Unterstützte Teil durch NIH (R43/44CA122444) und DOD BRCP Zuschuss (W81XWH-06-1 bis 0682), um YL.

1. Sample, Ausrüstung und Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Cut Gewebeprobe in Blöcke von 3-4 mm Dicke, fix in frischem 10% neutral gepuffertem Formalin für 16 bis 32 Stunden bei Raumtemperatur (25 ° C) und in Paraffin eingebettet werden. Schneiden Sie FFPE in Abschnitte von 5 ± 1 um Dicke aus FFPE-Blöcke, auf Objektträger und der Luft trocknen. Hinweis: Die Folien können bei Raumtemperatur unter Trocknung für 3 Monate gelagert werden. Die montierten Gewebeschnitten in einem trockenen über bei 60 ° C für 1 h vor dem Assay RNAscope gebacken werden. </li><li> Bringen Hybridisierungsofen auf 40 ° C Legen Sie ein Befeuchten von Papier in das Fach Luftfeuchtigkeitskontrolle. 50 ml dH 2 O auf die Befeuchtung Papier, um es vollständig zu benetzen. Legen Sie die abgedeckt Tray in den Ofen, für mindestens 30 Minuten vor der Verwendung vorwärmen. </li><li> Stellen Sie 700 ml 1x vorbehandeln 2 Lösung (10 nl, pH 6 Citrat-Puffer) durch Verdünnen 10x Vorbehandlungslösung in dH 2 O. Erhitzen Sie das vorbehandeln 1x 2 Lösung zu sieden und maintain die Temperatur zwischen 100-104 ° C und verhindert Über-Kochen. </li><li> Machen Sie 3 L 1x Waschpuffer (0,1 x SSC) durch Verdünnen vorgewärmten 50x Waschpuffer in dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie 2 x 200 ml Xylol und 2 x 200 ml 100% EtOH für Entparaffinierung unter einer Abzugshaube. </li><li> Bereiten Sie 50% Hämatoxylin Färbelösung und Bläuungsreagenz (0,01% Ammoniakwasser) für Post-Färbung unter einer Abzugshaube. </li><li> Planen 200 ml Xylol, 200 ml 70% und 2 x 200 ml 100% EtOH für die Dehydratisierung unter einem Abzug. </li><li> Vorwärmen Ziel Sonden bei 40 ° C für 10 Minuten und bringen RTU Detection Kit Reagenzien auf Raumtemperatur, einschließlich RTU Amp1, Amp2, Amp3, Amp4, Amp 5-Brown, und Amp6-Brown, außer DAB Chromogen Brown-A-und-B Braun . </li></ol> 2. RNAscope Assay Entparaffinierung und Dehydration Nach dem Backen entparaffinieren Gewebeschnitte in Xylol für 2 x 5 min mit häufigem Rühren und entwässernin 100% EtOH für 2 x 3 min mit häufigem Rühren. Luft für 5 Minuten und zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um den Gewebeschnitt mit einer hydrophoben Barrier Stift. Vorbehandlungen <ol><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 1 für 10 min bei RT zum Abschrecken der endogenen Peroxidase-Aktivität, spülen in dH 2 O. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 2 bei einer Siedetemperatur für 15 min für die RNA-Abruf gehalten gründlich zweimal in dH 2 O. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit vorbehandeln 3 für 30 Minuten bei 40 ° C für die Proteinverdauung in HybEZ Ofen gründlich zweimal in dH 2 O. </li></ol> Zielsondenhybridisierung Ziel Sonden HPV-HR 7-Pool gehören: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58 auf. In HPV-Sonden, Ubiquitin C (UBC) und bakterielle Gen dapB Sonden separat auf drei nebeneinander Gewebeschnitten. Hybridisierung bei 40 ° C im Ofen für 2hr, dann in 1x Waschpuffer spülen für 2 x 2 min bei RT. Signalverstärkung <ol><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit Amp1 (Vorverstärker) 30 min bei 40 ° C, Amp2 (Hintergrund Minderer) für 15 min bei 40 ° C, Amp3 (Verstärker) 30 min bei 40 ° C und Amp4 (Markierungssonde) für 15 min bei 40 ° C im Ofen HybEZ. Nach jedem Hybridisierungsschritt gründlich in 1x Wash Puffer für 2 x 2 min bei RT. </li><li> Inkubieren Gewebeschnitte mit Amp5 für 30 min und Amp6 für 15 min bei RT. Nach jeder Inkubation Schritt gründlich in 1x Wash Puffer für 2 x 2 min bei RT. </li></ol> Signalerkennung Inkubieren Gewebeschnitte mit 1:1 DAB Mischung durch Mischen gleicher Volumen von Brown und Brown-A-B für 10 min bei RT gründlich zweimal in dH 2 O. Gegenfärbung <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Stain Gewebeschnitte mit 50% Hämatoxylin-Lösung für 2 min bei RT, spülen mit dH 2 O bis Träger sind klar, während Gewebe lila bleiben. Dip rutscht in 0,01% Ammoniak in dH 2 O für 5x und folgte mit 5 taucht in dH 2 O. Slide Einbau Entwässern Gewebeschnitte in 70%, 100% und 100% EtOH für je 2 min, 5 min Xylol, montieren mit Xylol-basierten Montage Medien.

<ol>
	<li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002.">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States.">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li><li>Ang, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials.">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer+(unabridged+version).">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version).</a> Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

Alle Autoren werden von eigenen Aktien und in Advanced Cell Diagnostics, Inc. beschäftigt

Der HPV-Test RNAscope erlaubt die direkte Visualisierung von E6/E7 mRNA in situ in HPV-assoziierte Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Die RNAscope Assay ist kompatibel mit routine festen Tumorgewebe und bewahrt Gewebemorphologie für histopathologische Korrelationen (Abbildung 2). Ein wesentlicher Vorteil des Assays über RNAscope CISH herkömmlichen Verfahren ist, dass er spezifisch verstärkt die Hybridisierungssignale (Fig. 2B und 2E) ohne Verstärkung des Hintergrundrauschens (2C und 2F). In der Praxis kann die RNAscope HPV-Testverfahren innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen oder bequem über zwei Tage aufgeteilt werden. Der HPV-Test RNAscope wurde genutzt, um HPV-Status in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom 12-16 bestimmen, was zeigt, 97% Sensitivität und 93% Spezifität mittels qRT-PCR als Referenzmethode 16. Konventionelle chromogenic ISH für HR-HPV-DNA ist hochspezifisch, sondern hat eine Empfindlichkeit von 12 ~ 80%. Immunhistochemischen (IHC) Färbung für die zelluläre Surrogatmarker p16 zeigt hervorragende Empfindlichkeit, aber können falsche positive Ergebnisse 15,18, vor allem in nonoropharyngeal Kopf-Hals-Tumoren 15 zu generieren. Die aktuelle &quot;Goldstandard&quot;-Methode der qRT-PCR für HPV E6/E7 mRNA-Nachweis erfordert frisch gefrorenem Gewebe für optimale Ergebnisse und ist technisch komplex, was seine Verwendung zu Forschungslabor begrenzt. Darüber hinaus erfordert es die RNA-Extraktion, die es unmöglich macht, HR-HPV E6/E7 mRNA-Expression mit Histopathologie korreliert ist. Es gibt mehrere kritische Faktoren für den Erfolg der RNAscope Assay. Erstens, um die besten Ergebnisse, Gewebe sind in frischen 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 16-32 Stunden nach ASCO / CAP 19 Leitlinien festgelegt werden. Zweitens wird der Ofen HybEZ empfohlen, da es zu ermöglichens eine optimale Steuerung der Temperatur und Feuchtigkeit für Sondenhybridisierung und Signalverstärkungsschritten. Drittens ist es wichtig, um überschüssige Rest Puffer vor jedem Schritt zu entfernen, aber immer noch den Gewebeschnitt zu halten vor dem Austrocknen während einer dieser Schritte. Die hier beschriebene manuelle Verfahren RNAscope wurde vollständig auf einem kommerziellen Auto-Schieber-Färbung System 10 automatisiert. Dies sollte erheblich erleichtern Standardisierung der Testbedingungen und spart wertvolle Handarbeit in der klinischen Pathologie-Laboratorien. Darüber hinaus hat dedizierte Bildanalyse-Software entwickelt, um die Zellen 10 und Färbung Signale auf einer digitalisierten Rutsche, die helfen sollen, die Subjektivität eliminieren und die Reproduzierbarkeit verbessern in Scoring automatisch zu identifizieren. Zusammenfassend erkennt der HPV-Test RNAscope das Vorhandensein von HR-HPV E6/E7 mRNA-Transkripte in situ in FFPE-Gewebe. Es verfügt über einen Workflow, der vertraut klinischen Pathologie Labor istTories durch Genehmigung der Visualisierung direkt von diesen in Gewebeschnitten. Es bietet eine ideale Plattform für die Prüfung (FFPE) Gewebeproben und kann leicht durch diagnostische Pathologie-Laboratorien angenommen werden.

Hochrisiko-humanen Papillomviren (HR-HPV) macht etwa 5% aller Krebserkrankungen weltweit ein. Die Häufigkeit von HPV-assoziierten oropharyngealen Krebs hat sich in den letzten Jahrzehnten vor allem bei Männern erhöht. HPV-positive Mund-Rachen-Plattenepithelkarzinom (OPSCC) wird wahrscheinlich bilden eine Mehrheit aller Kopf-und Halskrebs in den USA in den nächsten 20 Jahren 2. Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome, die durch HPV verursacht werden, mit günstigen Überleben und Tumor HPV-Status ist ein starker und unabhängiger prognostischer Faktor für das Überleben 3. Beweise für die transkriptionelle Aktivierung der viralen Onkogene E6 und E7 wird als Goldstandard für die Anwesenheit von klinisch relevanten HPV 4 betrachtet. Allerdings ist der Nachweis E6/E7-mRNA aus frischem Tumorgewebe mittels RT-PCR-Technik nicht praktisch in der klinischen Routine und hat zu den Forschungslabors beschränkt. Vor kurzem haben wir have eine neuartige Technologie namens RNA-ISH RNAscope, die Multiplex-Nachweis mit RNA-Einzelmolekülempfindlichkeit in Formalin fixiert Paraffin eingebettete Gewebeproben (FFPE) 5-10 können in einzelnen Zellen. Wir stellten drei Beweislinien für Einzelmoleküldetektion 5. Erstens erlaubt die RNAscope Sondendesign und Signalverstärkungssystem Detektion von einzelnen Kopie HER2 genomischen DNA-Ziele in HeLa-und SK-BR-3-Zelllinien. Zweitens, wenn genomische DNA mit HER2 Signalen verglichen, die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten von HER2-mRNA Signal Punkte in HeLa-Zellen war konsistent mit einem Molekül pro Punkt. Drittens, die Anzahl der HER2-mRNA-Signal Punkte pro Zelle eng aufeinander abgestimmt die durch eine lösungsbasierte Quantifizierung Assay geschätzt HER2-mRNA-Kopienzahl, weitere Stützeinzelmoleküldetektion. Außerdem Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI in der Fluoreszenzmikroskopie oder mit Hämatoxylin in Hellfeld-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Kerne, whICH wiederum ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Zielen auf einer Einzelzellgrundlage 10. Die Fähigkeit, die Genexpression in situ in der klinischen Routineproben analysieren RNAscope macht eine vielversprechende Plattform für diagnostische Pathologie, vor allem diejenigen, FFPE-Gewebeschnitt-basierte Assays 10,11. Wir haben eine RNAscope basierten Assay zum Nachweis HPV E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifische Sonden entwickelt. Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass OPSCC die RNAscope HPV Assay ist hochempfindlich und spezifisch bei der Bestimmung HPV-Status auf FFPE-Geweben 12-17 und informiert auch Prognose OPSCC 12,16. Das Prinzip der RNAscope Technik bereits beschrieben worden 5. Hier beschreiben wir die komplette RNAscope Testprotokoll und zeigen ihre Verwendung in der Detektion von HR-HPV in FFPE-Tumorgewebeschnitten.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

Der &quot;Goldstandard&quot; für die onkogenen HPV-Nachweis ist die Demonstration von transkriptionell aktiven Hochrisiko-HPV im Tumorgewebe. , Erkennung von E6/E7 mRNA durch quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) erfordert jedoch die RNA-Extraktion, die das Tumorgewebe Kontext entscheidend für morphologische Korrelation zerstört und war schwierig, in der klinischen Routine verabschiedet werden. Unsere neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technologie RNAscope, ermöglicht die direkte Visualisierung von RNA in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe mit Einzelmolekülempfindlichkeit und Einzelzellauflösung, die hochsensitive und spezifische in situ-Analyse der RNA Biomarker ermöglicht in der klinischen Routineproben. Die RNAscope HPV-Test wurde entwickelt, um die E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifischen Sonden zu detektieren. Es hat eine ausgezeichnete Empfindlichkeit nachgewiesenund Spezifität gegen den Strom &quot;Goldstandard&quot; Verfahren zum Nachweis E6/E7-mRNA durch qRT-PCR. HPV-Status von RNAscope bestimmt ist stark prognos den klinischen Verlauf von Mundrachenkrebs-Patienten.

RNAscope HPV-Test-Workflow Die RNAscope Assay hat eine hoch optimierten Workflow, die ähnlich IHC ist (Abbildung 1). Es besteht aus vier Hauptschritten: Vorbehandlungen, Hybridisierung Signalverstärkungen und Detektion. Es setzt eine einzigartige Sonde Design-Strategie, die High-Fidelity-Signalverstärkung 5 gewährleistet. Im RNAscope HPV Assay werden die sieben HR-HPV-Sondensätze vereinigt, die alle von der gleichen Signalverstärkungssystem mit Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpft erkannt. Spezifische Hybridisierungssignale werden erkannt als braune Niederschläge durch HRP gebildet katalysierte Farbreaktion mit DAB als Substrat, die leicht durch Standard-Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Repräsentative Färbung für HPV-Nachweis Abbildung 2 zeigt beispielsweise Bilder von Bunt FFPE Abschnitte des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Bei den HPV-positiven Fall (Abb.Abbildung 2A), erfasst die HR-HPV-Sonden starke punktförmige Signale spezifisch in den Tumorzellen. Die UBC-Sonde nachgewiesen zahlreiche punktförmige zytoplasmatische Signale in beiden Tumorzellen und Stromazellen (2B). Das bakterielle Gen dapB Sonde zeigten einen sauberen Hintergrund (Abbildung 2C). In der HPV-negativen Fall sowohl die HR-HPV-Sonde und der Sonde nachgewiesen dapB keine Signale (Abb. 2D und 2F), während starke Signale wurden unter Verwendung des UBC-Sonde (2E) nachgewiesen. In diesem Test UBC dient als Positivkontrolle, um Gewebe RNA-Qualität und dapB als Negativkontrolle für die Hintergrundsignale zu beurteilen. Die Wertung für HPV-Status Bestimmung erfordert die Prüfung alle drei Rutschen für jeden Fall. Die Färbungspegel auf der negativen Steuerschieber (dapB) Schieber als Grenz verwendet: HPV-Häufigkeit wird durch die Anwesenheit von punktförmigen cytoplasmatischen und / oder Kernfärbung, die über das Signal auf der dabpB Schlitten definiert. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Flussdiagramm RNAscope-Assay. Illustration von RNAscope Test-Workflow. Die RNAscope Test 4 Hauptschritte, Vorbehandlungen, Zielsondenhybridisierung, Signalverstärkung und Signalerkennung. Das gesamte Testverfahren kann in 8 Stunden abgeschlossen sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> 2. Beispiel Bilder von RNAscope-gefärbten Folien. FFPE Abschnitte mit Sonden gebeizt für HR-HPV, UBC (Positivkontrolle) und dapB (Negativkontrolle)von zwei Fällen HNSCC. AC. HPV-positiven Fall. Ein HR-HPV E6/E7 mRNA-Expression in Tumorzellen. Inset, 40-facher Vergrößerung kann punktförmige Signale zeigen. B und C) benachbarten Gewebeschnitten zeigt positive UBC-Färbung (B) und negativ für dapB (C) sind. DF) HPV-negativen Fall. D) keine Färbung für HPV E6/E7 mRNA , ähnlich dem dapB Negativkontrolle (F). E) UBC positive Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Das Vorhandensein von Hochrisiko-HPV im Kopf-und Halstumorgewebe ist mit den positiven Ergebnissen assoziiert. Die neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technik namens RNAscope ermöglicht die direkte Visualisierung von HPV E6/E7 mRNA in FFPE-Gewebeschnitten.

RNAscope für<em&gt; In situ</em&gt; Erkennung von transkriptionell aktiven Human Papillomavirus in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

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Medicine

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

27.0K Aufrufe.  Advanced Cell Diagnostics, Inc..  Das Vorhandensein von Hochrisiko-HPV im Kopf-und Halstumorgewebe ist mit den positiven Ergebnissen assoziiert. Die neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technik namens RNAscope ermöglicht die direkte Visualisierung von HPV E6/E7 mRNA in FFPE-Gewebeschnitten. 

Serie: RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Das<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick Chorioallantoismembran (CAM) Assay als effiziente Xenograftmodell des hepatozellulären Karzinoms

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Isolierung und Charakterisierung eines Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom Subpopulation nach Stammzelleigenschaften

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

In Vivo Morphometrische Analyse der menschlichen Hirnnerven mittels Kernspintomographie in der Menière Krankheit Ohren und Normal hörende Ohren

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

Schweine als ein Trainingsmodul für Kopf und Nacken mikrovaskuläre Wiederaufbau

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

Das Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Modell zur Beurteilung der perineuralen Invasion bei Kopf- und Halskrebs

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is almost completely reserved to a few referral centers that deal with a large proportion of this pathology. Practice on human specimens is not always possible for ethical, economic, or availability reasons. The aim of this study is to provide a reproducible method for the organization of a laryngeal laboratory on ex vivo animal models where it is possible to approach, learn, and refine laryngeal techniques. Porcine and ovine larynges are ideal, affordable, models to simulate laryngeal surgery given their similarity to the human larynx in their anatomical layout and tissue composition. Herein, the surgical steps of transoral laser surgery, open partial horizontal laryngectomy, and total laryngectomy are reported. The merging of endoscopic and exoscopic views guarantees an inside-out perspective, which is vital for the comprehension of the complex laryngeal anatomy. The method was successfully adopted during three sessions of a dissection course &#34;Lary-Gym&#34;. Further perspectives on robotic surgical training are described.

The purpose of this paper is to illustrate how to organize a reproducible laboratory for laryngeal surgery on affordable and closely similar animal laryngeal models in order to improve anatomical and surgical knowledge and skills.

Lernen moderne LaryngealChirurgie in einem Dissektionslabor

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs to replace diseased or damaged organs. Scaffolds are needed to facilitate the generation of three-dimensional organs or tissues using differentiated stem cells in vivo. In this report, we describe a novel method for developing vascularized scaffolds using decellularized rat kidneys. Eight-week-old Sprague-Dawley rats were used in this study, and heparin was injected into the heart to facilitate flow into the renal vessels, allowing heparin to perfuse into the renal vessels. The abdominal cavity was opened, and the left kidney was collected. The collected kidneys were perfused for 9 h using detergents, such as Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate, to decellularize the tissue. Decellularized kidney scaffolds were then gently washed with 1% penicillin/streptomycin and heparin to remove cellular debris and chemical residues. Transplantation of stem cells with the decellularized vascular scaffolds is expected to facilitate the generation of new organs. Thus, the vascularized scaffolds may provide a foundation for tissue engineering of organ grafts in the future.

This protocol introduces a method to develop a scaffold using decellularized rat kidneys. The protocol includes decellularization and recellularization processes to confirm bioavailability. Decellularization is performed using Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate.

Herstellung von dezellularisierten Nierengerüsten bei Ratten

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...