The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.

1. Induction de la différenciation dans Femme cellules souches embryonnaires à induire des inactivation du chromosome X REMARQUE: Femme de cellules souches embryonnaires de souris (disponible sur demande) sont cultivées dans des conditions de cellules ES standard sur des boîtes de culture gélifiés revêtues de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Nous supposons ici que le lecteur est familier avec les techniques de culture cellulaire standard 39-41. Pour induire la différenciation, les cellules ES cultivées dans des boîtes de T25 seront séparés des MEF, et seront étalées dans un milieu de différenciation. <ol><li> Retirez le milieu ES de la culture de cellules ES, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. </li><li> Ajouter 1,5 ml de trypsine-EDTA (préchauffée à 37 ° C), et incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. Après 3,5 min, secouer le plat délicatement pour briser les colonies. </li><li> Inactiver la trypsine-EDTA par addition de 3,5 ml de milieu de différenciation pour les cellules. cellules de pipette de haut en bas pour obtenir une solution d&#39;une seule cellule, et recueillentdans un tube de 15 ml. Spin pendant 5 min à 200 x g, et recueillir les cellules dans 10 ml de milieu de différenciation. </li><li> Ajouter la suspension cellulaire à une boîte de culture non-gélatinisé, et incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture cellulaire. NOTE: MEF seront capables d&#39;adhérer à la boîte de culture non-gélatinisé, alors que les cellules ES resteront en suspension. </li><li> Dans le même temps, ajouter des lamelles de verre stériles (24 x 24 mm) sur des plaques à 6 puits, ajouter 0,2% de gélatine, et incuber pendant un minimum de 5 min à température ambiante. </li><li> Après 1 heure, recueillir le surnageant de culture de cellules ES pré-plaqué, qui sont principalement des cellules ES non-adhérents. Plate cellules ES à plaques à 6 puits contenant des lamelles. REMARQUE: Utilisez ⅙ e d&#39;un plat confluent T25 pour 6 puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ceci permettra une différenciation confluente bien après 3 jours de différenciation. Changer le milieu sur une base quotidienne. Pour plus des cours de temps de différenciation, les cellules ES plaque pré-plaqués en milieu de différenciation dans les plats bactériennes, et Incubmangé sur un agitateur de cellule intégré dans l&#39;incubateur de culture cellulaire. Cela permettra aux cellules pour former des corps embryoïdes qui peuvent être plaqués à lamelles 1-2 jours avant la fixation. </li></ol> 2. Fixation des cellules différenciées ES pour une analyse ultérieure FISH ADN-ARN <ol><li> Retirez milieu de différenciation des cultures de différenciation, et laver deux fois avec la culture de cellules PBS. NOTE: Ajouter PBS avec soin pour éviter les cellules emportés. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS et fixer les cellules en ajoutant 4% de paraformaldéhyde (PFA) / PBS, et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: PFA est toxique et peut entraîner un risque important pour la santé lorsqu&#39;il est inhalé ou au contact de la peau ou des yeux. En outre, l&#39;IFP est cancérigène. </li><li> Retirer 4% PFA / PBS, et laver lamelles 3x avec 70% d&#39;éthanol. NOTE: Corriger lavage est importante, car aucune trace de PFA va interférer avec les étapes ultérieures de POISSON. Les lamelles couvre-peuvent être stockés dans 70% d&#39;éthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant Fanalyse de l&#39;ISH. </li></ol> 3. Étiquetage des sondes d&#39;ADN pour les expériences de FISH REMARQUE: Obtenir un fragment d&#39;ADN du gène d&#39;intérêt (longueur minimale&gt; 2 ko pour l&#39;ARN FISH, ou&gt; 20 kb de l&#39;ADN FISH), ou un BAC couvrant le gène d&#39;intérêt. Pour la détection de l&#39;ARN, une sonde plus petite peut être suffisante par rapport à la détection de l&#39;ADN, la transcription depuis le plus probable se traduira par des transcriptions multiples, qui peuvent être détectés simultanément. Pour un signal fort sur le seul brin d&#39;ADN copie, une sonde plus longue est nécessaire, pour être en mesure de détecter un nombre suffisant d&#39;haptènes incorporés. De préférence, une région génomique non transcrite est choisie pour la conception de la sonde d&#39;ADN. En outre, lors de l&#39;utilisation d&#39;une sonde plus petite pour détecter l&#39;ARN, on a empêché que le locus génomique à partir de laquelle l&#39;ARN est transcrit n&#39;est détecté dans l&#39;approche combinée FISH ADN-ARN, bien que cela ne peut pas être entièrement exclue. Pour détecter les souris Xist, une sonde d&#39;ADNc de 5,5 kb a été utilisé. Pour detection du chromosome X, plusieurs sondes BAC peuvent être utilisés. De bons résultats ont été obtenus avec un mélange de BAC RP23-100E1 et 474E4 CT7-BAC, qui sont situés à proximité immédiate du locus Xist. Selon le gène ou d&#39;un chromosome d&#39;intérêt, plusieurs sondes différentes peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux. Pour travailler avec des matériaux qui seront utilisés pour l&#39;ARN-FISH, utiliser des embouts stériles de filtre, RNAse H 2 O, et de travailler dans un environnement propre. <ol><li> Prendre 1 pg d&#39;ADN et diluer dans H 2 O dans un volume total de 16 pl. Ajouter 4 pi de la digoxigénine ou solution de marquage à la biotine (voir réactifs), mélanger au vortex et incuber à 16 ° C pendant 90 min. NOTE: La biotine ou nucléotides marquées à la digoxigénine seront désormais intégrés par translation de coupure. </li><li> Dans le même temps, préparer colonnes G50 pour éliminer les nucléotides non-intégrés. Prendre une seringue de 2 ml, enlever la matrice, et ajouter coton stérilisé dans la seringue. Ajouter les boulettes G50 en solution to remplir la seringue, placer la seringue dans un tube de 15 ml et centrifuger à 642 g pendant 1 min. NOTE: Environ 80% de la seringue doit maintenant être rempli avec G50. Répéter au moins G50 est présent. </li><li> Après 90 min, ajouter 40 ul de H 2 O dans le mélange réactionnel de translation de coupure, et à la réaction de la colonne G50. Ajouter un tube vide dans la colonne, et centrifuger à 642 g pendant 2 min. Recueillir dans l&#39;écoulement à travers un tube de réaction. </li><li> Mesurer le volume de l&#39;écoulement au travers d&#39;une pipette, ajouter et H 2 O pour atteindre un volume total de 200 pi. Précipiter l&#39;écoulement à travers en ajoutant 13,3 pi de l&#39;ADN de sperme de saumon (10 mg / ml), 13,3 ARNt ul de levure (10 mg / ml), 26,7 pi de souris Cot-1 de l&#39;ADN (1 mg / ml) et 28 ul de 2 M NaAc, pH 5.6. Mélanger au vortex, et ajouter 533 ul glacée 100% d&#39;éthanol. Agiter le tube et centrifuger à 16 200 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et laver culot deux fois avec 70% d&#39;éthanol. Centrifuger à 16 200 g pendant 5 min à4 ° C, et le culot sécher à l&#39;air. Ajouter 50 ul de solution d&#39;hybridation 50 +, et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour faciliter la dissolution. REMARQUE: sonde marquée peut être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C. ATTENTION: 50 + solution d&#39;hybridation contient du formamide, qui est toxique, peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire, et est également un tératogène. </li></ol> 4. Perméabilisation, pré-traitement et l&#39;hybridation des cellules fixes pour Combined DNA-ARN FISH <ol><li> Réhydrater les cellules fixées sur des lamelles, en éliminant l&#39;éthanol 70% et l&#39;addition d&#39;une culture de cellules du PBS pour les plaques à 6 puits. Incuber pendant 5 min. Répétez au total trois fois. </li><li> Retirer culture cellulaire PBS, et ajouter 0,2% de pepsine pour les plaques à 6 puits, à perméabiliser les cellules. Incuber les plaques à 6 puits dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 4 min. Retirer la pepsine, et inactiver avec RNAse H 2 O. </li><li> Cellules post-fixes par incubation avec 4% de PFA / PBS pendant 5 min à température ambiante. Après FIXATIsur, laver deux fois avec une culture de cellules du PBS pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par incubation avec de l&#39;éthanol à 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Transfert des lamelles couvre de plaques de 6 puits, et l&#39;air sec des lamelles pendant plusieurs minutes. </li><li> les cellules de l&#39;âge selon l&#39;incubation des lamelles à 65 ° C pendant 1 heure sur une plaque chauffante. </li><li> Pré-hybridation sonde FISH avec la souris Cot-1 DNA en additionnant pour chaque lamelle à analyser, 25 pi de solution 50 + d&#39;hybridation, 0,5 pi souris Cot-1 DNA, 1 pl de sonde Xist marqué à la biotine et 1 pl de la digoxigénine sonde de BAC marqué détecter le chromosome X. Mélanger au vortex, et dénaturer à 99 ° C pendant 5 min. Incuber immédiatement à 37 ° C pendant 45 minutes, pour permettre à l&#39;ADN Cot-1 de s&#39;hybrider aux séquences répétées présentes dans les sondes. </li><li> Après vieillissement, repéré 50 ul de tampon de dénaturation (consistant en 70% de tampon phosphate formamide/2x SSC/10 mM) sur une lame de verre, et les mettre sur le dessus avec des lamelles couvre-face des cellules towards le tampon de dénaturation. Incuber à 65 ° C pendant 2 min. </li><li> Ajouter des lamelles à dos des plaques de 6 puits, et les cellules post-fix par incubation dans la glace froide éthanol à 70% pendant 5 min. </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer sonde pré-hybridée sur une lame de verre, et incuber la lamelle sur le dessus. Placer les lames dans une chambre humide rempli de 50 ml 50% formamide/2x SSC, et incuber une nuit à 37 ° C. </li></ol> 5. Lavage post-hybridation et médiation par les anticorps de détection de la sonde <ol><li> Remplir des plaques 6 puits avec 2 x SSC, et de pré-chauffer jusqu&#39;à 42 ° C. Ajouter des lamelles après une nuit d&#39;incubation, et incuber à 42 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer 2x SSC, et incuber lamelles avec 50% SSC formamide/2x pendant 10 min à 42 ° C. Répétez un total de 3 fois (30 min de lavage au total). </li&gt; <li> Retirer 50% formamide/2x SSC, et laver les lames avec du Tris-saline-Tween (TST) pour 2 x 5 min à température ambiante. </li><li> Place 50 ul de Tris-saline-BSA (TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour bloquer pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de mouton anti-dig (1:500 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles à l&#39;envers pour la première étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 ul d&#39;anticorps de lapin anti-mouton conjugué à FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles tête en bas pour la seconde étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifiée . </li><li> Transfer lamelles couvre-retour à des plaques 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation troisième pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Coin 50 pi d&#39;anticorps de souris anti-biotine (1:200 dans TSBSA) par lamelle couvre-objet sur les nouvelles lames de verre, et des lamelles couvre-incuber à l&#39;envers, pour la quatrième étape d&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre noire TST-humidifié. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris conjugués à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour l&#39;étape d&#39;incubation cinquième pendant 30 min à température ambiante dans une chamb sombre TST-humidifiéer. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. </li><li> Place 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-cheval conjugué à la rhodamine (1:250 dans TSBSA) par lamelle sur les nouvelles lames de verre, et incuber lamelles envers pour la sixième étape de l&#39;incubation pendant 30 min à température ambiante dans une chambre sombre TST-humidifié . REMARQUE: l&#39;anticorps de chèvre anti-cheval de reconnaître l&#39;anticorps d&#39;âne anti-souris; quand à la disposition du chercheur, un anticorps de chèvre anti-âne fonctionnera aussi bien. </li><li> Transfert retour à lamelles couvre-plaques de 6 puits et laver 2 x 5 min avec TST. Laver supplémentaire de 5 min avec du Tris-saline (TS). </li><li> Déshydrater les cellules par une incubation ultérieure dans l&#39;éthanol 70% pendant 3 min, de l&#39;éthanol à 90% pendant 3 min et 100% d&#39;éthanol pendant 3 min. Retirez les lamelles de plaques de 6 puits, et laisser sécher à l&#39;air pendant plusieurs minutes. </li><li> Repérer une goutte de milieu de montage avec DAPI (voir réactifs) sur une lame de verre, et ajouter la lamelle à l&#39;envers sur le dessus. Sceller diapositives avec du vernis à ongles etévaluer les résultats du FISH par microscopie à fluorescence (Figure 1). </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+from+the+region+of+the+human+X+inactivation+centre+is+expressed+exclusively+from+the+inactive+X+chromosome.">A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome.</a> Nature. 349, 38-44 (1991).</li><li>Brockdorff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+position+and+exclusive+expression+of+mouse+Xist+from+the+inactive+X+chromosome.">Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 329-331 (1991).</li><li>Borsani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+gene+expressed+from+the+inactive+X+chromosome.">Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 325-329 (1991).</li><li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells.">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development.">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li><li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing.">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li><li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+nascent+RNA,+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos.">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li><li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA,+DNA,+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence.">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li><li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center.">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li><li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells.">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li><li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture.">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Combiné ADN-ARN FISH peut être techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN FISH peuvent être trop sévère pour les molécules d&#39;ARN moins stables. Plusieurs approches ont été appliquées pour étudier à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN dans la même cellule, contournant le besoin d&#39;incubation simultanée avec des sondes de détection à la fois l&#39;ADN et l&#39;ARN. Par exemple, dans une approche de superposition, premier poisson d&#39;ARN est réalisée, et les cellules sont i...

Étudier les cellules et les tissus au moyen d&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH) a, depuis son introduction à la fin des années 1970 1, a permis aux chercheurs d&#39;étudier les gènes, l&#39;organisation de la chromatine et l&#39;expression des gènes au niveau subcellulaire. ADN FISH est fréquemment utilisée en cytogénétique, caryotype 2, le diagnostic du cancer 3 et pré-implantatoire dépistage génétique 4, et joue un rôle important dans la recherche moléculaire 5-6, car il permet la détection d&#39;acides nucléiques dans leur environnement naturel. Simple analyse d&#39;expression de cellules par l&#39;ARN FISH peut détecter des transcrits primaires indigènes et ARN non codantes étant transcrit à partir de chromosomes, et offre des avantages à d&#39;autres techniques qui évaluent l&#39;expression des gènes au niveau de la population, y compris par exemple RT-PCR quantitative, génome large analyse de l&#39;expression ou Northern blot . En visualisant des transcrits d&#39;ARN provenant directement de leurs sites d&#39;origine, il a par exemple étéa remarqué que l&#39;expression du gène est stochastique 7, et peut être parfois allèle spécifique 8. L&#39;amélioration de la technique ont même permis la détection et la quantification des molécules d&#39;ARNm dans les cellules simples 9-11. Le principe de base de l&#39;hybridation FISH consiste en des acides nucléiques dans la cellule à une sonde d&#39;acide nucléique au moyen de Watson et Crick d&#39;appariement de bases hautement spécifiques. La sonde peut être directement ou indirectement détectée, résultant en un signal qui peut être visualisée au microscope. Les premières tentatives étaient composés de sondes marquées radioactivement, qui avaient inconvénients en fonction des questions de sécurité, la résolution spatiale limitée et la capacité de détecter une seule cible à la fois 12-14. Le développement ultérieur d&#39;étiquettes non radioactives, y compris les fluorochromes, les haptènes, et des enzymes, a permis l&#39;utilisation répandue de FISH comme une technique de biologie moléculaire de routine. La sonde FISH peut être soit directement marqué avec fluorochromes par liaison chimique des molécules fluorescentes de l&#39;acide nucléique et des séquences de 15 nucleotides de l&#39;intégration de 16 à 19 marquées par fluorescence, ou la sonde peut être visualisé indirectement après intégration des haptènes (y compris la biotine et la digoxigénine) et la détection immunologique d&#39;anticorps spécifiques d&#39;haptènes par haptène conjugué à rapporteur fluorescent molécules 20-21. Cette dernière approche permet une amplification du signal à l&#39;aide de plusieurs couches d&#39;anticorps marqués par fluorescence qui sont utilisés pour améliorer le signal d&#39;origine et permet la détection de l&#39;espèce d&#39;ARN qui sont exprimés à des niveaux faibles. En combinant des techniques de marquage direct et indirect et des haptènes différents, plusieurs cibles peuvent être visualisées simultanément dans la même cellule. Une des étapes les plus importantes dans les protocoles de poisson est l&#39;hybridation de la sonde à sa cible. Bien qu&#39;en théorie, une sonde se lier spécifiquement seulement à sa cible, dans la pratique, cette spécificitén&#39;est pas toujours atteint, en tant que sondes peuvent se lier à des régions homologues, des conditions d&#39;hybridation et ne seront pas toujours idéale pour une certaine espèce de la région d&#39;ADN ou d&#39;ARN. Les lavages post-hybridation sont donc d&#39;une importance particulière, car ils peuvent augmenter la rigueur de la procédure de FISH, et peuvent empêcher la liaison non spécifique des sondes FISH, qui se traduirait par un niveau élevé de bruit de fond. Comme les molécules d&#39;ARN sont simple brin, ils peuvent facilement être hybridées à une sonde FISH. En revanche, la molécule d&#39;ADN double brin doit tout d&#39;abord une étape de dénaturation, après quoi, une sonde peut s&#39;hybrider. Ceci est généralement obtenu par chauffage de l&#39;échantillon, ce qui entraîne la dénaturation de l&#39;ADN. Cependant, dans ces conditions difficiles, fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin peuvent être perdues. Par conséquent, l&#39;ADN-ARN combiné FISH nécessite l&#39;optimisation des conditions importantes, et il est plus difficile techniquement par rapport à la détection de seulement séparée de l&#39;ARN ou de l&#39;ADN. Ici, nous présentationta protocole détaillé de combinés, simultanée FISH ADN-ARN qui nous a permis d&#39;étudier l&#39;inactivation du chromosome X (XCI) dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris femelle 22-24. XCI est un mécanisme épigénétique cruciale pour le développement embryonnaire femelle 25, et les résultats en hétérochromatinisation et donc faire taire l&#39;un des deux chromosomes X chez les individus de sexe féminin 26-27. Essentiel de ce processus est la non codantes de l&#39;ARN Xist 28-30, qui est réglementée par les 24 protéines RNF12 22-23 et Rex1. Expression de Xist devient régulée à la hausse sur l&#39;avenir chromosome X inactif (Xi) au cours du développement embryonnaire ou sur la différenciation des cellules ES in vitro , et peuvent se répandre le long du chromosome X et d&#39;attirer ainsi remodelage de la chromatine enzymes qui entraînent la fermeture de la transcription du chromosome X 31. Cet étalement de Xist ARN peut être visualisée par FISH ARN en tant que revêtement du chromosome Xcertains, qui est aussi appelé un nuage de Xist. Comme les cellules ES femmes peuvent perdre un de leurs chromosomes X en raison de l&#39;instabilité génomique, nous et d&#39;autres avons utilisé combiné ADN-ARN FISH pour étudier XCI, pour s&#39;assurer que les cellules ne caryotype stables sont évalués dans l&#39;analyse de cet important processus 22,32 -34. Comme avec toutes les techniques de la biologie moléculaire, plusieurs excellents différents protocoles ont été publiés 35-38. Ici, nous présentons notre méthode, à partir de l&#39;induction de la différenciation des cellules ES de souris, la fixation des cellules, l&#39;étiquetage du poisson sondes par Nick-traduction, pré-traitement des cellules fixées pour permettre la perméabilisation et l&#39;utilisation de la sonde suite, l&#39;hybridation de la sonde à l&#39; cible, et enfin la détection de la sonde par des anticorps marqués par fluorescence. Le protocole présenté ici permet la détection de fidèles ARN Xist et le chromosome X dans un délai de deux jours, et les bases de cette technique peut probablement être adapté à otses systèmes et domaines de recherche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">female mouse embryonic stem cells</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">will be made available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse embryonic fibroblasts</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell culture medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM &#223;-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4&#186;C for maximal 2 weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">LIF</td>
			<td style="width:124px;">Chemicon</td>
			<td style="width:119px;">ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11960085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Calf Serum&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin&#8211;streptomycin (100&#215;)</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Non-essential aminoacids&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">&#223;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">ES cell differentiation medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 &#956;l/l monothioglycerol and 50 &#956;g/ml ascorbic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">IMDM-Glutamax</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31980-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Ascorbic acid (50 mg/ml)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">monothioglycerol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">T25 cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">6-well cell culture dishes</td>
			<td style="width:124px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">cell culture grade PBS</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">falcon tubes</td>
			<td style="width:124px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">24x24 mm coverslips</td>
			<td style="width:124px;">Menzle</td>
			<td align="right" style="width:119px;">780882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">gelatin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1890-100G</td>
			<td>prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 &#7484;C until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20&#7484;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">absolute 100%&#160; ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32221-2.5L</td>
			<td>use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">RNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Baxter</td>
			<td>TKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">sterile filter tips</td>
			<td style="width:124px;">Rainin Bio Clean</td>
			<td style="width:119px;">GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745816910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">biotin-labeling kit (Biotin Nick translation)</td>
			<td style="width:124px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11745824910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Sephadex G50</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2 ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">BD Plastipak</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">sterilized cotton</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">yeast tRNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15401-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Salmon Sperm DNA 10 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">mouse cot-1 DNA&#160; 1 mg/ml</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18440-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">eppendorf bench top microcentrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5417R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Eppendorf Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">Model 5810R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M NaAc, pH 5.6</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50+ hybridization solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">formamide</td>
			<td style="width:124px;">Acros organics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">dextran sulfate</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">31403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">pepsin</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td>prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 &#181;l 37% HCL per 100 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">HCL, 37% solution&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fluka</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">object glasses</td>
			<td style="width:124px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">20x SSC</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM9763</td>
			<td>dilute to 2x SSC in RNAse free water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">10 mM Phosphate buffer, pH 7</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">denaturation buffer</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tween-20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">2M Tris pH 7.5 solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Tris-Saline-Tween washing solution (TST)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 &#181;l Tween-20, add RNAse free water till 1 liter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">10x Saline solution</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline-BSA (TSBSA)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>500 &#956;l 10x Saline, 250 &#956;l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">BSA, purified, 100x&#160;</td>
			<td style="width:124px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">sheep-anti-dig antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:500 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mouse-anti-biotin antibody</td>
			<td style="width:124px;">Roche diagnostics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:200 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine</td>
			<td style="width:124px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>use 1:250 diluted in TSBSA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:464px;">Tris-Saline washing solution (TS)</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td style="width:124px;">Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nail-varnish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">fluorescent miscroscope</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined dna-rna fluorescent in situ hybridization (fish) to study x chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells

Hybridation in situ fluorescente (FISH) est une technique moléculaire qui permet la détection d&#39;acides nucléiques dans les cellules. ADN FISH est souvent utilisée en cytogénétique et diagnostic du cancer, et peut détecter des aberrations du génome, qui a souvent des implications cliniques importantes. ARN FISH peut être utilisée pour détecter des molécules d&#39;ARN dans les cellules et a fourni des renseignements importants dans la régulation de l&#39;expression génique. La combinaison de l&#39;ADN et de l&#39;ARN FISH dans la même cellule est techniquement difficile, que des conditions appropriées pour l&#39;ADN poisson pourrait être trop sévère pour fragiles, molécules d&#39;ARN simple brin. Nous présentons ici un protocole facilement applicable qui permet au combiné, la détection simultanée de Xist ARN et l&#39;ADN codé par les chromosomes X. Ce protocole de FISH ADN-ARN susceptible combiné peut être appliquée à d&#39;autres systèmes où à la fois l&#39;ARN et de l&#39;ADN devant être détecté.

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus pour la combinaison de l&#39;ADN-ARN FISH, nous avons pu visualiser inactivation du chromosome X dans la différenciation des cellules souches embryonnaires de sexe féminin. Figure 1 montre un exemple représentatif d&#39;une expérience FISH ADN-ARN, où nous avons détecté la fois Xist (qui est visible en tant que dite ARN Xist nuage sur le chromosome X inactif et une transcription basale ponctuelle sur le chromosome X actif), et une r...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d&#39;acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l&#39;ARN et de l&#39;ADN à l&#39;aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l&#39;inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris.

ADN-ARN combiné Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) à étudier inactivation du chromosome X dans différencié Femme Souris cellules souches embryonnaires

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

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Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

27.5K vues.  Erasmus MC - University Medical Center.  Hybridation in situ fluorescente (FISH) permet la détection d'acides nucléiques de leur environnement natif dans les cellules. Nous décrivons ici un protocole pour le combiné, la détection simultanée de l'ARN et de l'ADN à l'aide de FISH, qui peut être utilisée pour étudier l'inactivation du chromosome X dans les cellules souches embryonnaires de souris. 

Vidéo: Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Recherche

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l&#39;organisation nucléaire 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...