Apoiado em parte pelo NIH conceder (R43/44CA122444) e DOD BRCP concessão (W81XWH-06-1-0682) para YL.

1. Sample, Equipamento e Preparação do reagente <ol><li> Corte amostra de tecido em blocos de 3-4 mm de espessura, fixar em fresco formalina a 10% neutra tamponada por 16-32 horas à temperatura ambiente (25 º C) e inserir em parafina. Corte FFPE em seções de 5 ± 1 mM espessura dos blocos FFPE, montar seções em slides e ar seco. Nota: Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente sob dessecação por até 3 meses. As lâminas de tecido montadas deve ser cozido numa seco durante a 60 ° C durante 1 hora antes do ensaio RNAscope. </li><li> Traga Hibridização forno a 40 ° C. Coloque um papel umidificação no Tabuleiro do controle de umidade. Adicionar 50 ml de dH 2 O para o Livro umidificação de molhá-lo completamente. Insira a bandeja coberta para o forno para pré-aquecimento por pelo menos 30 minutos antes de usar. </li><li> Adicione 700 ml de 1x Solução Pretreat 2 (10 nl, pH 6, tampão de citrato) por diluição 10x Solução de pré-tratamento em dH2O Aqueça o 1x Pretreat 2 Solução para ferver e maintain a temperatura entre 100-104 ° C enquanto prevenindo sobre-ebulição. </li><li> Faça 3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC), diluindo pré-aquecido 50x Wash Buffer em dH 2 O. </li><li> Preparar 2 x 200 ml de xileno e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para desparafinização sob um exaustor. </li><li> Preparar a solução de coloração Hematoxilina 50% e reagente bluing (0,01% de amônia da água) para o pós-coloração sob uma coifa. </li><li> Preparar 200 ml de xileno, a 200 ml de 70%, e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para a desidratação sob um exaustor. </li><li> Pré-aquecer as sondas alvo a 40 ° C por 10 min e trazer Detecção RTU reagente Kit à temperatura ambiente, incluindo RTU AMP1, Amp2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown, e Amp6-Brown, exceto DAB Chromogen Brown-A e Brown-B . </li></ol> 2. RNAscope Assay Desparafinização e desidratação Após o cozimento, Retire a parafina cortes de tecido em xileno para 2 x 5 minutos com agitação freqüente, e desidratarem EtOH a 100% durante 2 x 3 min, com agitação frequente. Secar ao ar durante 5 minutos e extrair uma barreira hidrofóbica em torno da secção de tecido com uma barreira hidrofóbica Pen. Pré-tratamentos <ol><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 1 durante 10 minutos a RT para extinção da actividade de peroxidase endógena, enxaguar em dH2O </li><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 2 mantidos à temperatura de ebulição durante 15 minutos para a recuperação de ARN, lavar duas vezes em dH2O </li><li> Incubar as secções de tecido com Pretreat 3 durante 30 min a 40 ° C durante a digestão da proteína no forno HybEZ, lavar duas vezes em dH2O </li></ol> Alvo sonda de hibridação Sondas alvo HPV-HR 7 piscina incluem: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Adicionar sondas de HPV, ubiquitina C (UBC) e bacterianas sondas dapB gene separadamente em três seções do tecido adjacente. A hibridização a 40 ° C no forno durante 2hr, depois enxaguar em tampão 1x Wash por 2 x 2 min à temperatura ambiente. A amplificação de sinal <ol><li> Incubar as secções de tecido com AMP1 (pré-amplificador) durante 30 min a 40 ° C, Amp2 (fundo redutor) durante 15 min a 40 ° C, AMP3 (amplificador) durante 30 min a 40 ° C, e AMP4 (sonda de marcação) durante 15 min a 40 ° C no forno HybEZ. Depois de cada passo de hibridação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as secções de tecido com AMP5 durante 30 min e Amp6 durante 15 min a RT. Depois de cada passo de incubação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente. </li></ol> Detecção de Sinal Incubar as secções de tecido com DAB 01:01 Mistura misturando igual volume de castanho e castanho-A-B por 10 min à temperatura ambiente, lavar duas vezes em dH2O Contracoloração <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; cortes de tecido mancha com solução a 50% de hematoxilina por 2 min à temperatura ambiente, lave com dH 2 O até lâminas são claras, enquanto o tecido ficar roxo. Dip desliza para 0,01% de amônia em dH 2 O para 5x e seguiu com 5 mergulhos em dH 2 O. Deslize de montagem Desidratar as secções de tecido em 70%, 100%, e 100% de EtOH, durante 2 min cada, xileno, durante 5 minutos, montagem com meios de montagem baseada em xileno.

<ol>
	<li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002.">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States.">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li><li>Ang, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Schache AG, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li><li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck:+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus.">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li><li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials.">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer+(unabridged+version).">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version).</a> Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

Todos os autores são empregados pelo próprio estoque e em diagnósticos avançados celulares, Inc.

O ensaio RNAscope HPV permitiu a visualização direta de E6/E7 mRNA in situ na cabeça associada ao HPV e carcinoma de células escamosas pescoço. O ensaio RNAscope é totalmente compatível com o tecido do tumor rotineiramente fixo e preserva a morfologia do tecido para as correlações histopatológicas (Figura 2). Uma vantagem chave do ensaio em relação aos métodos RNAscope CISH convencionais é que especificamente amplifica os sinais de hibridação (Figuras 2B e 2E) sem amplificação do ruído de fundo (Figuras 2C e 2F). Na prática, o procedimento de ensaio RNAscope HPV pode ser concluída dentro de 8 horas ou convenientemente dividido em dois dias. O ensaio RNAscope HPV tem sido usado para determinar a infecção por HPV na cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas 12-16, que demonstra a sensibilidade 97% e especificidade de 93% utilizando qRT-PCR, como o método de referência 16. Chr convencionalISH omogenic para HR-HPV DNA é altamente específico, mas tem uma sensibilidade de 80% ~ 12. Imuno-histoquímica (IHQ) coloração para o celular substituto marcador p16 demonstra excelente sensibilidade, mas podem gerar resultados falsos positivos 15,18, especialmente na cabeça e pescoço nonoropharyngeal 15. O atual método &quot;padrão ouro&quot; de qRT-PCR para HPV E6/E7 detecção do RNAm requer tecido fresco congelado para melhores resultados e é tecnicamente complexo, o que limita seu uso apenas para o laboratório de pesquisa. Além disso, requer a extração de RNA que torna impossível correlacionar expressão HR-HPV E6/E7 mRNA com a histopatologia. Há vários fatores críticos para o sucesso do ensaio RNAscope. Primeiro, para obter melhores resultados, os tecidos devem ser fixados em formalina a 10% fresco neutro tamponado à temperatura ambiente durante 16-32 horas de acordo com as diretrizes da ASCO / CAP 19. Em segundo lugar, o forno HybEZ é altamente recomendado, uma vez que permitemé um óptimo controlo de temperatura e umidade para a hibridização da sonda e as etapas de amplificação de sinal. Em terceiro lugar, é importante para remover o excesso de buffers residuais antes de cada passo, mas ainda manter a secção de tecido de secagem durante qualquer uma dessas etapas. O procedimento RNAscope manual descrita aqui tem sido completamente automatizada em um sistema de corrediça-coloração automóvel comercial 10. Isso deve facilitar muito a normalização das condições de ensaio e salvar o trabalho manual precioso em laboratórios de patologia clínica. Além disso, o software de análise de imagem dedicado foi desenvolvido 10 para identificar automaticamente as células e sinais de coloração em um slide digitalizado, o que deve ajudar a eliminar a subjetividade e melhorar a reprodutibilidade na pontuação. Em resumo, o ensaio RNAscope HPV detecta a presença de transcritos de E6/E7 de HPV-RH in situ de mRNA em tecidos FFPE. Tem um fluxo de trabalho que é familiar para labora patologia clínicatories por permitir a visualização direta destes em cortes de tecido. Ele oferece uma plataforma ideal para o exame (FFPE) amostras de tecido, e pode ser facilmente adotado por laboratórios de patologia de diagnóstico.

Contas de infecção pelo papilomavírus humano de alto risco (HR-HPV) para cerca de 5% de todos os cânceres em todo o mundo 1. A incidência de câncer de orofaringe associadas ao HPV tem aumentado nas últimas décadas, especialmente entre os homens. Carcinoma HPV-positivos orofaríngeo de células escamosas (OPSCC) provavelmente constituem a maioria de todos os cânceres de cabeça e pescoço, nos Estados Unidos nos próximos 20 anos 2. Carcinomas de células escamosas da orofaringe causados ​​pelo HPV estão associados com a sobrevivência favorável e status HPV tumor é um fator prognóstico forte e independente para a sobrevivência 3. Evidência para a ativação da transcrição dos oncogenes virais E6 e E7 é considerada o padrão ouro para a presença de HPV clinicamente relevante 4. No entanto, a detecção de ARNm de E6/E7 de tecido de tumor fresco pela técnica de RT-PCR não é prático na prática clínica de rotina e tem sido limitada aos laboratórios de investigação. Recentemente, nós have desenvolveu uma tecnologia de RNA ISH romance chamado RNAscope, que permite a detecção multiplex em células individuais com uma única molécula de RNA sensibilidade em formalina parafina fixo amostras de tecido incorporados (FFPE) 5-10. Nós fornecemos três linhas de evidência para uma única molécula de detecção 5. Primeiro, o design e sistema de amplificação de sinal de sonda RNAscope permitiu a detecção de uma única cópia HER2 alvos de DNA genômico em HeLa e SK-BR-3 linhas celulares. Em segundo lugar, quando comparado com os sinais de ADN genómico de HER2, a distribuição das intensidades de fluorescência do sinal HER2 mRNA pontos em células HeLa era consistente com uma molécula por ponto. Em terceiro lugar, o número de sinais de HER2 de mRNA por célula pontos combinados intimamente o número de cópias de mRNA HER2 estimado por um ensaio de quantificação baseado em solução, apoiando ainda mais a detecção de uma única molécula. Além disso, a coloração de contraste de núcleos com DAPI em microscopia fluorescente ou com hematoxilina em microscopia de campo claro permite a visualização de núcleos individuais, which por sua vez, permite a detecção e quantificação de alvos de ARN sobre uma base de uma única célula 10. A capacidade de analisar a expressão do gene in situ em amostras clínicas de rotina faz RNAscope uma plataforma promissora para o diagnóstico da patologia, especialmente os ensaios baseados em secção de tecido FFPE 10,11. Nós desenvolvemos um ensaio de HPV baseada em RNAscope para detectar ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Nossos estudos recentes em OPSCC têm mostrado que o ensaio RNAscope HPV é altamente sensível e específico para determinar o status do HPV em tecidos FFPE 12-17, e também informa o prognóstico em OPSCC 12,16. O princípio da tecnologia RNAscope foi anteriormente descrito 5. Aqui, nós descrevemos o protocolo de ensaio RNAscope completa e demonstrar a sua utilização na detecção de HR-HPV em secções de tecidos tumorais FFPE.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

O &quot;padrão ouro&quot; para detecção de HPV oncogênico é a demonstração de HPV de alto risco transcricionalmente ativo no tecido tumoral. No entanto, a detecção de E6/E7 mRNA por transcrição Polymerase Chain Reaction reversa quantitativa (qRT-PCR) requer a extração de RNA que destrói o tecido tumoral contexto crítico para a correlação morfológica e tem sido difícil de ser adotada na prática clínica rotineira. Nosso RNA recentemente desenvolvido em tecnologia de hibridização in situ, RNAscope, permite a visualização direta de RNA em, (FFPE) tecido embebido em parafina fixado em formalina com sensibilidade única molécula e resolução de uma única célula, o que permite altamente sensível e específico na análise in situ de qualquer biomarcador RNA em amostras clínicas de rotina. O ensaio RNAscope HPV foi concebido para detectar o ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Ela demonstrou excelente sensibilidadee especificidade em relação ao método atual &quot;padrão ouro&quot; de detectar E6/E7 mRNA por qRT-PCR. Estado HPV determinado pela RNAscope é fortemente prognóstico do resultado clínico em pacientes com câncer de orofaringe.

Fluxo de trabalho de ensaio RNAscope HPV O ensaio RNAscope tem um fluxo de trabalho altamente simplificada, que é semelhante à de IHC (Figura 1). Ele consiste em quatro etapas principais: pré-tratamentos, hibridação, amplificações de sinal e de detecção. Ele emprega uma estratégia de design da sonda única que garante sinal de alta fidelidade amplificação 5. No ensaio RNAscope HPV, os sete conjuntos de sonda HR-HPV são reunidas, todos reconhecidos pelo mesmo sistema de amplificação de sinal ligado a peroxidase de rábano (HRP). Sinais de hibridação específicos são detectados como precipitados castanhos formados por reacção catalisada por HRP cromogénico utilizando DAB como substrato, o qual pode ser facilmente visualizadas por microscopia de campo brilhante standard. Coloração Representante para detecção do HPV A Figura 2 mostra exemplos de imagens de cortes corados FFPE de cabeça e carcinoma de células escamosas pescoço. No caso de HPV-positivos (Fig.ure 2A), as sondas de HR-HPV detectado sinais puntiformes fortes especificamente nas células tumorais. A sonda detectada UBC numerosos sinais citoplasmáticos puntiformes em ambas as células tumorais e as células do estroma (figura 2B). A sonda dapB gene bacteriano demonstrou um fundo limpo (Figura 2C). No caso de HPV-negativo, tanto a sonda HR-HPV e a sonda dapB detectado nenhum sinal (Figuras 2D e 2F), enquanto que os sinais fortes foram detectados utilizando a sonda de UBC (Figura 2E). Neste ensaio, UBC serve como controlo positivo para avaliar a qualidade do RNA de tecido e dapB como controlo negativo para os sinais espontâneos. A pontuação para determinação do estatuto de HPV envolve examinar todas as três lâminas para cada caso. O nível de coloração no controlo deslizante negativo (dapB) corrediça é utilizada como ponto de corte: positividade HPV é definida pela presença de citoplasmática punctata e / ou coloração nuclear que era anteriormente o sinal no slide dabpB. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma de ensaio RNAscope. Ilustração de fluxo de trabalho de ensaio RNAscope. O ensaio RNAscope contém quatro etapas principais, pré-tratamentos, a hibridação sonda alvo, amplificação de sinal e detecção do sinal. O procedimento de ensaio completo pode ser concluído em 8 horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens exemplo de lâminas RNAscope coradas seções FFPE corados com sondas para HR-HPV, UBC (controle positivo) e dapB (controle negativo).a partir de dois casos HNSCC. AC. Caso de HPV positivo. A, expressão de E6/E7 do HPV HR-mRNA nas células tumorais. Inset, aumento de 40 vezes para mostrar sinais puntiformes. B e C) cortes de tecidos adjacentes que apresentam coloração positiva UBC (B) e negativo para dapB (C), respectivamente DF) HPV-negativos caso. D). Nenhuma coloração para HPV E6/E7 mRNA , similar ao controle negativo dapB (F). E) UBC coloração positiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

A presença de HPV de alto risco no tecido do tumor de cabeça e pescoço está associada a resultados favoráveis. O RNA recentemente desenvolvido na técnica de hibridização in situ chamado RNAscope permite a visualização direta de HPV E6/E7 mRNA em cortes de tecido FFPE.

RNAscope para<em&gt; Em situ</em&gt; Detecção de Papilomavírus Humano transcricionalmente ativo em Cabeça e Pescoço Carcinoma de células escamosas

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

27.0K visualizações.  Advanced Cell Diagnostics, Inc..  A presença de HPV de alto risco no tecido do tumor de cabeça e pescoço está associada a resultados favoráveis. O RNA recentemente desenvolvido na técnica de hibridização in situ chamado RNAscope permite a visualização direta de HPV E6/E7 mRNA em cortes de tecido FFPE. 