Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein nicht zufälliges Mausmodell zum Testen und Quantifizieren der Reaktivierung des inaktiven X-verknüpften Mecp2-Chromosoms im Gehirn einer lebenden Maus zu generieren. Dieses Modell kann leicht geändert werden, um Xi Reaktivierung in anderen X-verknüpften Krankheitsmodellen wie DDX3X-Syndrom zu studieren. Ich bin Postdoktorand in Sanchita Bhatnagars Labor und werde das Verfahren mit Zeming Zheng demonstrieren.
Beginnen Sie mit der Positionierung der anästhesierten Maus in einer stereotaktischen Plattform mit den Schneidezähnen, die in der Bissstange des Schnartrainers eingehakt sind. Ziehen Sie die Nasenklemme fest, während Sie den Kopf der Maus auf einer Ebenenebene halten. Passen Sie die Höhe der Ohrbügel an, um den kaudalen Teil des Gehörgangs zu erreichen, um den Kopf immobilisiert zu halten.
Dann desinfizieren Sie den Kopf mit abwechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums und 70%Ethanol. Wenn die Maus bereit ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 0,75 Zentimeter großen horizontalen Schnitt in der mittleren Kopfhaut zu machen. Verwenden Sie einen 0,45 Millimeter Grat, um zwei symmetrische Löcher über der rechten und linken kortikalen Halbkugel zwei Millimeter von der sagittalen Naht und der Lambdoid-Naht in der ungefähren Mitte des parietalen Knochens zu bohren.
Befestigen Sie eine 10-Mikroliter-Spritze an der stereotaktischen Plattform und laden Sie 10 Mikroliter frisch zubereiteten chemischen Inhibitor in die Spritze. Fördern Sie die Nadel in das erste Gratloch, während Sie die Nadel senkrecht zum Schädel halten. Wenn die Nadel den Schädel durchquert, nulln Sie die Koordinaten auf dem stereotaktischen digitalen Display und leiten Sie die Spitze der Nadel an, bis sie eine Tiefe von 2,5 Millimetern erreicht.
Ziehen Sie die Nadel 0,5 Millimeter auf eine Tiefe von zwei Millimetern zurück und injizieren Sie langsam das gesamte 10-Mikroliter-Volumen der Lösung über einen Zeitraum von einer Minute. Nachdem der gesamte Inhibitor abgegeben wurde, lassen Sie die Nadel im Gehirn für eine weitere Minute, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Wiederholen Sie die Injektion in das zweite Gratloch mit dem Fahrzeug nur als Kontrolle und schließen Sie die Haut über den Schnitt.
Dann übertragen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät auf ein 37 Grad Celsius Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Erholung. Am Ende des Dosisschemas, sichern Sie die Maus auf einem Sezieren Pad. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen seitlichen Schnitt durch die Integument und die Bauchwand direkt unter dem Brustkorb zu machen.
Trennen Sie vorsichtig die Leber von der Membran und schneiden Sie das Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Brustkorbs durch, um die Pleurahöhle freizulegen. Verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt an das hintere Ende der linken Herzkammer zu machen und sofort die rechte Herzkammer mit etwa 15 Milliliter PBS über einen Zeitraum von zwei Minuten zu injizieren. Eine erfolgreiche Perfusion führt zu einem Leberfarbwechsel von Rot zu blassrosa.
Wenn alle PBS geliefert wurden, durchdringen Sie das Herz mit etwa 10 Millilitern 4%Paraformaldehyd in PBS über zwei Minuten. Nach der Ernte des Kopfes, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt in der Kopfhaut zu machen, um den Schädel zu belichten. Legen Sie eine Spitze der Schere in das Foramen magnum, um die Bildung eines seitlichen Schnitts im Schädel zum Auge zu erleichtern.
Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der anderen Seite des Schädels halten das Ende der Schere so oberflächlich wie möglich und schneiden Sie den Bereich des Schädels zwischen den Augen und über der Nase der Maus. Verwenden Sie Zangen, um die Schädelknochen sanft von den Gehirnhälften zu schälen und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn zu erhöhen. Sezieren Sie vorsichtig die Hirnnervenfasern, die das Gehirn am Schädel fixieren, und legen Sie das Gehirn in eine Plastikschale.
Dann verbrauchen Sie das Kleinhirn und olfaktorische Glühbirnen. Um Abschnitte des Hirngewebes zu erhalten, fixieren Sie zuerst das Gehirn in einer 15-Milliliter-Röhre, die mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius über Nacht gefüllt ist. Am nächsten Morgen spülen Sie das Hirngewebe mindestens dreimal für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in frischen PBS pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche die Vorderseite jeder Hemisphäre mit Schere und Zange entfernen und die Proben in beschriftete Kryoformen vorne nach unten legen. Tauchen Sie jedes Gewebe in ein optimales Schnitttemperaturmedium, bevor Sie die Proben in flüssigem Stickstoff in einer 10-Millimeter-Kunststoff-Petrischale für minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Xi-Reaktivierung zu bestimmen, tauchen Sie fünf bis sechs Mikrometer Hirngewebeabschnitte für fünf Minuten in Antigen-Retrieval-Lösung auf einen 100 Grad Celsius-Wärmeblock ein.
Waschen Sie die Dias am Ende der Inkubation mit vier fünfminütigen Wäschen bei Raumtemperatur mit frischen PBS pro Wäsche, bevor Sie die Dias in die Blockierlösung eintauchen. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur die Dias dreimal fünf Minuten in frischem Waschpuffer pro Waschgang waschen. Färben Sie die Gewebeproben mit den entsprechenden Primärantikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht.
Stellen Sie die Dias auf einem Fluoreszenzmikroskop auf, das den Kontrast und die Helligkeit anpasst, um die Quantifizierung der Anzahl der GFP-positiven Zellen sowohl für die medikamentös als auch für die fahrzeugbehandelte Maushirnhälfte nmöglich zu quantifizieren. Um die Durchführbarkeit des nicht zufälligen X-Chromosom-Inaktivierungsmausmodells für inaktive X-Chromosom-Reaktivierungsstudien zu demonstrieren, wurden die Genotypen weiblicher transgener Maus-Embryonal-Fibroblasten durch genotypisierende PCR- und Durchflusszytometrie bestätigt. Nach DER von PCR bewerteten Expression des GFP-getaggten Methylen-CPG-bindenden Proteins zwei Gen- oder MECP2-Gen wurde durch medikamentöse, aber nicht durch Fahrzeugbehandlung reaktiviert.
Nicht zufällige X-Chromosom-Inaktivierungs-Mausmodell embryonale Fibroblasten exprimiert auch nukleare GFP nach Medikament, aber nicht Fahrzeugbehandlung, die die X-Chromosom-Inaktivierungsfaktor-Inhibitoren reaktivieren inaktivierte X-Chromosom-verknüpfte MECP2 in Maus embryonalen Fibroblasten. Die medikamentöse Behandlung reaktiviert das inaktivierte X-Chromosom MECP2-GFP in etwa 30% der Zellen in medikamentös infundierten Gehirnhälften, während keine Reaktivierung in fahrzeuginfundierten Hemisphären nachgewiesen wird. Mikrotubule-assoziiertes Protein zwei positive Neuronen sind auch GFP-positiv in medikamentös behandelten Hemisphären, die auf inaktivierte X-Chromosom-MECP2-GFP-Expression hinweisen.
Das Arzneimittelregime wird vom Ziel und der Wirksamkeit der kleinen Molekülinhibitoren abhängen, so optimieren Sie die Dosis und Behandlung in vitro vor dem Testen in vivo. Das nicht zufällige Mausmodell kann verwendet werden, um verschiedene Medikamente einzeln oder in Kombination zu testen. Tatsächlich haben wir und andere mehrere medikamentöse X-Chromosom-Inaktivierungsfaktoren identifiziert.
