The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.

1. Induktion der Differenzierung in weiblich embryonalen Stammzellen zu X-Chromosom-Inaktivierung herbei HINWEIS: Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus (auf Anfrage erhältlich) werden unter Standardbedingungen auf ES-Zellkulturschalen verkleistert mit embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) beschichtet gewachsen. Wir hier davon aus, dass der Leser mit Standardzellkulturtechniken 39-41 vertraut ist. Um die Differenzierung zu induzieren, werden ES-Zellen in T25 Schalen gezüchtet aus den MEFs getrennt werden, und wird in Differenzierungsmedium plattiert werden. <ol><li> Entfernen ES-Medium aus der ES-Zell-Kultur, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. </li><li> 1,5 ml Trypsin-EDTA (37 ° C vorgewärmt) und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 7 min. Nach 3,5 min, schütteln die Schale vorsichtig, brechen die Kolonien. </li><li> Inaktivierung des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3,5 ml Differenzierungsmedium zu den Zellen. Pipette Zellen nach oben und unten, um eine einzelne Zelle Lösung zu erhalten, und sammelnin einem 15-ml-Tube. Spin für 5 min bei 200 × g gesammelt und Zellen in 10 ml Differenzierungsmedium. </li><li> Hinzufügen Zellsuspension auf eine nicht-gelatinierten Kulturschale, und Inkubation für 1 h in einem Zellkulturbrutschrank. HINWEIS: MEFs in der Lage, mit dem nicht-gelatinierten Kulturschale anhaften, während ES-Zellen in Suspension verbleiben. </li><li> In der Zwischenzeit, fügen sterilisierte Glasdeckgläser (24 x 24 mm) auf 6-Well-Platten mit 0,2% Gelatine und inkubieren minimal 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 1 Stunde Sammeln des Überstands des vorgalvanisierten ES-Zellkultur, die hauptsächlich aus wird der nichthaftenden ES-Zellen. Platte ES-Zellen zu 6-well-Platten mit Deckgläsern. HINWEIS: Verwenden Sie ⅙ th einer konfluenten T25 Gericht für 6 Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Dies wird eine Differenzierung konfluenten gut nach 3 Tagen der Differenzierung zu ermöglichen. Änderungsmedium auf einer täglichen Basis. Für längere Zeit Differenzierungskurse, Platte vor, vernickelt ES-Zellen in Differenzierungsmedium in bakteriellen Gerichte und incubaß auf einem Schüttler Zelle in den Zellkulturbrutschrank integriert. Dies ermöglicht es den Zellen, embryonale Körper, die 1-2 Tage vor der Fixierung auf Deckgläsern ausplattiert werden können zu bilden. </li></ol> 2. Fixierung von differenzierten ES-Zellen für spätere DNA-RNA-FISH-Analyse <ol><li> Entfernen Differenzierungsmedium von Differenzierung Kulturen, und zweimal waschen mit Zellkultur PBS. HINWEIS: In den PBS sorgfältig verhindern, dass die Zellen weggewaschen. </li><li> Entfernen Zellkultur PBS und fixieren Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd (PFA) / PBS und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. ACHTUNG: PFA ist giftig und kann erhebliche gesundheitliche Risiken verursachen, wenn sie eingeatmet oder wenn sie in Kontakt mit Haut oder Augen. Darüber hinaus ist PFA krebserregend. </li><li> Entfernen Sie 4% PFA / PBS und Deckgläser 3x waschen mit 70% Ethanol. HINWEIS: Richtig Waschen ist wichtig, da eine Spur von PFA wird mit anschließender FISH Schritte stören. Deckgläser in 70% Ethanol bei -20 ° C für mehrere Monate vor der F gespeichert werdenISH-Analyse. </li></ol> 3. Markierung von DNA-Sonden für FISH Experimente HINWEIS: Besorgen Sie sich ein DNA-Fragment mit dem Gen von Interesse (Mindestlänge&gt; 2 kb für die RNA-FISH, oder&gt; 20 kb für die DNA-FISH), oder eine BAC für das Gen von Interesse. Für RNA-Nachweis kann eine kleinere Sonde ausreichend sein im Vergleich zu den DNA-Nachweis, da wahrscheinlich die Transkription in mehreren Transkripte, die gleichzeitig detektiert werden können führen. Für ein starkes Signal auf der Einzelkopie-DNA-Strang wird eine längere Sonde erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl von einge Haptene erkennen. Vorzugsweise wird ein nicht-transkribierte genomische Region für die Gestaltung der DNA-Sonde ausgewählt. Wenn außerdem die Verwendung einer kleineren Sonde, um die RNA zu detektieren, wird es verhindert, dass die genomische Loci von der die RNA transkribiert wird, die in der kombinierten DNA-RNA-FISH Ansatz erkannt, obwohl dies nicht ganz ausgeschlossen werden kann. Um zu erkennen, Maus Xist wurde ein 5,5 kb cDNA-Sonde verwendet. Für detbschnitt des X-Chromosoms, BAC mehrere Sonden verwendet werden. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung aus BAC RP23-100E1 und 474E4-BAC CT7, die in der Nähe des Ortes angeordnet sind Xist ermittelt. Je nach dem Gen oder Chromosom von Interesse ist, kann mehrere unterschiedliche Sonden erforderlich, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Immer, wenn die Arbeit mit Materialien, die für RNA-FISH verwendet werden soll, verwenden Sie sterile Filterspitzen, RNase-freiem H 2 O, und die Arbeit in einer sauberen Umgebung. <ol><li> Nimm 1 ug DNA und verdünnt in H 2 O in einem Gesamtvolumen von 16 ul. In 4 ul von Digoxigenin oder Biotin Markierungslösung (siehe Reagenzien), durch Vortexen mischen und Inkubation bei 16 ° C für 90 min. HINWEIS: Die Biotin oder Digoxigenin markierten Nukleotiden wird nun durch Nick-Translation eingebaut werden. </li><li> In der Zwischenzeit bereiten G50 Spalten auf nicht-integrierte Nukleotide zu entfernen. Nehmen Sie ein 2-ml-Spritze, entfernen Sie den Stempel, und fügen sterilisiert Baumwolle in die Spritze. In G50-Kugeln in Lösung to Füllen der Spritze, Spritze in einem 15 ml-Zentrifugenrohr und bei 642 g für 1 min. HINWEIS: Rund 80% der Spritze sollte jetzt mit G50 gefüllt werden. Wiederholen Sie, wenn weniger G50 vorhanden ist. </li><li> Nach 90 min werden 40 ul H 2 O zu der Nick-Translation Reaktionsgemisch, und fügen Sie die Reaktion auf die Säule G50. Fügen Sie ein Leerrohr unter der Spalte und Zentrifugieren bei 642 g für 2 min. Die Strömung durch Sammeln in einem Reaktionsrohr. </li><li> Messung des Volumens der Strömung durch mit einer Pipette, und geben H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 200 &amp;mgr; l zu erreichen. Ausfällung der Strömung durch Zugabe von 13,3 ul Lachssperma-DNA (10 mg / ml), 13,3 ul Hefe-tRNA (10 mg / ml), 26,7 &amp;mgr; l Maus Cot-1-DNA (1 mg / ml) und 28 ul 2 M NaAc, pH-Wert 5.6. Mischen durch Vortexen, und fügen Sie 533 ul eiskaltem 100% Ethanol. Schütteln des Röhrchens und Zentrifuge bei 16.200 × g für 30 min bei 4 ° C </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Wasch Pellet zweimal mit 70% Ethanol. Zentrifugieren bei 16.200 × g für 5 min bei4 ° C und an der Luft trocknen die Pellets. Dann werden 50 &amp;mgr; l Hybridisierungslösung + 50, und bei 37 ° C für 30 min bis Auflösen zu erleichtern. HINWEIS: Die markierte Sonde kann für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden ACHTUNG: 50 + Hybridisierungslösung enthält Formamid, das giftig ist, kann die Haut, die Augen und die Atemwege reizen, und ist auch ein teratogen. </li></ol> 4. Permeabilisierungs, Vorbehandlung und Hybridisierung der fixierten Zellen für den kombinierten DNA-RNA-FISH <ol><li> Rehydrieren fixierten Zellen auf Deckgläsern, indem 70% Ethanol und die Zugabe von Zellkultur PBS auf die 6-well-Platten. Inkubation für 5 min. Wiederholen insgesamt drei Mal. </li><li> Zellkultur-PBS entfernen, und fügen Sie 0,2% Pepsin zu den 6-Well-Platten, um die Zellen permeabilisiert. Inkubieren Platten mit 6 Vertiefungen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 4 min. Entfernen Pepsin, und inaktivieren mit RNAse freien H 2 O. </li><li> Postfix-Zellen durch Inkubation mit 4% PFA / PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach fixatiauf, zweimal waschen mit Zellkultur PBS für 5 min. </li><li> Dehydratisieren Zellen durch Inkubation mit 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Überdeckgläser aus der 6-Well-Platten und an der Luft trocknen Deckgläser für einige Minuten. </li><li> Alter Zellen durch Inkubation Deckgläser bei 65 ° C für 1 Stunde auf einer Wärmeplatte. </li><li> Pre-FISH-Sonde hybridisieren, mit Maus-Cot-1 DNA durch Addition zu jedem Deck analysiert, 25 ul 50 + Hybridisierungslösung, 0,5 &amp;mgr; l Maus-Cot-1-DNA, 1 &amp;mgr; l Biotin-markierten Sonde Xist und 1 &amp;mgr; l Digoxigenin markierten BAC-Sonde Erfassung der X-Chromosom. Vortexen und Denaturierung bei 99 ° C für 5 min. Inkubation sofort auf 37 ° C für 45 min, damit Cot-1-DNA zu hybridisieren, um in den Sonden vorhandenen Sequenzen wiederholen. </li><li> Nach der Alterung Stelle 50 ul Denaturierungspuffer (bestehend aus 70% formamide/2x SSC/10 mM Phosphatpuffer) auf einem Glasträger und Deckgläser gelegt oben mit Zellen gegen towards Denaturierung Puffer. Inkubieren bei 65 ° C für 2 min. </li><li> In Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und Post-fix-Zellen durch Inkubation in eiskaltem 70% Ethanol für 5 min. </li><li> Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten. </li><li> Finde Pre-hybridisierten Sonde auf einem Glasobjektträger und Deckglas auf inkubiert. Die Objektträger in einer feuchten Kammer mit 50 ml 50% formamide/2x SSC gefüllt und inkubiert über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> 5. Post-Hybridisierung Waschanlagen und Antikörper-vermittelte Erkennung von Probe <ol><li> Füllen 6-Well-Platten mit 2x SSC und Pre-warmen bis 42 ° C Hinzufügen Deck nach Inkubation über Nacht, und Inkubieren bei 42 ° C für 5 min. </li><li> Entfernen 2x SSC, und Inkubieren Deckgläser mit 50% formamide/2x SSC für 10 min bei 42 ° C. Wiederholen Sie insgesamt 3-mal (30 min Waschen insgesamt). </li&gt; <li> Entfernen von 50% formamide/2x SSC und Waschen Folien mit Tris-Kochsalzlösung-Tween (TST) für 2 x 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Punkt 50 ul Tris-Kochsalzlösung-BSA (TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für die Sperrung während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Schaf-anti-Dig-Antikörper (1:500 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation upside-down für den ersten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den zweiten Schritt der Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . </li><li> Transfer Deckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Spot 50 ul Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit FITC (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger und Deckgläser inkubieren Kopf zum dritten Inkubationsschritt bei 30 min bei Raumtemperatur in einem TST-befeuchteten Dunkelkammer . </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Maus-Anti-Biotin-Antikörper (1:200 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf für den vierten Schritt während der Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Esel-Anti-Maus-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum fünften Inkubationsschritt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchtet dunklen chambäh. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. </li><li> Punkt 50 ul Ziege-anti-Pferd-Antikörper konjugiert mit Rhodamin (1:250 in TSBSA) pro Deckglas auf neue Glasobjektträger, Deckgläser und Inkubation Kopf zum sechsten Schritt die Inkubation während 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer TST-befeuchteten dunkle Kammer . HINWEIS: die Ziege-anti-Pferd-Antikörper die Esel-anti-Maus-Antikörper zu erkennen; wenn verfügbar, um den Forscher, wird ein Ziege-anti-Antikörper Esel so gut funktionieren. </li><li> Überdeckgläser wieder auf 6-Well-Platten, und waschen 2 x 5 min mit TST. Waschen Sie weitere 5 min mit Tris-Kochsalzlösung (TS). </li><li> Dehydratisieren Zellen durch anschließende Inkubation in 70% Ethanol für 3 min, 90% Ethanol 3 min und 100% Ethanol für 3 min. Deckgläser entfernen von 6-Well-Platten und der Luft trocknen lassen für einige Minuten. </li><li> Spot eine Tropfen Eindeckmedium mit DAPI (siehe Reagenzien) auf einen Objektträger und Deckglas fügen Kopf an der Spitze. Siegel Dias mit Nagellack undbeurteilen FISH-Ergebnisse durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 1). </li></ol>

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S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells.">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development.">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li><li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing.">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA,+DNA,+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence.">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li><li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center.">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells.">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li><li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture.">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kombinierte DNA-RNA-FISH technisch eine Herausforderung sein, die Bedingungen für DNA-FISH können zu hart für weniger stabile RNA-Moleküle sein. Es wurden verschiedene Ansätze angewendet, um sowohl DNA als auch RNA in einer Zelle zu untersuchen, unter Umgehung der Notwendigkeit einer gleichzeitigen Inkubation mit Sonden Erfassen sowohl der DNA und RNA. Beispielsweise in einer Überlagerungsansatz wird zuerst RNA-FISH durchgeführt, und die Zellen abgebildet werden, und die Koordinaten genommen werden. Anschließend...

Studieren Zellen und Gewebe mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hat sich seit ihrer Einführung in den späten 1970er Jahren ein, konnten die Forscher um Gene, Chromatin-Organisation und Genexpression auf subzellulärer Ebene zu studieren. DNA-FISH wird häufig in Zytogenetik, Karyotypisierung 2, 3 und Krebsdiagnostik Präimplantations-Screening-4 verwendet wird, und hat eine wichtige Rolle in der Molekularforschung 6.5, da es die Detektion von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht. Einzelzell-Expressionsanalyse von RNA-FISH können native primären Transkripte zu erkennen und nicht-kodierenden RNAs transkribiert Chromosomen aus und bietet Vorteile gegenüber anderen Techniken, die Genexpression auf Bevölkerungsebene Einschätzung liegen, wie beispielsweise quantitative RT-PCR, genomweite Expressionsanalyse oder Northern Blot . Durch die Visualisierung RNA-Transkripte, die direkt aus ihren Ursprungsorten hat es zum Beispiel gewesen,bemerkt, dass die Genexpression stochastischen 7, und kann manchmal allelspezifische 8 sein. Verbesserungen in der Technik sogar erlaubt den Nachweis und die Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle innerhalb von Zellen 9-11. Das Grundprinzip besteht aus FISH-Hybridisierung von Nukleinsäuren in der Zelle zu einer Nukleinsäuresonde mittels hochspezifische Watson und Crick Basenpaarung. Die Sonde kann entweder direkt oder indirekt erfasst, was zu einem Signal, das mikroskopisch sichtbar gemacht werden kann. Anfängliche Versuche bestand aus radioaktiv markierten Sonden, die Nachteile der Grundlage von Sicherheitsfragen, begrenzte räumliche Auflösung und die Fähigkeit, nur ein Ziel zu einer Zeit zu erfassen 12-14 hatten. Die weitere Entwicklung der nicht-radioaktiven Labels, darunter Fluorochrome, Haptene, und Enzyme, hat die weit verbreitete Nutzung von FISH als Routine Molekularbiologie Technik erlaubt. Die FISH-Sonde kann entweder direkt mit fluoroch gekennzeichnet werdenromes durch chemische Verknüpfung der Fluoreszenzmoleküle an Nukleinsäure-Sequenzen 15 und die Integration der fluoreszierend markierten Nucleotide 16-19, oder die Sonde kann indirekt nach Integration Haptene (wie Biotin und Digoxigenin) und immunologischen Nachweis von Haptenen durch Hapten spezifischen Antikörper konjugiert visualisiert fluoreszierenden Reportermoleküle 20-21. Der letztere Ansatz erlaubt eine Signalverstärkung durch die Verwendung mehrerer Schichten aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die verwendet werden, um das ursprüngliche Signal zu verstärken, und ermöglicht den Nachweis von RNA-Spezies, die auf niedrigem Niveau exprimiert werden. Durch die Kombination von direkten und indirekten Markierungstechniken und verschiedene Haptene können mehrere Ziele gleichzeitig innerhalb der gleichen Zelle sichtbar gemacht werden. Einer der wichtigsten Schritte bei der FISH-Protokolle ist die Hybridisierung der Sonde an ihr Ziel. Obwohl in der Theorie, eine Sonde zu binden, die spezifisch nur an sein Ziel in der Praxis diese Spezifitätist nicht immer erreicht, da Sonden, um homologe Regionen binden und Hybridisierungsbedingungen nicht immer ideal für eine bestimmte DNA-Region oder RNA Spezies. Post-Hybridisierungswaschanlagen sind daher von besonderer Bedeutung, da sie die Stringenz der FISH-Verfahren zu erhöhen, und kann nicht-spezifische Bindung von FISH-Sonden, die in einem hohen Pegel von Hintergrundrauschen führen würde. Wie RNA-Moleküle werden Einzelstrang können sie leicht zu einer FISH-Sonde hybridisiert werden. Im Gegensatz dazu benötigt das doppelsträngige DNA-Molekül einen ersten Denaturierungsschritt, wonach eine Sonde hybridisieren kann. Dies wird normalerweise durch Erhitzen der Probe, die Denaturierung der DNA Ergebnisse erzielt. Doch unter diesen harten Bedingungen kann zerbrechlich, einsträngige RNA-Moleküle verloren. Daher kombinierten DNA-RNA-FISH erfordert erhebliche Optimierung der Bedingungen und ist technisch anspruchsvoll gegenüber der getrennten Erkennung von nur RNA oder DNA. Hier haben wir Präsentationta detailliertes Protokoll der kombinierten, gleichzeitigen DNA-RNA-FISH, die uns erlaubt hat, X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) bei der Differenzierung von weiblichen Maus embryonale Stammzellen 22-24 studieren. XCI ist ein entscheidender epigenetischen Mechanismus für weibliche Embryonalentwicklung 25 und führt heterochromatinization und somit Silencing eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Individuen 26-27. Wesentlich für dieses Verfahren ist die nicht-kodierende RNA Xist 28-30, die durch die RNF12 22-23 und 24 REX1 Proteine ​​reguliert wird. Xist Expression wird über die Zukunft inaktiven X-Chromosom (Xi) während der embryonalen Entwicklung oder bei der ES-Zelldifferenzierung in vitro hochreguliert und kann entlang der X-Chromosom verteilt und dadurch gewinnen Chromatin Remodeling Enzyme, die in der Transkriptionsherunterfahren des X-Chromosoms 31 führen. Diese Ausbreitung Xist RNA durch RNA-FISH als Beschichtung des X-Chromosom visualisierteinige, die auch als Xist Wolke bezeichnet wird. Da weibliche ES-Zellen können einem ihrer X-Chromosomen durch genomische Instabilität zu verlieren, wir und andere kombinierte DNA-RNA-FISH eingesetzt haben, XCI zu untersuchen, um sicherzustellen, dass nur karyotypisch stabile Zellen werden in der Analyse dieses wichtigen Prozesses 22,32 bewertet -34. Wie in jedem molekularbiologischen Technik haben mehrere ausgezeichnete Protokolle veröffentlicht 35-38. Hier präsentieren wir unsere Methode, ausgehend von der Induktion der Differenzierung in Maus-ES-Zellen, Fixierung von Zellen, die Kennzeichnung von FISH-Sonden durch Nick-Translation, Vorbehandlung von fixierten Zellen zu ermöglichen Permeabilisierung und anschließender Sondenaufnahme, Hybridisierung der Sonde an die Ziel und schließlich Detektion der Sonde durch Fluoreszenz-markierten Antikörpern. Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Gläubigen Erkennung von Xist RNA und das X-Chromosom innerhalb einer Frist von zwei Tagen, und die Grundlagen dieser Technik kann wahrscheinlich angepasst werden otihre Systeme und Forschungsbereiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">female mouse embryonic stem cells</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">will be made available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse embryonic fibroblasts</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell culture medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM &#223;-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4&#186;C for maximal 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">LIF</td>
			<td style="width:124px;">Chemicon</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11960085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin&#8211;streptomycin (100&#215;)</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Non-essential aminoacids&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">&#223;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell differentiation medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 &#956;l/l monothioglycerol and 50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">IMDM-Glutamax</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Ascorbic acid (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">monothioglycerol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">T25 cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">6-well cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">cell culture grade PBS</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">falcon tubes</td>
			<td style="width:124px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">24x24 mm coverslips</td>
			<td style="width:124px;">Menzle</td>
			<td align="right" style="width:119px;">780882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">gelatin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 &#7484;C until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20&#7484;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">absolute 100%&#160; ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32221-2.5L</td>
			<td>use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">RNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Baxter</td>
			<td>TKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">sterile filter tips</td>
			<td style="width:124px;">Rainin Bio Clean</td>
			<td style="width:119px;">GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745816910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745824910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Sephadex G50</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2 ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">BD Plastipak</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">sterilized cotton</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">yeast tRNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse cot-1 DNA&#160; 1 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf bench top microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Eppendorf Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5810R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M NaAc, pH 5.6</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50+ hybridization solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">formamide</td>
			<td style="width:124px;">Acros organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">dextran sulfate</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">pepsin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td>prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 &#181;l 37% HCL per 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">HCL, 37% solution&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">object glasses</td>
			<td style="width:124px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">20x SSC</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9763</td>
			<td>dilute to 2x SSC in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">10 mM Phosphate buffer, pH 7</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">denaturation buffer</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tween-20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M Tris pH 7.5 solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tris-Saline-Tween washing solution (TST)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#181;l Tween-20, add RNAse free water till 1 liter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">10x Saline solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline-BSA (TSBSA)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>500 &#956;l 10x Saline, 250 &#956;l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">BSA, purified, 100x&#160;</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">sheep-anti-dig antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:500 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse-anti-biotin antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:200 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline washing solution (TS)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:124px;">Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nail-varnish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">fluorescent miscroscope</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die die molekularen Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen ermöglicht. FISH DNA ist oft in der Zytogenetik und Krebsdiagnostik verwendet und können Aberrationen des Genoms, die oft wichtige klinische Auswirkungen erkennen. RNA-FISH können verwendet werden, um RNA-Moleküle in Zellen zu erfassen und wichtige Einblicke in die Regulation der Genexpression zur Verfügung gestellt. Die Kombination von DNA-und RNA FISH innerhalb der gleichen Zelle ist technisch anspruchsvoll, da die Bedingungen für DNA-FISH vielleicht zu hart für zerbrechlich, einzelsträngige RNA-Moleküle sein. Wir präsentieren hier eine leicht anwendbare Protokoll, das die kombinierte, simultane Detektion von Xist RNA und DNA von den X-Chromosomen kodiert ermöglicht. Diese kombinierte DNA-RNA-FISH-Protokoll kann wahrscheinlich andere Systeme, bei denen sowohl RNA und DNA nachgewiesen werden müssen aufgebracht werden.

Verwendung des vorstehend erwähnten Protokolls für den kombinierten DNA-RNA-FISH, waren wir in der Lage, X-Chromosom Inaktivierung der Differenzierung embryonaler Stammzellen weiblichen visualisieren. Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel für ein DNA-RNA-FISH-Experiment, wo wir beide Xist (was detektiert als sogenannte Xist RNA Wolke auf dem inaktiven X-Chromosom und einem basalen Transkriptionspunkt auf dem aktiven X-Chromosom) und einer Region des X-Chromosoms, die als punktS...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

27.5K Aufrufe.  Erasmus MC - University Medical Center.  Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen. 

Serie: Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...