Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost Büro (EPRI).

Allgemeine Kommentare zu Magnetic Bead Sortieren von Drosophila peripheren Neuronen (Total Timing für die Fertigstellung des Protokolls: 2.5-3 Stunden) Standard-Laborverfahren für die Beibehaltung einer sauberen, RNAse freien Umgebung muss jederzeit beobachtet werden, um RNA-Abbau zu verhindern. Wenn der Drosophila Larvencuticula seziert wird und in der Zelle Dissoziationspuffer, sind die peripheren Neuronen eines der letzten Zellen aus der Oberhaut zu lösen. Wir haben diese Eigenschaft genutzt und entwickelt dieses Protokoll, um die meisten der nicht-spezifischen Zellen aus der Oberhaut, wie Muskel-und Fett vor dem Isolieren der da Neuronen zu entfernen. Mit etwas Übung kann das gesamte Protokoll erfolgreich in ca. 2,5 Stunden abgeschlossen sein. Die Herstellung von Antikörper-beschichteten Kügelchen müssen abgeschlossen sein, bevor das Experiment beginnt. 1. Vorbereitung Magnetic Beads zur Bindung Cells: Dieser Schritt muss vor dem Start des Experiments abgeschlossen sein. Die vorbereiteten Kugeln können hergestellt und bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. <ol><li> Wash 100 ul der Dynabeads M-280 Streptavidin beschichteten Beads dreimal in PBS durch Resuspendieren in 500 ml frisches PBS und Pelletierung es in einem starken Magnetfeld jeder Zeit. </li><li> Schließlich resuspendieren die Perlen direkt in 100 ul unverdünnter biotinylierten Ratte anti-Maus-CD8a Antikörper (Antikörper-Konzentration von 100 pg / ml). </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 1 Stunde auf Eis mit gelegentlichem leichten Verwirbelung zur Sedimentation zu verhindern. [1 ul Dynabeads M-280 binden können 0,05-0,10 pg biotinylierte Antikörper]. </li><li> Waschen Sie die Bead-Antikörper-Gemisch dreimal wie in Schritt 1.1 beschrieben, um die überschüssige Antikörper zu entfernen. Die magnetischen Beads werden jetzt mit Antikörper beschichtet und zur Verwendung bereit. Bewahren Sie die Bead-Antikörper-Gemisch in 100 ul 1X PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Auswählen und Washing Larven: (10-15 Minuten) <ol><li> Nehmen 30-50 Jahren abgestimmt dritten Larvenstadium und legen Sie sie in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1-1,2 ml 1X Phosphate Buffered Saline (PBS). (3-5 Minuten) </li><li> Schließen Sie den Schlauch und Wirbel es bei maximaler Einstellung dreimal für jeweils 1 Sekunde. </li><li> Mit einem feuerpolierte Pasteurpipette den Überstand verwerfen komplett. Wiederholen Sie die Wäsche (2,1) und Vortex (2,2) die Schritte 3-4 Mal, bis der Überstand wird sichtbar frei von jeglichen Speisen Partikel und Ablagerungen. </li><li> Kurz wiederholen Sie die Wäsche mit 1 ml 70% Ethanol und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Larven zweimal mit 1 ml ddH2O und den Überstand verwerfen. </li><li> Kurz wiederholen Sie die Wäsche noch einmal mit 1 ml RNase-AWAY und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Larven dreimal in 1 ml ddH2O um die vollständige Entfernung von RNase-AWAY zu gewährleisten. </li></ol> 3. Dissection: (10-12 Minuten) <ol><li> Legen 10-12 Larven auf die Mitte eines Sylgard beschichtet 35mm Petrischale. Positionieren Sie sie leicht von einander entfernt. [Critical Schritt: Entsorgen Sie alle Larven, die scheinbar nicht auf der entsprechenden Entwicklungsstufe werden] </li><li> Schneiden Sie die vordere Spitze der Larven mit einer feinen Sezierung Schere für alle die Larven. </li><li> Mit ein paar dumpfe Dumont Nr. 5 Pinzette invertieren die Larven von innen nach außen. Stecken Sie ein ForceP im Larvencuticula den ganzen Weg bis zum hinteren Ende. Pinch die Spitzen der Zange zusammen, um das hintere Ende der Kutikula (Abbildung 1a) (versuchen Sie die Nagelhaut auf den Sylgard Oberfläche zu erleichtern) zu greifen. Mit der zweiten Pinzette, drücken Sie die Larvencuticula innen nach außen. [Critical Schritt: Versuchen Sie praktizieren diese Methode ein paar Mal, bevor die Zelle isoliert Experiment. Versuchen Sie, die Larven vollständig invertiert zu bekommen, um sicherzustellen, dass alle Weichteile, die Lösung für eine einfache Dissoziation ausgesetzt.] </li><li> Nach Sezieren 3-4 Larven, übertragen Sie sie sofort an die frische, eiskalte PBS (statt der Röhre auf Eis) in ein 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1 bis 3,4, bis alle benötigten Larven gesammelt werden (30-40 Larven in diesem Protokoll). [Critical Schritt:. Antizipieren 10-20% Verlust beim Präparieren und Dissoziation, und entsprechend zu planen] </li></ol> 4. Entfernung von lose anhaftenden unspezifische Zellen: (2-3 Minuten) [Dieser Schritt hilft bei der Räumung von lose anhaftenden unspezifische Gewebe wie Fett Organe und ZNS.] <ol><li> Nehmen Sie die 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem invertierten larvalen Kutikula und ersetzen Sie den Überstand mit etwa 700-800 ml frisches eiskaltes PBS. </li><li> Pulse-Wirbel der Mikrozentrifugenröhrchen 5 mal (3 Sekunden pro Puls) bei voller Geschwindigkeit. </li><li> Überstand verwerfen und ersetzen Sie es mit etwa 700-800 ul frischem, eiskaltem PBS. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 dreimal. </li><li> Resuspend der larvalen Kutikula in 400 ml frisches, eiskaltes PBS </li></ol> 5. Distanziert das Gewebe in einem einzigen Zellsuspension: (18-20 Minuten) [Critical Schritt: Over-Dissoziation kann der Verlust der Zell-Oberflächenmarker was zu einer schlechten Zelle Ausbeute und geringe Lebensfähigkeit der Zellen verursachen. Die Larven Gewebe kann entweder durch mechanische Dissoziation (Beschallung, douncing), enzymatische Dissoziation (Trypsin, Collagenase etc.) oder eine Kombination von beiden trennen. Da diese Larven Gewebe schwer zu distanzieren sind, fanden wir, dass eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Dissoziation die besten Ergebnisse erzielt.] <ol><li> Add 1,5 ul 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch Einheiten / Durchstechflasche), die Larvencuticula in 400 ul PBS suspendiert. </li><li> Vortex die Lösung 2-3 mal für jeweils 1 Sekunde bei maximaler Einstellung (Dies sollte die lose anhaftenden Zellen aus der Oberhaut in die Lösung zu entfernen). </li><li> Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur (22-25 ° C) für 5 Minuten. [Entscheidender Schritt: Die Inkubationszeit großen Einfluss auf die endgültige cell sorting Effizienz. Die empfohlene Inkubationszeit sollte ausreichen, zur Auflockerung des Gewebes. Nicht mehr als 15 Minuten.] </li><li> Pulse-Wirbel der Röhre 20-30 mal bei maximalen Einstellungen für 2 Sekunden pro Puls auf Hochtouren. Dies sollte löst die Muskulatur und andere Gewebe in die Lösung. Überprüfen Sie einen kleinen Auszug aus der Lösung unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop bei jedem Schritt. (Mit der Erfahrung sollte man in der Lage sein auf das Niveau der Dissoziation zu bestimmen durch die Beobachtung der Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter einem Fluoreszenz-fähigen Stereo-Mikroskop) </li><li> Waschen Sie die Larven Nagelhaut 2-3 mal mit frischem, eiskaltem PBS resuspendieren und schließlich sie in 500 ml frisches, eiskaltes PBS mit 1% BSA. </li><li> Um zu vermeiden, die Larvencuticula Festhalten an der Glasoberfläche der 2 ml Kontes Gewebe Mühle und großer Freiraum Stößel, pre-coat das Gewebe Mühle und Mörser mit einem 1% BSA in PBS-Lösung und nach einem kurzen Spülen verwerfen BSA-Lösung. Anschließend mit einem feuerpolierte Pasteurpipette, übertragen Sie die Nagelhaut mit Schritt 5.5 die BSA-beschichtete Gewebe Mahlwerk. [Critical Schritt: Pre-cool das Gewebe Schleifer / Stößel, indem Sie sie auf Eis für ein paar Minuten zu Zellschädigungen / Lyse verhindern]. </li><li> Dounce das Gewebe mit langsamen und gleichmäßigen Strichen, die Vermeidung Aufschäumdüse (ca. 20-30 Schläge). [Critical Schritt:. Dounce langsam und stetig, sonst können die Zellen zu lysieren] </li><li> Zur Beurteilung der Zell-Dissoziation Ebenen, wischen Sie die Außenwand des Gewebes Mahlwerk mit einem sauberen Kimwipe Gewebe, und untersuchen Sie ihn unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Die Neuronen sollte die Nagelhaut abgelöst haben, und können in der Lösung gesehen werden. Wenn diese gefunden wird schwierig sein, alternativ Pipette eine kleine Probe der Lösung, und beobachten Sie es unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Ein guter Indikator für Zelle Dissoziation ist die Abwesenheit von Neuronen aus dem Larvencuticula. Allerdings, wenn man noch beachtet Neuronen an der Nagelhaut oder beobachtet unvollständig dissoziierten Zellen, weitere Dounce, bis die Zellen erreichen einen einzigen Zellsuspension. </li><li> Man reibt die Lösung 5 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf etwa 50% der Standard-Spitzendurchmesser, gefolgt von 10 mal mit einer Schusskraft-polierten Pasteurpipette verringerte sich auf rund 25% der Standard-Durchmesser. [Critical Schritt: Kraftvoller Verreibung können die Zellen schädigen. Überwachen Sie die Zellen zwischen den Schritten, und passen Sie das Verfahren entsprechend]. </li><li> Filter die Lösung durch ein 30 pm Zellfilter und sammeln Sie die Zelle Filtrat in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die resultierende Lösung sollte aus einem einzigen Zellsuspension bestehen und ist nun bereit für die magnetische Zellsortierung. </li></ol> 6. Magnetic Bead Cell Sorting: (45 bis 75 Minuten, abhängig von Antikörper-Inkubationszeit) <ol><li> Add 15 ul Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen zu 500 ul Zellsuspension (Schritt 5,10). Die restlichen Antikörper, konjugiert magnetische Kügelchen können gespeichert werden, bis für die nachfolgende Zelle Isolierungen benötigt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen für 30-60 Minuten auf Eis mit gelegentlichen Hand-Mischen. [Critical Schritt: Inkubation bei einer höheren Temperatur oder längere Zeit kann in nicht-spezifische Antikörper-Bindung führen.] </li><li> Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem starken Magnetfeld für 2 Minuten. Alle positiv selektierten Zellen zusammen mit ungebundenen Perlen werden auf die Seite des Rohres zu trennen. </li><li> Langsam Pipette der Überstand, was sicher nicht das Zellpellet zu stören. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3-4 mal in frischem, eiskaltem PBS, um alle verbleibenden nicht-spezifische Zellen zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 30 ml frisches, eiskaltes PBS. </li><li> Zur Angleichung der Reinheit und Ausbeute der Zellen, Pipette 5 ul der Zelle suspension auf der polierten Oberfläche einer Zählkammer und zählen alle sichtbaren fluoreszierenden Zellen unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Überprüfen Sie auch die Menge an nicht-fluoreszierenden Zellen und keine Anzeichen von Verunreinigungen. Typischerweise wird die Probe in hohem Grade für fluoreszierende Zellen angereichert werden. </li></ol> 7. RNA Isolation aus Magnetic Bead sortierten Zellen: (60 bis 75 Minuten) <ol><li> Nach dem Zählen Pellet die Zellen in einem Magnetfeld, den Überstand verwerfen und mit 20 ul Extraktionspuffer aus dem PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Je nach Zellzahl, den Sie benötigen, um ein höheres Volumen Extraktionspuffer hinzuzufügen. </li><li> Vortex das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit, damit die Vermischung von Zellpellet mit Extraktionspuffer. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen bei 42 ° C für 30 Minuten. </li><li> Um sicherzustellen, Entfernung der magnetischen Kügelchen vor der Spalte Reinigung der RNA (siehe Schritt 7.5) wird das Rohr kurz auf 2.000 (x) g für 2 Minuten auf Pellet die magnetischen Kügelchen zentrifugiert. Das Rohr wird dann in einem starken Magnetfeld, das Pellet bewahren gelegt, und der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. </li><li> Extrahieren und Spalte reinigen die RNA nach dem PicoPure RNA-Extraktion-Kit des Herstellers. DNAse Behandlung ist optional und kann auf der Säule während der RNA-Reinigung werden nach der Analyse Anforderung durchgeführt. Schließlich eluieren die gebundenen Gesamt-RNA in einem kleinen Volumen (11-30 ul) Elutionspuffer und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Auf Wunsch eine 1 ul-Aliquot verwendet werden, um Gesamt-RNA Qualität auf einem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.) zu beurteilen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Magnetic Bead-Sortierung verwendet wurde, um Drosophila da Neuronen (Abbildung 1) zu isolieren. Die RNA aus diesen isoliert da Neuronen (Abbildung 2a) gereinigt wurde festgestellt, dass von ausgezeichneter Qualität sein, wie durch das Vorhandensein von scharfen 5.8S, 18S und 28S ribosomalen RNA Spitzen angezeigt, wenn auf einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) analysiert ( Abbildung 2b). Beginnend mit 30-40 dritten Larvenstadium waren wir in der Lage zu isolieren durchschnittlich 300-500 Klasse-IV da Neuronen mit der PPK-GAL4 Treiber und 1500-2000 da Neuronen (Class I, II, III &amp; IV) mit dem pan- da Neuronen-spezifische GAL4 21-7 Fahrer. Zur Beurteilung der neuronal-spezifische Anreicherung unserer isolierten Zellen führten wir quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR) mit zwei neuronalen Gen-spezifische Marker (Elav und futsch). Diese Analysen zeigten signifikante fache Anreicherung der beiden Markergene was auf eine sehr spezifische Bereicherung für da Neuronen fließen durch den Einsatz unseres Protokolls (Abbildung 3) verglichen. Schließlich wurde die isolierte RNA aus beiden pan-da Neuronen und Klasse-IV da Neuronen zur transkriptionellen Expression Profiling auf Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarrays (4 x 44K) (Abbildung 4) durchzuführen. Diese Analysen wurden zahlreiche zuvor verwickelt Regulatoren da Neuron Dendriten Morphogenese neben einem breiten Spektrum von bisher nicht charakterisierter Moleküle und vermeintlichen Signaltransduktionswege, die möglicherweise spielen eine wichtige funktionelle Rolle in da Neuron Entwicklung. Studien entwickelt, um die potenzielle Rolle (n) dieser bisher nicht charakterisierter Moleküle bei der Vermittlung da Neuron Entwicklung, insbesondere Dendriten Morphogenese zu beurteilen, sind derzeit im Gange. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 1:. Schematische Darstellung des Magnetic-Bead-Sortierung von Drosophila da Neuronen (a) Alter abgestimmt dritten Larvenstadium mit dem da Neuronen-spezifische GAL4, UAS-mCD8-GFP-Reporter-Transgen sind durch Umkehrung der Larvencuticula inside-out, um das Expose seziert PNS zur Dissoziation Puffer und in eiskaltem PBS gespeichert. (b) Enzymatische Dissoziation erfolgt durch Zugabe von Liberase Blendzyme 3, um die Lösung mit Larvencuticula durchgeführt. (c) Die Larven Gewebe sind weitere dissoziiert durch eine Kombination aus Verwirbelung, Zerreiben und douncing Nicht-spezifisch markierten Gewebe wie Fett-Organe, Darm und ZNS. (d, e) Die Zellen werden dann gefiltert mit einem 30 pm Zelle Filter zu entfernen. Die Lösung enthält eine einzige Zellsuspension von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Epithelien, Muskel-und Nervenzellen. (F) Anti-Maus-Antikörper beschichtet CD8a Dynabeads M-280 sind zur Zellsuspension hinzugefügt und auf Eis inkubiert für 30-60 Minuten. ( g) Das magnetische Kügelchen bindet an die da Neuronen, die Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP Fusionsprotein. (h, i) Die Magnetic-Bead-beschichteten Zellen, indem die Lösung in einem starken Magnetfeld getrennt sind. Der Überstand wird verworfen und die Zellen dreimal gewaschen, um alle verbleibenden nicht-spezifischen Zellen zu entfernen, was in (j) highly gereinigt Populationen von Neuronen da. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 2: (a) Repräsentative Bild von positiv selektierten, GFP Fluoreszenz-Klasse-IV da Neuronen durch Zell-Dissoziation und Magnetic-Bead-Sortierung isoliert. Die daraus resultierende Population von Neuronen war fest entschlossen, in hohem Grade für Klasse-IV da Neuronen werden mit wenig oder keiner Kontamination Zelle Verunreinigungen angereichert. (B) Ein Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) Elektropherogramm Gesamt-RNA aus magnetischen Beads sortiert da Neuronen isoliert und zeigt eine ausgezeichnete Gesamt-RNA Qualität als durch die Anwesenheit von 5.8S, 18S und 28S rRNA angegeben. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Abbildung 3: qRT-PCR-Analyse von neuronalen Marker Genexpression in isolierten da Neuronen (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) und der Durchfluss durch-Fraktion wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Expression der beiden neuronal-spezifischen Markergene (Elav und futsch) wurden durch qRT-PCR untersucht. Die Werte aus diesen Analysen gewonnen wurden, um die endogene Kontrolle (rp49) normalisiert, und das Niveau im Vergleich zu denen in Durchströmung Bruchteil beobachtet wurden unter Zugrundelegung der ΔΔCτ Methode 6. Beide Elav und futsch waren deutlich in der isolierten da Neuronenpopulation angereichert, um den Fluss durch Bruchteil verglichen. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 4: Repräsentative Klasse-IV da Neuronen-spezifische Cy3 markiert Microarray-Image-Datei. Abgebildet ist ein Agilent Drosophila melanogaster gesamten Genoms Oligo-Microarray (4 x 44K) mit Cy3-labeld Gesamt-RNA aus Klasse-IV da Neuronen durch Magnetic-Bead-Sortierung gereinigt isoliert hybridisiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten ist für die Isolierung und Aufreinigung von peripheren Neuronen, die eng an die innere Oberfläche der Drosophila dritten Larvenstadium Larvencuticula mit einer Magnetic-Bead-cell sorting Strategie festhalten optimiert. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um gezielt zu isolieren Drosophila da Neuronen, Anwendungen dieses Protokoll, um die Isolation von anderen Zelltypen, die die Kutikula in Larven-oder Puppenstadium Entwicklungsstadien haften (zB Epithelien, Muskeln, andere p...

Ausstattung <ul><li> (10) Neodym-Magneten Block (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativ Dynamag ™ -2 (Invitrogen, Cat. Nr. 123-21D) verwendet werden. </li><li> Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml Arbeitsfähigkeit, mit großem Abstand Stößel (Kat. Nr. 885300-0002) </li><li> Zell-Filter, z. B. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 mm Petrischalen mit Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358 bis 1004) beschichtet </li><li> Dissecting Werkzeuge: zwei Paare von Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, Kat. Nr. 11251-20.) </li><li> Vannas Frühjahr Mikrodissektion Schere (Fine Science Tools, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetten (P-1000, P-100, P-10) mit Einwegspitzen </li><li> Standard-Zählkammer die Zellen und schätzen Reinheit zählen </li><li> Pasteurpipetten mit Feuer polierte Spitzen von Standard-Durchmesser verengt, um ~ 50% der Standard-Durchmesser und verengt auf ~ 25% der Standard-Durchmesser für Verreibung </li><li> Tischplatte Mikro-Zentrifuge (1-16,000 (x) g) </li><li> Wirbel </li><li> Fluorescent Stereo-Mikroskop (Leica MZ16FA wurde in diesem Protokoll) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Nervensystem (PNS) ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der komplexen Prozesse der neuronalen Entwicklung und Dendriten Morphogenese bei der funktionalen und molekularer Ebene. Zur Unterstützung bei diesen Analysen haben wir eine Strategie für die Isolierung von einer Unterklasse von PNS Neuronen so genannten dendritischen Verzweigung (da) Neuronen, die in großem Umfang für das Studium Dendriten Morphogenese verwendet entwickelt<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Diese Neuronen sind sehr schwierig, da eine reine Population isoliert, zum Teil aufgrund ihrer extrem geringen Vorkommens und ihrer schwer zu erreichen Lage direkt unterhalb der harten Chitinpanzer Larvencuticula. Unsere neu entwickelte Verfahren überwindet diese Herausforderungen, und ist auf eine schnelle und spezifische Anreicherung von Zellen mit Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen auf. Für unsere Magnetic-Bead-Sortier-Studien haben wir altersmäßig angepassten dritten Larvenstadium eingesetzt Ausdruck einer Maus CD8 getaggt GFP-Fusionsprotein (<em&gt; FH-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV dendritische Verzweigung (da) Neuronen-spezifische<em&gt; Taschendieb (PPK)-GAL4</em&gt; Fahrer<sup&gt; 4</sup&gt; Oder die Steuerung der pan-da Neuronen-spezifische GAL4<sup&gt; 21-7</sup&gt; Fahrer<sup&gt; 5</sup&gt;. Obwohl dieses Protokoll für die Isolierung von PNS-Zellen, die an der Innenwand des Larvencuticula befestigt sind, durch die Variation einiger Parameter optimiert wurden, konnte das gleiche Protokoll verwendet, um viele verschiedene Zelltypen an der Nagelhaut an Larven oder Puppen Phasen zu isolieren Entwicklung (z. B. Epithelien, Muskel-, oenocytes etc.) oder andere Zelltypen aus Larvenorgane abhängig von der GAL4-spezifischen Treiber Expressionsmuster. Die RNA durch diese Methode isoliert ist von hoher Qualität und kann ohne weiteres für nachgeschaltete genomische Analysen wie Microarray Gene Expression Profiling Studien verwendet werden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsstarkes neues Werkzeug, um Untersuchungen an isolierten durchführen<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendritische Verzweigung (da) Neuronen wodurch neue Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Dendriten Morphogenese.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Peripheren Neuronen mit einem schnellen Magnetic Bead Zellsorting Strategie. RNA aus den isolierten Zellen erhalten kann ohne weiteres für nachgelagerte Anwendungen einschließlich Microarray-Analysen verwendet werden.

Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K Aufrufe.  George Mason University. In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Drosophila Peripheren Neuronen mit einem schnellen Magnetic Bead Zellsorting Strategie. RNA aus den isolierten Zellen erhalten kann ohne weiteres für nachgelagerte Anwendungen einschließlich Microarray-Analysen verwendet werden.

Serie: Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...