This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Universität von Georgia genehmigt. 1. Vorbereitungen <ol><li> Für Eizelle Kultur, Kauf oder frisch vorbereiten Minimal Essential Medium (MEM) und ergänzt mit 3 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), wie in Tabelle 1 dargestellt. Legen Sie eine Polystyrol-Flasche auf einer Ladebilanz (Tara auf Null). Fügen Sie alle Reagenzien außer BSA, um und rufen Sie das Endvolumen mit MQ-Wasser-Gewichts auf insgesamt 250 g. Dann fügen Sie die BSA, zu ermöglichen, sich aufzulösen und Filter zu sterilisieren. Anmerkung: Die beschriebene MEM Medium verlangt Äquilibrierung und Zell Inkubation mit einem medizinischen Gasgemisch aus 5% CO 2, 5% O 2 und 90% N 2. Jedoch können auch andere Medien (zB CZB) verwendet werden, die für die Zell Inkubation in 5% CO 2 unter Atmosphärenbedingungen zu ermöglichen. </li><li> Für Eizelle Mikroinjektion, Kauf oder zur Vorbereitung M2 Medium. </li><li> Bereiten pregnant Stutenserum-Gonadotropin (PMSG) auf eine Konzentration von 5 IU / 100 ul. </li><li> Kauf und wiederherzustellen siRNA Aktien auf eine Arbeitskonzentration von 1 uM. </li></ol> 2. Maus Eizellenentnahme <ol><li> TAG 1: Zur Stimulierung Ovarialfollikel Entwicklung und Erhöhung der Zahl der präovulatorischen Follikel, verwalten 5 IU PMSG intraperitoneal weiblichen Mäusen 48 Stunden vor der Eizellenentnahme. </li><li> TAG 3: Für die Eizellenentnahme und Kultur, bis 35 mm Kulturschalen Set mit 3 ml MEM / BSA mit 1 ug / ml Milrinon ergänzt. Diese Phosphodiesterase-Hemmer unterhält die Eizellen in der Prophase-I festzunehmen und verhindert Keimbläschen Aufteilung (GVBD). Gleichgewicht kommen die Kulturschalen in einem medizinischen Gasgemisch für mindestens 15 min. Hinweis: in ganz Eizellenentnahme sowie Eizelle Mikroinjektion und der 24-Stunden-Kultur Halteperiode Beitrag siRNA wird Milrinone ergänzt Medien erforderlich. </li><li> Abrufen Eierstöcke von den weiblichen Mäusen mit etablierten Laborpraxis 15 und Transfer zu einem neuen Kulturschale mit vorgewärmtem und ins Gleichgewicht gebracht MEM / BSA / Milrinon. </li><li> Legen Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Stereomikroskops für die Eizellenentnahme. Release Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) durch manuelles Punktieren der Antralfollikeln mit 27 G Nadeln. Befestigen einem Eierstock, um den Boden der Kulturschale mit einer 27 G-Nadel in eine 1 ml-Spritze angebracht ist, und mit einem zweiten Nadel um alle großen Follikeln stechen. Wiederholen Sie für jede Eierstock. </li><li> Unter Verwendung von Standardverfahren Pipettieren mit dem Mund oder andere Mittel der Oozytenaspiration, sammeln Sie alle Eizellen, die von 2 oder mehr Schichten von kompakten Cumuluszellen umgeben sind. Übertragen Sie die COC auf ein neues Gericht und bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Die umgebenden Cumuluszellen durch wiederholte vorsichtiges Pipettieren Entfernen Sie vorsichtig mit einer 1 ml Pipette auf eine Aspiration Volumen von 750 &amp; mgr; l eingestellt. Wiederholen Sie den Pipettierschritt etwa 12-malund ermöglichen die Oocyten für 5 min wiederherzustellen. Fahren Sie auf diese Weise fort, bis alle oder die meisten der Cumuluszellen entfernt wurden. Übertragen Sie die entblößt Eizellen zu einem anderen Kulturschale und lassen Sie sie bei 37 ° C für 15 Minuten ins Gleichgewicht kommen. </li><li> (I) Mikroinjektion von spezifischen siRNAs gegen das Ziel von Interesse, (ii) Mikroinjektion von unspezifischen (Kontrolle) siRNAs und (iii) ein nicht-injizierten Kontrollgruppe zur Rechenschaft: Zuweisung der denudierten Oozyten in drei experimentellen Gruppen zu verwenden für Kulturbedingungen. </li></ol> 3. Oocyte Mikroinjektion <ol><li> Up-Kulturschalen mit 3 ml M2-Medium mit Milrinon (1 ug / ml) ergänzt zur Eizelle Mikroinjektion gesetzt. Bereiten Kulturschalen mit MEM / BSA / Milrinon zum Waschen und nachfolgende Kultur der injizierten Oozyten. Anmerkung: M2 Medium HEPES-Puffer und erfordert Vorwärmen auf 37 ° C für 15 Minuten unter atmosphärischen Bedingungen. MEM erfordert Vorwärmen und Gleichgewichtseinstellung mit medizinischen Gasen, wie beschreiben,d oben. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektionssystem. Laden die Injektionsnadel mit 5 ul von 1 uM spezifische siRNA Lösung. Sichern Sie die Haltepipette und Injektionsnadel, um Mikromanipulatoren der Mikroinjektionssystem und die Einspritzeinheit mit kalibrierten Volumen und Druck gesetzt. </li><li> Legen Sie eine 200 &amp; mgr; Mikro-Tropfen M2 Medien auf der Innenseite des Deckels einer 3 cm Kulturschale und füge eine Eizelle für die Einrichtung und die Ausrichtung der Mikroinjektionssystem. </li><li> Unter Verwendung der Eizelle als Leitfaden, passen Sie die Positionen der Halte- und Injektionsnadeln. Übernehmen Unterdruck auf den Haltepipette vorsichtig sichern die Eizelle und die Position der Injektionsnadel mit dem breitesten Durchmesser der Zelle. Passen Sie die Einstellungen, um die Mikroinjektion von ca. 10 pl der siRNA-Lösung überall in die Eizelle Zytoplasma ermöglichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Abbildung 1. Oocyte Mikroinjektion einzurichten. ( <strong&gt; A) repräsentative Bild eines 200 ul Mikrotropfen M2-Medium auf dem Deckel aus einer 3 cm Kulturschale angeordnet, wobei die Haltepipette und Injektionsnadel auf der linken bzw. rechten Seite angeordnet ist. (B) Prophase Gruppe-I festgenommen Oozyten (GV-Stufe) vor der Mikroinjektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Bringen Sie den Deckel mit dem Stereomikroskop Bühne und fügen Sie eine 200 &amp; mgr; Mikro-Tropfen Frisch M2 Medien. Hinzufügen einer Gruppe von Oozyten (~ 10), um die Mikro-Tropfen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Verfahren, dann den Deckel mit Mikro-Tropfen in die Mikroinjektion der Bühne. <ol><li> Gehen Sie die einzelnen Eizellen microinject. Sichern einer Eizelle mit der Haltepipette langsam führen Sie die Spitze der Injektionsnadel in das Zytoplasma und vertreiben das Injektionsvolumen von siRNA-Lösung. Der Injektionsnadel und mo sorgfältig zurückzuziehenve des injizierten Oozyten zu einer Position am Boden des Mikrotropfen. Bewegen erfolglos injizierten Oozyten zu einer Position an der Spitze der Mikrotropfen. </li><li> Wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit jeder Eizelle. Um optimale Oozyte Lebensfähigkeit microinject nur eine kleine Anzahl von Oozyten zu einem Zeitpunkt zu erhalten. Dafür sorgen, dass dieser Vorgang nicht länger als ein paar Minuten auf die Temperatur und den pH-Wert in der Mikrotropfen zu verhindern. </li></ol></li><li> Saugen Sie Oozyten erfolgreich injiziert oder vorsichtig bewegen Sie den Deckel mit der Mikro-Tropfen injizierten Oozyten mit dem Stereomikroskop. Übertragen Sie die injiziert lebensfähigen Eizellen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden, um / BSA / Milrinon Medium zu waschen und ins Gleichgewicht bei 37 ° C MEM. </li><li> Mit einem weiteren Gruppe von Oozyten, wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit einer neuen Injektionsnadel mit unspezifischen siRNAs für die Kontrollgruppe geladen. In eine separate Kulturschale Waschen Sie die Oozyten in MEM / BSA / Milrinon und Transfer. </li><li> Kultur Alle GruppenOocyten für 24 h in MEM / BSA / Milrinon bei 37 ° C unter einer Atmosphäre eines medizinischen Gases. Hinweis: Die &#39;Milrinon Block&#39; Kulturzeit wird zur effizienten Ziel mRNA / Protein-Abbau benötigt wird. </li></ol> 4. Oocyte Kultur für Meiotische Reifung <ol><li> TAG 4: Für jede Versuchsgruppe von Eizellen Aufbau 4 Kulturschalen (35 mm) mit 3 ml MEM / BSA. Ergänzen Medien Teller pro Gruppe mit 10% (hochwertigen) fötalem Rinderserum (FBS), die für die Eizellreifung zu verwenden. Lassen Sie alle Kulturschalen bei 37 ° C mit medizinischen Gasgemisch ins Gleichgewicht. </li><li> Eizellen von &#39;Milrinon Block&#39; freigeben, der Reihe nach zu waschen die Oozyten dreimal in Schalen mit MEM / BSA und übertragen dann die Eizellen in die Reifungsschale, die Medien mit 10% FBS. Kultur Alle Oocyten Gruppen für 17 h bei 37 ° C, um die Wiederaufnahme der Meiose und der Progression zu ermöglichen. </li><li> TAG 5: Bereiten Sie Lösungen für Eizelle fixation, einschließlich: (i) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PEM-Puffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA) mit 0,5% Triton-X-100 und (ii) PBS, supplementiert mit 5 % FBS, die verwendet werden, um zu waschen und blockieren die Oozyten werden. Anmerkung: Diese Lösungen erfordern Vorwärmen auf 37 ° C vor der Oozyte Fixierung. </li><li> Für Eizelle Fixierung (nach dem 17 Stunden-Kultur), zügig jeder Versuchsgruppe von Eizellen übertragen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden in einzelnen Wells (eines 4-Well-Platte), die 750 ul vorgewärmtes 4% PFA-Lösung und bei 37 ° C für 1 Stunde. Anschließend jede Gruppe von Oozyten in 750 ul vorgewärmtes PBS, das 5% FBS 3x waschen (jeweils 15 min). </li><li> Block Oocyten in 200 ul PBS / 5% FBS O / N bei 4 ° C unspezifische Antikörper zu minimieren bindend. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzanalyse <ol><li> TAG 6: Anmerkung: Die Immunfärbung in einer Multi-Well-Platte und dem OOC getanytes seriell sequenzielle Vertiefungen übertragen, die entsprechende Antikörper und Waschlösungen. Entweder 48 oder 96-Well-Platten verwendet werden kann, passen Sie einfach das Lösungsvolumen auf der Grundlage gut Größe. Für 96-well Platten verwenden 200 ul pro Vertiefung. - 3 Waschbrunnen - sekundäre Antikörperlösung - 3 Waschbrunnen primären Antikörperlösung: Die Eizellen werden auf die verschiedenen Lösungen in der folgenden Reihenfolge verteilt. Zur Belichtung kann die Platte mit Folie abgedeckt werden, zu begrenzen. Bereiten Sie frische PBS / 5% FBS und die Nutzung dieser Lösung für Antikörperverdünnungen vorbereiten (zB Kaninchen-Anti-Pericentrin (1 / 1.000), Maus-Anti-Tubulin (1 / 1.000)). </li><li> Transfer der festen Oozyten jeder Versuchsgruppe in einzelne Vertiefungen, die 200 &amp; mgr; l (oder 100 &amp; mgr; l, wenn weniger Volumen gewünscht wird) der primären Antikörperlösung und der Abdeckung der Vertiefung mit Parafilm. Inkubieren nach optimalen antikörperspezifische Bedingungen (zB 37 ° C für 1 h, oder bei 4 ° CO / N). Hinweis: Primärer Antikörper dilution sowie spezifische Inkubationszeit und -temperatur erfordern Tests, um die optimalen Bedingungen für verschiedene Antikörper verwendet, zu bestimmen. </li><li> Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche die Oocyten dreimal in PBS / 5% FBS (jeweils 10-15 Minuten). </li><li> Übertragung der Oozyten in der Lösung, die fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörper (zum Beispiel 1 / 1.000-Verdünnung von Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper mit Fluorochromen unterschiedlicher Wellenlänge konjugiert). Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> (- 15 Minuten je 10) dreimal in PBS / 5% FBS Waschen der Oozyten. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt, übertragen Sie die Oozyten auf einen sauberen Glasobjektträger und sanft saugen überschüssige Waschlösung. Dadurch werden die Oozyten auf der Glasoberfläche zu immobilisieren. In 8 ul Eindeckmittel (mit DAPI) und sorgfältig überlagern die Montage Medien mit einem 22 mm x 22 mm Deckglas. Senken Sie die Deck langsam zu vermeiden, Luftblasen und / oder Beschädigung der Oozyten. Hinweis: Alternativ zu den 3-dimensionalen Eigenschaften von der Eizelle für die konfokale Mikroskopie-Analyse zu erhalten, fügen ein kleines Volumen von 100 &amp; mgr; m Glasperlen (gemischt mit Vaseline) zu den Ecken des Deckglases vor der Befestigung auf der Folie. </li><li> Objektträger bei 4 ° C oder für die Beurteilung der meiotischen Progression sowie die Analyse der Expressionsspiegel und subzelluläre Lokalisierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den notwendigen Filtern ausgerüstet, um die sekundären Antikörper verwendet übereinstimmen fortzufahren. </li></ol>

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Zwar gibt es verschiedene Methoden zur exogene Nukleinsäure-Transfer in somatischen Zellen, wie Elektroporation und Transfektion die Mikroinjektion ist die beste Methode für die Lieferung von RNA-Molekülen in transkriptionell ruhenden Maus-Oozyten. Das aktuelle Protokoll stellt einen effektiven Ansatz für in vitro-Abreicherung von spezifischen mRNAs, die die Funktionstests der verschiedenen Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oozyten zu aktivieren. Dieser Ansatz führt zu einer effizienten Tran...

Die Meiose ist eine einzigartige Teilungsprozess, die in Keimzellen (Eizellen und Spermien) tritt auf, und umfasst zwei aufeinanderfolgende Divisionen ohne dazwischen DNA-Synthese auf homologen Chromosomen und Schwesterchromatiden während der Meiose-I und Meiose-II, die jeweils 1 zu trennen. Fehler in der Chromosomensegregation während der Meiose in Oocyten können in Aneuploidie, die durch den Embryo während der Befruchtung vererbt wird zur Folge haben. Bemerkenswert ist, das Auftreten von Aneuploidie in sich entwickelnden Embryonen erhöht mit zunehmendem Alter der Mutter und ist eine Hauptursache von angeborenen Missbildungen sowie Verlust der Schwangerschaft bei Frauen 1,2, so unterstreicht eine wichtige Notwendigkeit, die molekularen Grundlagen der Aneuploidie im Reifeteilung zu verstehen, . Während der Zellteilung ist Chromosomensegregation entscheidend von der Montage des Mikrotubuli-Spindelapparat und Etablierung von stabilen Chromosomen-Mikrotubuli-Interaktionen auf korrekte Befestigung zu GegenspindelPole. Wichtiger ist, meiotischen Spindelbildung in Säuger Oozyten unterscheidet sich von Mitose in somatischen Zellen und durch einzigartige Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) die centrioles 3,4 fehlt geregelt. Essentiellen Proteine ​​für Mikrotubulusbildung und Organisation notwendig zu lokalisieren, um Eizelle MTOCs, einschließlich γ-Tubulin, die Mikrotubuli Montage katalysiert. Zusätzlich Pericentrin Funktionen als wesentlichen Gerüstprotein, das bindet und Dübel γ-Tubulin, sowie andere Faktoren MTOCs 5. Insbesondere zeigen unsere Studien, daß Abreicherung Schlüssel MTOC-assoziierten Proteine ​​stört meiotischen Spindel Organisation und führt zu Fehlern in der Chromosomensegregation Oozyten, die nicht vollständig durch die Spindelanordnung checkpoint (SAC) 6,7 gelöst sind. Daher Fehlern Spindel Stabilität, die Meiosehemmung nicht auslösen, ein erhebliches Risiko als Beitrag zu Aneuploidie. Trotz ihrer wesentliche Rolle bei der Spindelanordnung und Organisation, Eizelle MTOC protEin Zusammensetzung und Funktion bleibt kaum verstanden. Testen der Funktion spezifischer Zielproteine ​​in Säugetier Oozyten ist eine Herausforderung, da die Zellen transkriptionell Ruhe kurz vor der Wiederaufnahme der Meiose 8,9. Daher verlassen sich präovulatorischen Oozyten auf mütterliche mRNA speichert, um die Meiose wieder aufzunehmen und zu unterstützen Reifeteilung sowie die ersten Furchungsteilungen nach der Befruchtung 10,11. Die Wirksamkeit der RNA-Interferenz (RNAi) vermittelten Abbau der mRNA-Transkripte in Säuger Oozyten ist gut etabliert und Mütter RNAs für die Übersetzung während der meiotischen Reifung rekrutiert werden, um siRNA Targeting 12-14 besonders zugänglich. Daher stellt die Mikroinjektion von short interfering RNAs (siRNAs) in Oozyten einen wertvollen Ansatz für die Ziel-mRNAs für die Funktionsprüfung führen. Hier werden Verfahren zur Isolierung von Maus-Oozyten und siRNA-vermittelte Abreicherung von spezifischen transcri beschreiben wirPunkte, die Funktion eines wesentlichen MTOC-assoziiertes Protein zu testen, Pericentrin. Darüber hinaus beschreiben wir Immunofluoreszenzanalyse Bedingungen meiotischen Spindelbildung in Oozyten zu bewerten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Mikroinjektion von siRNAs bietet einen effektiven Ansatz für die mRNA-Abbau und die anschließende Proteinabbau in Oozyten, die effiziente und hochspezifische Funktionsprüfung von unterschiedlichen Zielfaktoren in vitro ermöglicht. Anschließend wird Immunofluoreszenz für spezifische Phänotyp-Analyse verwendet sowie zur Proteinabbau in siRNA-injizierten Oozyten validieren. In dem aktuellen Beispiel Fluoreszenzmarkierung von einzelnen Oozyten, die mit DAPI zusammen mit Anti-Tubulin und Anti Pericentrin Anti...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Aufrufe.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten. 

Serie: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Nuclear Transfer in Maus-Oozyten

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Forschung

Biologie

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Retrieval von Maus-Oozyten

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium-vermittelte Virus-induced gene silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...