstange und kurz umzukehren, um die Perlen zu mischen und Waschpuffer bei jedem Waschschritt. </li><li> Bewahren Sie die Antikörper-gebundenen Perlen in Waschpuffer, bis bereit, mit Schritt 2.7 fort. Die Kügelchen sollten nicht in jeder Phase des Protokolls austrocknen. </li></ol></li><li> Dissect Larvengewebe in PBT und übertragen seziert Gewebeeine Vertiefung der 9-Loch-Schale. Typischerweise Dissektion der optischen Loben und Augen Imaginalscheibe 100 dritte Larvenstadium bietet genügend Material für Downstream-Genexpressionsanalyse folgende Kerne Isolation. </li><li> Spülen des isolierten Gewebes in Kernextraktionspuffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Übertragen isoliert Larvengewebe zu einer 1 ml Dounce Homogenisator (siehe Materialien PDF) auf Eis, 1 ml frisches Kernextraktionspuffer enthält. Inkubieren auf Eis für 5 min. Es ist nicht notwendig, um die Proteaseinhibitoren zuzusetzen, wenn RNA wird zu folgenden Kerne Isolierung gewonnen werden. </li><li> Stören das Gewebe durch 20 Schläge mit dem losen Stampfe und dann inkubieren Sie die Probe auf Eis für 10 Minuten, damit die Zellen zu schwellen. Extrahieren Sie die Kerne aus den Zellen mit 15 Schläge mit der engen Stößel. Die Anzahl der Schläge mit der locker und fest stampfen muss für die verschiedenen Geweben und Zelltypen optimiert werden, überschüssige Homogenisierung kann dazu führen,geschert Kerne, während unzureichende Homogenisierung werden alle Atomkerne aus dem Gewebe nicht extrahieren. </li><li> Filtern Sie die Homogenat, die die Kerne und Zelltrümmer enthält, durch ein 40 um Porengröße Sieb (siehe Materialien PDF), die mit der Kern Homogenisationspuffer vorgespült wurde. Sammeln Sie die gefilterten Homogenat in ein frisches Röhrchen. </li><li> Sammeln Sie vor Isolation Proben für die spätere Analyse, um Kerne Ertrag, Kerne Integrität zu bestimmen und Transkript Ebenen von Zielgenen vor der Isolierung Kerne zu bestimmen. <ol><li> Über 50 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Dies ist die Pre-Isolation Probe. In 500 ul Trizol-Reagenz (siehe Materialien PDF, VORSICHT), Invertzucker zu mischen, und bei -20 ° C für spätere RNA-Isolierung (Schritt 3.1). </li><li> Über 20 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Tube. <ol><li> Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml, und incUbate Probe auf Eis für 10 min. </li><li> Übertragen DAPI-gefärbten Zellkernen an eine Poly-Lysin beschichtete Deckglas, und legen auf einen Objektträger. Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Überprüfen Sie die Kerne Integrität und Gegenwart von GFP-markierten Kerne von Interesse unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: Es ist nicht notwendig, um die Kerne zu beheben, oder für GFP Fleck, wenn diese Folien sind recht schnell nach der Herstellung (innerhalb 24 Stunden) analysiert. </li></ol></li><li> Über 10 ul des gefilterten Homogenat in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 90 ul Waschpuffer (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl 2). Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 0,1 ug / ml und Inkubation auf Eis für 10 min. Bestimmen Sie die Kerne Ausbeute in der Pre-Isolation Probe mit einer Zählkammer die DAPI-positiven Kerne rechnen mit Epi-Fluoreszenz unter einem 10X Luft Ziel. </li></ol></li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Kügelchen (in Abschnitt 2.1.6) hergestellt in einem magnetischen Träger,und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Antikörper-gebundenen Perlen mit einer 1 ml-Pipette, und fügen Sie die gefilterten Homogenat aus Schritt 2,5 bis 1,5-ml-Röhrchen mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig mehrmals zu mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min mit end-over-end Aufregung. Vermeiden Sie Luftblasen in die Röhre, wenn möglich, da diese in Verklumpung der Kerne führen. </li><li> Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Antikörper-gebundenen Perlen und Homogenat in einem Magnetständer, und lassen sich die magnetischen Beads an der Magnet für mindestens 2 min zu binden, wie in Abschnitt 2.1.4 beschrieben. Entfernen Sie das Homogenat mit der ungebundenen Fraktion Kerne mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Waschen der Probe 3x mit 1 ml Waschpuffer jedes Mal. Entfernen Sie den 1,5-ml-Röhrchen mit den Perlen, gebunden Kernen und Waschpuffer aus dem Rack und invertieren mehrmals zu mischen, dann das Rohr in der magnetischen Rack wie beschriebenin Schritt 2.9 und den Überstand mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Mit 150 ul Waschpuffer zu den Kügelchen, die den Targetkerne gebunden sein sollte. Dies ist die post-Isolierung Probe. Bereiten Proben für die Mikroskopie-Analyse und anschließende RNA-Extraktion. <ol><li> Über 20 ul der Post-Isolierung Probe in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen und Fleck mit DAPI und zu analysieren, wie in Abschnitt 2.6.2 beschrieben. Zählen Sie die GFP + / DAPI + und + GFP-/DAPI Kerne durch magnetische Kügelchen eingefangen, um die Reinheit der angereicherten GFP +-Kerne in der Post-Isolierung Probe zu bestimmen. </li><li> 1 ml Trizol-Reagenz, um den Rest des Post-Isolierung Probe, kehren zu mischen, und bei -20 ° C für die anschließende RNA-Isolierung (Schritt 3.1). Anmerkung: Die Proben in Trizol kann mehrere Wochen falls bei -20 ° C gelagert werden Es ist nicht notwendig, um die Kerne von den magnetischen Kügelchen vor RNA-Extraktion mit Trizol-Reagenz zu eluieren, because die Perlen nicht mit der nachfolgenden RNA-Isolierung stören. </li></ol></li></ol> 3. Bestimmen Transcript Levels in Nuclei Isoliert von Larven Gewebe <ol><li> Isolieren von RNA aus der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben in den Abschnitten 2.6.1 und 2.11.2 unter Verwendung des für Trizol-basierte RNA-Extraktion beschriebenen Standardprotokoll (siehe Materialien PDF) mit den folgenden Modifikationen hergestellt: <ol><li> Nach Fällung der RNA-Pellet, fügen 19,2 ul RNase-freies Wasser und 0,8 ul RNASecure Reagenz (siehe Materialien PDF) zum Pellet und Inkubation bei 60 ° C für 20 min auf RNAsen zu inaktivieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem fluoreszierenden Farbstoff-RNA-Bindung wie der Qubit-RNA-Assay-Kit (siehe Materialien PDF) mit dem QubitR 2.0 Fluorometer nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Synthese von cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase Verstärkung wie der EpiScript Reverse Transkriptase-Kit und oligodT Primer nach Herstellerangaben. Anmerkung: In der Regel werden 50 bis 100 ng RNA erzeugt ausreichend cDNA durchzuführen multiplen Genexpression analysiert. Äquivalente Mengen von Pre-und Post-Isolation RNA-Isolation verwendet, um cDNA zu erzeugen. </li><li> In 180 ul Nuklease-freies Wasser auf die 20 ul cDNA-Probe, um diese 10-fach vor der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) Analyse zu verdünnen. Diese Verdünnung ist ein wichtiger Schritt, denn unverdünnten cDNA-Proben können die qPCR hemmen. </li><li> Bereiten Sie eine qPCR Master Mix mit Polymerase und dNTPs, jeweils von Vorwärts-und Rückwärts-4 pmol Primer, gebildet mit sterilem Wasser auf die endgültige Reaktionsvolumen von 20 ul. <ol><li> Gestalten Sie qPCR-Primer, um Gene, die voraussichtlich in der Zelltyp von Interesse ausgedrückt werden gezielt und in der Entwicklungsphase, bei der das Gewebe gesammelt. Design-Primer eine Intron überspannen, wenn möglich, so daß genomische undcDNA-PCR-Produkten unterschieden werden. Hinweis: Wenn das Genexpressionsprofil der Zielzelltyp nicht bekannt ist, gegen eGFP Primern, die spezifisch in dem markierten Keimpopulation exprimiert werden soll, kann verwendet werden, um das Protokoll für einen bestimmten Zelltyp und Gewebe (Tabelle 1) zu optimieren. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die relativen Transkript-Gehalte von jedem Gen von Interesse in der Pre-und Post-Isolierung Isolierung Proben durch Vergleich mit einer Verdünnungsreihe von cDNA aus dem gesamten Gewebe hergestellt. Transcript Ebenen von Zielgenen sollte zu einem Referenzgens wie Rpl32 (oder besser mehrere Referenzgene) normalisiert werden. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

This protocol can be used to isolate or highly enrich specifically tagged nuclei from mixed cell populations in Drosophila embryonic or larval tissues. Using this protocol, nuclei can be isolated from dissected tissues in approximately 1 hr. The purity and yield of the isolated nuclei must be experimentally determined for each cell type. It can be difficult to quantify the bead-bound nuclei at the post-isolation stage of the protocol using a hemocytometer because of the beads present in the sample. Thus, if exac...

Drosophila-Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem enthalten ein komplexes Gemisch von Zelltypen. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, ist es zunächst notwendig, eine homogene Population von spezifischen Zellen in ausreichenden Mengen zu isolieren, um Downstream-Anwendungen zu ermöglichen. Verfahren, um Zellen von intakten Geweben zu isolieren, umfassen Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von ganzen Zellen. Während FACS wurde verwendet, um Zellen und Zellkerne von Drosophila-Embryonen und aus Caenorhabditis elegans zur Genexpression und Chromatin Profilierung 1-3 isolieren kann FACS und Laser Mikrodissektion schwierig sein, in Geweben, die stark vermischten Zelltypen oder enthalten, dass die Zellen mit enthalten, erfolgreich durchführen unregelmäßige Morphologie, wie Neuronen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, können Kerne anstatt Zellen aus spezifischen Zelltypen isoliert und für die nachfolgende Generation verwendet werden,e Expression Profiling. Wichtig ist, Microarray-basierte mRNA-Expressionsanalyse, die Kern RNA-Proben zeigt allgemein vergleichbare Ergebnisse bei der Verwendung von Gesamt-RNA, 4, 5 durchgeführt. Darüber hinaus hat die Genexpressionsanalyse mit Kern-RNA wurde erfolgreich eingesetzt, um die Genexpression in mehreren Organismen einschließlich C. studieren elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila und Menschen 4, 5 2, 3. Mehrere Ansätze wurden kürzlich für die Isolierung von spezifischen Populationen von markierten Kerne aus Drosophila Gewebe, geeignet für Genexpressionsanalyse und / oder Chromatinimmunpräzipitation sind beschrieben worden. Die Batch-Isolierung von Gewebe-spezifische Chromatin für die Immunpräzipitation (BiTS-Chip-) Verfahren nutzt FACS festen Kerne auf der Basis von Zelltyp-spezifische Expression von Kern lokalisierte GFP 2 isolieren. Dieser Ansatz war successfully verwendet, um die Verteilung von Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation von isolierten Kernen aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen 2 analysieren. Jedoch kann FACS-basierte Ansätze zur Isolierung markierten Kerne, die nur einen geringen Anteil an einer gemischten Population aufgrund der erhöhten Zeitaufwand für die Art geeignet Nummern für Downstream-Anwendungen zu erhalten, machen weniger geeignet sein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Gruppen Affinitäts-Isolationstechniken genutzt werden, um Kerne, die mit einem bestimmten Epitop in einem bestimmten Zelltyp gekennzeichnet sind, zu reinigen. Die Isolierung von Zellkernen in spezifischen Zelltypen (intakt) Verfahren zur Verwendung in Arabidopsis thaliana 6, 7 entwickelt markiert wurde kürzlich für die Verwendung in Drosophila 8 angepasst. Bei diesem Verfahren ist eine Kernhülle Fusionsprotein, das ein Substrat für die in vivo-Biotinylierung coexpressed mit dem Escherichia coli Biotinligase BirA in bestimmten Zelltypen. Biotin-markierte Kerne kann anschließend von Mischpopulationen unter Verwendung von Streptavidin-basierte Affinitätsisolierung gereinigt werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes wurden Kerne erfolgreich markiert und aus dem Mesoderm von Drosophila-Embryonen, in dem eine Kernhülle-Fusionsprotein unter der Kontrolle eines Mesoderm-spezifischen Enhancer exprimiert 8 isoliert. Die Autoren erzeugten Kernhüllenfusionsproteine, die in jedem Zelltyp unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS 9 ausgedrückt werden kann. Dieser Ansatz ist in der Lage, schnell zu isolieren Teilmengen von markierten Kerne von Mischpopulationen, erfordert aber drei separate transgene Konstrukte und kann daher für bestimmte genetische Anwendungen ungeeignet sein. Vor kurzem wurde ein Ansatz beschrieben, bei dem so (S ad1 und UN-C-84)-Domäne enthalten Proteine, die an der inneren Membran der Kernhülle zu lokalisieren, wurden mit dem Stichwortfluoreszierende Proteine ​​und unter der Steuerung des Systems 10 GAL4/UAS ausgedrückt. Kerne wurden in Gegenwart von nichtionischen Detergens isoliert, um die äußere Membran von der Kernhülle zu entfernen, und affinitätsgereinigt unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Anti-GFP-Antikörper gekoppelt. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um kleine Populationen von markierten Kerne von spezifischen neuronalen Subtypen im erwachsenen Gehirn von Drosophila 10 zu isolieren. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung der markierten Kerne aus einer gemischten Population von Zellen von Drosophila-Larven Gewebe beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, unabhängig, aber ist ähnlich dem von Henry et al. 10 zuerst beschriebenen Ansatz wurden Kerne mit einer fluoreszierenden Markierung, die nur in bestimmten Zelltypen in Drosophila exprimiert wird, um die anschließende Trennung von markierten Kerne aus gemischten Populationen erleichtern markierten mit einer Affinität-basierten Ansatz. Um Keime zu kennzeichnen,die KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology)-Domäne wurde eingesetzt. Die KASH Domäne eine Transmembrandomäne, die an die äußere Membran der Kernhülle, teilweise durch Wechselwirkung mit SUN-Domäne enthaltenden Proteinen innerhalb der perinukleären Raum 11 lokalisiert. Die C-terminale Domäne von KASH Proteine ​​wie Drosophila Msp-300 und Klarsicht verankert diese Proteine ​​an der äußeren Kernmembran, während die N-terminalen Domänen interagieren mit Cytoskelett-Proteine ​​wie Aktin oder Mikrotubuli im Zytoplasma 12-14. Konstrukte wurden erzeugt, in dem die KASH Domäne von Drosophila Msp-300 wurde unter der Kontrolle des Gal4 regulatorische Sequenz, UAS in der pUAST attB-Vektor 15, 16 an den C-Terminus von EGFP fusioniert. Mit phiC31 ortsspezifische Integration wurden transgene Fliegen erzeugt, in dem die UAS-EGFP :: Msp-300-KASH Transgen wurde in der attP2 Loci auf Chromosom eingefügt3L 17. Die FH-EGFP :: Msp-300-KASH fliegt mit Fliegen, die das Gal4-Treiber zum Ausdruck in einem bestimmten Zelltyp, was die gezielte Expression von EGFP auf der äußeren Kernmembran in den Zelltyp von Interesse überquert werden. Markierte Kerne können dann aus gemischten Zellpopulationen mit Antikörpern gegen GFP an magnetische Kügelchen gekoppelt gereinigt werden. In diesem Ansatz wird die Verwendung von nichtionischen Detergens nicht erforderlich, da das EGFP-Tag an der zytoplasmatischen Seite der äußeren Kernmembran lokalisiert, und ist daher für Antikörper zugänglich. Die unten beschriebene Protokoll kann zur Isolierung / bereichern EGFP-markierten Kerne von bestimmten Zelltypen in Drosophila Larvengewebe, um die Reinheit und Ausbeute der isolierten Zellkernen zu quantifizieren und Kern-RNA zu extrahieren geeignet für quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT werden -PCR) Genexpressionsanalyse. Die Isolierung und Reinigung von Affinität-Kerne (ohne tissuPräparation E) kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Ergebnisse dargestellt, die die Gliazellen Kerne erfolgreich vom Larvenoptischen Keule und Augen Imaginalscheibe isoliert werden und für nachfolgende Genexpressionsanalyse verwendet. Es ist zu erwarten, dass dieser Ansatz nützlich für die Isolierung / Anreicherung der markierten Kerne aus embryonalen und larvalen Geweben, in denen die Zielzellen weniger als 5% der Gesamtpopulation darstellen können. Alle Drosophila Aktien und Plasmide in dieser klinischen Studie sind von den Autoren auf Anfrage erhältlich.

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Drosophila melanogaster und embryonalen Geweben der Larven enthalten oft ein sehr heterogenes Gemisch von Zelltypen, die die Analyse der Genexpression in diesen Geweben erschweren kann. Somit zellspezifische Genexpressionsprofile von Drosophila Gewebe zu analysieren, kann es notwendig sein, bestimmte Zelltypen mit hoher Reinheit und in Ausbeuten ausreichend für nachfolgende Anwendungen wie Transkriptionsprofiling und Chromatin-Immunopräzipitation isoliert. Jedoch kann die unregelmäßige Zellmorphologie in Geweben wie dem zentralen Nervensystem, verbunden mit der seltenen Population von spezifischen Zelltypen in diesen Geweben, Herausforderungen für herkömmliche Methoden der Zellisolierung wie Laser Mikrodissektion und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung darstellen (FACS) . Hier wird ein alternativer Ansatz zur Charakterisierung zellspezifische Genexpressionsprofilen unter Verwendung von Affinitäts-basierte Isolierung von markierten Kerne, anstatt ganzer Zellen, beschrieben. Kerne in der spezifischen cell Art von Interesse sind genetisch mit einer Kernhülle lokalisierte EGFP-Tag mit der GAL4/UAS binären Expressionssystem gekennzeichnet. Diese EGFP-markierte Kerne können mit Antikörpern gegen GFP, die an magnetische Kügelchen gekoppelt sind, isoliert werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansatz ermöglicht eine konstante Trennung der Kerne von spezifischen Zelltypen in Drosophila Larven des zentralen Nervensystems bei hoher Reinheit und in ausreichenden Mengen für die Expressionsanalyse, auch wenn diese Zelltypen enthalten weniger als 2% der Gesamtzellpopulation in der Gewebe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Kerne aus einer Vielzahl von embryonalen und larvalen Drosophila Zelltypen mit spezifischen Gal4 Treiber zu isolieren, und kann zur Isolierung von Kernen von Zelltypen, die nicht geeignet für die FACS oder Laser Mikrodissektion werden können.

Der Repo-GAL4-Treiber (Bloomington Bestandsnummer 7415) ist speziell in Gliazellen im Nervensystem Drosophila an mehreren Entwicklungsstufen 18 ausgedrückt. Die Fliegen wurden erzeugt, stabil exprimieren UAS-EGFP :: Msp-300-KASH unter der Kontrolle des Repo-GAL4-Treiber mit Standard-genetische Techniken. Um das Expressionsmuster des Transgens EGFP :: KASH in dieser entfernt zu charakterisieren, wurde das Muster der GFP-Expression in den eingeschnittenen Lappens ...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

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14.6K Aufrufe.  Purdue University.  Drosophila-Gewebe enthalten häufig eine heterogene Mischung von Zelltypen. Um die Genexpression in spezifischen Zelltypen aus einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, können Keime genetisch markiert und anschließend mit einer Affinität-basierten Ansatz isoliert. Isolierte Kerne für nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsanalyse und Chromatinimmunpräzipitation verwendet werden. 

Serie: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.