Diese Arbeit wurde durch den Wellcome Trust Gewährung WT091939MA finanziert. Alain Filloux wird von der Royal Society unterstützt.

Ein. Bakterienstämme und Kulturen <ol><li> Engineering einer Escherichia coli Empfängerzelle (Prey, P) durch Transformieren (unter Verwendung von Standardverfahren CaCl 2-Behandlung oder Elektroporation) 15 E. coli DH5a Zellen mit einem Plasmid, so dass der a-Komplementation des lacZ-Gens (Tab. 1). Platte die transformierten Zellen auf Luria-Bertani-Agar-Platten (LBA, 1,5% Agar), das 5-Brom-4-chlor-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) bei 40 mg / ml Endkonzentration und geeigneten Antibiotikum. Inkubation bei 37 ° C über Nacht und am nächsten Morgen wählen Sie für Blau Transformanten (vgl. § 1,3). </li><li> Wachsen die Pseudomonas aeruginosa Spenderzellen, die T6SS-aktiv sind (D +) oder T6SS-inactive (D-) (Tabelle 1) auf LBA über Nacht bei 37 ° C. In dem hier vorgestellten Beispiel verwendeten wir ein P. aeruginosa RETs belasten besitzeneine konstitutiv aktive H1-T6SS 16 und einen isogenen Mutante mit einer Deletion des H1-T6SS Gencluster (Tabelle 1). </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten eine Übernachtung flüssigen Kultur in belüfteten Kolben durch Impfen einer hellblauen Klon unter den E. coli-Transformanten (P) von der Platte in § 1.1 beschrieben, in 5 ml tryptischer Sojabrühe (TSB) mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt. Wachsen unter Rühren bei 37 ° C. Verfahren gleichermaßen mit einer einzelnen Kolonie von (D +) und von (D -) von der Platte in § 1.2 beschrieben. </li></ol> 2. Wettbewerb Assay <ol><li> Bereiten LBA Platten für den nächsten Tag Experiment. Achten Sie darauf, diese Platten richtig getrocknet (entweder in der Nähe der Bunsenbrenner oder in Reinraumgehäuse). Bereiten Sie ein &quot;Assay-Eingang&quot; (A-Eingang) Platte für die Stämme (D +), (D -) und (P </strong&gt;). Vorbereiten eines &quot;Assay-Ausgang&quot; (A-Output)-Platte für die Stämme (D - + P) und (D + + P). Teilen Sie und beschriften Sie die Platten entsprechend. </li><li> Nach Wachstum über Nacht (siehe § 1.3), messen die optische Dichte (OD 600nm) des Eingangs-Bakterienkultur (D - D + und P) und Berechnen der Volumen benötigt, um eine Zelldichte äquivalent zu 1 Einheit OD 600nm jedes Stammes erhalten . Jedes &quot;Eingang&quot; Zellkultur (D - D + und P) anfänglich in ein steriles 1.5 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt. </li><li> Zentrifugation der Proben bakteriellen bei 13.000 rpm während 1 min bei Raumtemperatur und der Überstand verworfen. </li><li> Resuspendieren der Pellets des D - inokulieren D + und P Kulturen, in 100 ml frisches TSB durch vorsichtiges Pipettieren und 10 ml jeder entspreentsprechenden Stamm einer einzigen Stelle auf der &quot;A-Eingang&quot; Platte (hergestellt in § 2,1). </li><li> Inokulieren &quot;A-Ausgabe&quot; Platte (hergestellt in § 2,1). Genauer gesagt, vorsichtig mischen 30 ul (D +) mit 30 ul (P) und 30 ul (D -) mit 30 ml (P) in zwei getrennte Eppendorf-Röhrchen (beachten Sie, dass die Kulturen verwendet, die in § 2.4 beschrieben sind) . Beimpfen 20 ul des Mixes (D + / P) und (D - / P) als einzelne Punkte auf der &quot;A-Ausgabe&quot; Platte. Lassen Sie die Spots in der Nähe einen Bunsenbrenner trocknen und legen Sie die Platte in einem Brutschrank bei 37 ° C für einen angemessenen Zeitraum, während dessen der Abtöten der Bakterien stattfindet. Im Fall von S. aeruginosa wird eine effiziente Bakterienabtötung beobachtet nach 5-stündiger Inkubation bei einem Vergleich eines aktiven T6SS mit einem T6SS defekte Stamm. </li></ol> 3. Qualitative Beobachtung von ter Abtöten der Bakterien <ol><li> Planen LBA Platten, enthaltend 40 ug / ml X-gal für das Auslesen des Assays. Die Platten werden als &quot;Readout Eingang&quot; oder &quot;R-Eingang&quot; zu isolierten Bakterien oder &quot;Readout Ausgang&quot; oder &quot;R-Ausgang&quot; auf gemischte Bakterienkulturen zu erkennen und so gelesen das Töten Leistung erkennen werden. Diese Platten müssen auch richtig getrocknet werden. Teilen Sie die Platte in vier gleiche Teile auf seinem Rücken und kommentieren diese Teile 0, 10 -1, 10 -2 und 10 -3, Bestimmung der Verdünnungen der Bakterienkultur auf den Agarplatten erkennen (vgl. § 3,3). Die Verdünnung wird eine semi-quantitative Auswertung der blau / weiß Bakterien-Verhältnis innerhalb der gleichen Stelle zu ermöglichen. </li><li> Sammeln Sie mit einer sterilen Schleife die einzelnen bakteriellen Spots aus dem &quot;A-Eingang&quot; Platte (vgl. § 2,4) und &quot;A-Ausgabe&quot; Platte (vgl. § 2,5) und resuspendieren jeden Ort in verschiedenen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml TSB. Zeigen in einer Eppendorf-Schüttler Block während 30 min, um effizient die resuspendierenBakterien. </li><li> Bereiten Sie eine Serie von 5 mal 3 Eppendorf Röhrchen mit 900 ul TSB und gehen für jeden resuspendierten Ort zu zehn fache serielle Verdünnungen bis zu 10 -3. Achten Sie darauf, Pipettenspitzen zu ändern und Vortex 5 Sekunden zwischen jedem Verdünnungsschritt. </li><li> Fahren Sie mit dem Spotten Ihre bakterielle Verdünnungen in § 3,3 auf gut getrockneten LBA-Platten mit 40 ug / ml X-gal, indem Sie mit der meisten verdünnten dem unverwässerten Suspension hergestellt, so dass diese die &quot;R-Eingang&quot; Platten für die &quot;A -input &quot;-Spots und die&quot; R-Ausgang &quot;Platten für die&quot; A-Ausgabe &quot;Flecken (Abbildung 2). Vortex kurz jedes Rohr, bevor Sie mit dem Spotting, um eine homogene Bakteriensuspension zu halten. Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, spot 20 ul in dreifacher Ausfertigung innerhalb eines Quadranten (Abbildung 2). Die relative Trockenheit Ihrem Teller ist in diesem Stadium wichtig, da die Flecken bleiben einzeln auf der Platte getrennt und nicht aufeinander gleiten müssen. Eine Quantifizierung des Kompetitionstest ist auch in dieser Phase des Experiments möglich. Nach dem Schritt 3,3, verteilt 100 ul der Verdünnung 10 -3 auf LBA-Platten mit 40 ug / ml X-gal. Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu einer Beschichtung in dreifacher Ausfertigung für jeden Punkt aus dem &quot;A-Ausgabe&quot; Platte gehen. Platzieren Sie die Verdünnungsplatten in einem 37 ° C Inkubator über Nacht (entsprechend 16 h Inkubation). Fahren Sie mit dem Zählen der blauen Kolonien (die P-Zellen, die am Leben geblieben). Typische Ergebnisse nach 5 Stunden von Wettbewerb erhaltenen Ergebnisse sind in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Hinterlegen der Platte offen (ohne Deckel) innerhalb eines sterilen Zone, um die Absorption der Flüssigkeit in Überschuß innerhalb jeder Stelle zu ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator über Nacht. Während dieser Inkubationszeit wird die Abtötung noch auftritt in der Mischung (D + / P), da beide Stämme sind noch in Kontakt. </li><li> Nehmen Sie ein Bildoder Scannen Ihrer Platten für die Output-Analyse (Abbildung 2). Wo Flecken weitgehend blauen bleibt es zeigt, dass E. coli nicht durch P. getötet worden aeruginosa. Das ist der Fall, wenn E. coli wird mit einem T6SS defekten P. gemischt aeruginosa Stamm (D-) (Abbildung 2, Platte unten rechts). </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Methode in diesem Artikel vorgestellt ermöglicht eine visuelle Beobachtung der T6SS-vermittelte bakterizide / Bakteriostase Aktivität. Der Assay basiert auf der Oberfläche einer Agarplatte durchgeführt. Es wurde zuvor gezeigt, dass T6SS-abhängigen Abtötungsassay mit gemischten bakteriellen flüssigen Kultur durchgeführt nicht effizient ist, wahrscheinlich wegen der fehlenden stationären Kontakt zwischen den beiden Bakterien 8. Die T6SS wird angenommen, dass mit einem Mechanismus ähnlich dem von Bakteriophagen verwendet, um DNA in Zielzellen 17 einzuspritzen betreiben. In flüssiger Kultur, die röhrenförmige Struktur des T6SS kann leichter brechen können inter-bakterielle Kontakt verloren, und die Giftstoffe nicht effizient bereitgestellt. In Bezug auf die Inkubationszeiten, sind die 5 ersten Stunden der Kontakt, den wir beschreiben, zwischen dem Donorstamm und die Beute aus, um bakterielle Tötung zwischen P. beobachten aeruginosa und E. coli, wie in Abbildung 3 dargestellt </strong&gt;. Trotzdem ist es empfehlenswert, die Inkubationszeit durch Durchführung einer kinetischen um die Versuchsbedingungen zu optimieren einzustellen. Da dieses Verfahren eine Farbe basierten Technik können die Ausgabeergebnisse vom Pigmentierung der Donorstamm beeinträchtigt werden. Zum Beispiel werden im Fall von S. aeruginosa, produzieren einige Stämme hohe Buntpigmente wie Pyocyanin und Pyoverdin, das mit dem Assay Auslesen stören können, wodurch der Unterschied zu der Beute relativ schwierig. Andere chromogene β-Galactosidase-Substrate, wie der Magenta-gal oder die rot-gal, kann anstelle des X-gal (Tabelle 1) verwendet werden. Der Wettbewerb Assay kann Verwendung anderer Reportergene für das Auslesen machen. So hat ähnlichen Assay auch durch Verwendung grün fluoreszierendes Protein-markierten preys 12 durchgeführt. Unser Test zwar nicht quantitativ, gibt einen guten Hinweisder T6SS Aktivität, da sie auf das Überleben oder die Tötung eines Reporters Beute basiert. Diese Technik bietet den Vorteil, dass sie einfach und bequem, die bakterizides / Bakteriostase Aktivität T6SSs aus beliebigen Bakterien-Spezies zu evaluieren. Bisher war die Aktivität des T6SS hat gegen Gram-negative Bakterien und keine klare Beispiels T6SS-sensitive gram-positive Bakterien gezeigt wurde berichtet noch 12. Es ist auch offensichtlich, dass in der Kultur Inkompatibilität der verschiedenen Bakterienarten zu testen (zB Wachstumstemperatur, Sauerstoffzufuhr, spezifischer Medien) zu berücksichtigen. Unserem Assay kann auch verwendet werden, um auszuwerten, welches der T6SS Komponenten sind unbedingt erforderlich, da bereits Spuren von einem sekretierten Toxin könnte ausreichend sein, um die Beute zu töten. Auch schwache Aktivität der T6SS könnte dann deutlich von unseren Test nachgewiesen werden, dass Standard-Verfahren Tests T6SS-abhängige Sekretion mit Kulturüberstand und Western-Blot-VergleichAnalyse. Allerdings ist eine richtige koloniebildenden Einheit (CFU) Zählen noch für eine genaue Quantifizierung dieses T6SS Aktivität erforderlich.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETs (D +) (Aktiv T6SS) </td><td> Laborstamm </td><td></td><td> Beschrieben in Reference 16 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETs Δ H1-T6SS (D -) (inaktive T6SS) </td><td> Diese Studie </td><td></td><td> Die H1-T6SS Cluster (umfasst der Gene PA0070 um PA0095) durch allelischen Austausch wurde nach dem Verfahren in Referenz 18 beschrieben gelöscht. Die Bis-Fragment-Primer: Die Mutator-Fragment wurde mit dem folgenden Satz von Primern erzeugt: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, und 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Die Down-Fragment Primer: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5 </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 Ende A1 hsd R17 (r k -, m k +) pho A sup E44 λ-thi -1 gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Dieser Vektor drückt die α-Peptid der β-Galactosidase für α-Komplementation verwendet. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> Verwenden Sie bei 40 pg / ml </td></tr><tr><td> Luria Bertani-Agar </td><td> Merck-Chemikalien </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (Kasein Soja Brühe) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex Schüttler Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Scanner </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Zelldichte Meter </td><td></td></tr><tr><td> Magenta-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Red-gal </td><td> Research Organics </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Strain, Plasmid, Material und Reagenz verwendet. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

Typ VI Sekretionssysteme (T6SSs) sind molekulare Nanomaschinen ermöglichen Gram-negativen Bakterien zu transportieren und zu injizieren Proteine ​​in einer Vielzahl von Zielzellen 1,2. Die T6SS besteht aus 13 Kern-Komponenten und zeigt strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Schwanz-Rohr von Bakteriophagen 3. Der Phage verwendet ein Rohr und ein Stechgerät die Zellhülle von Ziel-Bakterien eindringen und injizieren DNA. Es wird vorgeschlagen, dass die T6SS ein invertiertes Bakteriophagen Vorrichtung Schaffung eines spezifischen Pfades in der bakteriellen Zellwand und Toxine Effektoren an die Oberfläche zu treiben. Das Verfahren könnte weiterhin entnommen werden, und die Vorrichtung könnte T6SS anderen Zellen, mit denen das Bakterium in Kontakt zu perforieren, wodurch die Injektion der Effektoren in diesen Zielen. Der Schwanz Rohr und Stechgerät Teile der T6SS mit Hcp und VgrG Proteinen bzw. 4,5. Die Vielseitigkeit des T6SS wurde durch s nachgewiesenTUDIEN mit verschiedenen bakteriellen Erregern. Die Vibrio cholerae T6SS enthaltene Zytoskelett eukaryontischer Wirtszellen durch Einspritzen eines &quot;entwickelt&quot; VgrG Tragen eines C-terminalen Aktin Vernetzen Domäne 6,7 umzugestalten. Ein weiteres eindrucksvolles Beispiel wurde kürzlich dokumentiert mit Pseudomonas aeruginosa in der Lage, anzugreifen und zu töten Bakterien in einem T6SS-abhängigen Weise, also die Förderung der Errichtung von Bakterien in spezifischen mikrobiellen Nischen und Wettbewerbsumfeld 8,9,10 ist. Im letzteren Fall sind drei T6SS-sekretierte Proteine, nämlich Tse1, Tse2 und TSE3 wie die Toxine in den Zielbakterien (Abbildung 1) injiziert identifiziert. Donorzelle ist aus der schädlichen Wirkung dieser Effektoren über einen Anti-Toxin-Mechanismus, durch den TSI1, TSI2 und Tsi3 Immunität Proteine ​​vermittelt 8,9,10 geschützt. Dieses antimikrobielle Aktivität kann überwacht werden, wenn T6SS-kompetenten Bakterien zu n cokultiviert werdenolid Oberflächen im Wettbewerb mit anderen Bakterienarten oder mit T6SS-inactive Bakterien der gleichen Art 8,11,12,13. Die verfügbaren Daten betonte eine numerische Annäherung an die bakterielle Kompetitionsassay, einschließlich zeitaufwändig CFU Zählen, das hängt stark von Antibiotika Entscheidungsträger. Im Fall von antibiotikaresistenten Stämmen wie P. aeruginosa, können diese Methoden ungeeignet sein. Ferner mit der Identifizierung von etwa 200 verschiedenen T6SS Loci in mehr als 100 Bakteriengenome 14, ist eine bequeme Screening-Werkzeug sehr wünschenswert. Wir entwickelten einen Test, der einfach zu bedienen ist und erfordert Standard-Labor-Material und Reagenzien. Das Verfahren bietet eine schnelle und qualitative Technik, um die T6SS-abhängige bakterizide / Bakteriostase-Aktivität durch Verwendung eines Reporter-Stamm als Beute (in diesem Fall Escherichia coli DH5a) Zulassen einer-Komplementation des lacZ-Gens zu überwachen. Insgesamt ist dieses Verfahren graphic und ermöglicht eine schnelle Identifizierung von T6SS-bezogene Phänotypen auf Agarplatten. Dieses experimentelle Protokoll kann auf andere Stämme oder Bakterienspezies unter Berücksichtigung der besonderen Bedingungen wie Wachstumsmedium, Temperatur oder Zeit des Kontaktes angepasst werden.

Typische Ergebnisse sind in Abbildung 1 mit den Stämmen und Reagenzien in Tabelle 1 beschrieben dargestellt. Die Platten in dieser Figur gezeigt sind, wurden nach Inkubation über Nacht gescannt. Die &quot;Auslese-Input&quot; Platten zeigen eine Verdünnungsreihe Muster für die Stämme in diesem Assay verwendet. Wie erwartet ist der E. coli Beute Flecken (P) Überexprimieren das lacZ-Gen erscheinen blau auf Medien mit X-gal ergänzt, während der Spender P. aeruginosa-Stämme (D +, T6SS aktiv) und (D -, T6SS inaktiv) weiß bleiben. Die &quot;Auslese-Ausgang&quot; Platten, auf denen die Mischung zwischen dem Opfer und einem T6SS aktiven Stamm (D + / P) gesichtet wurde zeigen, das Verschwinden der blauen Beute damit angibt, dass es getötet wurde. Dies zeigt die Fähigkeit des Spenders, um die Beute outcompete. Die Persistenz der blauen Farbe auf dem (D - / P)-Platte zeigt die Unfähigkeit eines inaktiven T6SS Spender, um den blauen Beute zu töten. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Tötung von E. coli durch T6SS-kompetent P. aeruginosa. P. aeruginosa spritzt Toxine in den E. coli Zielzelle in einem T6SS-abhängigen Weise (durch den weißen Pfeil). Zwei Toxine Tse1 und TSE3 (orange und rote Kreise) in den E. eingespritzt coli Periplasma und verschlechtern die Peptidoglycan 9. Die Tse2 Toxin (gelber Kreis) wird in den E. eingespritzt coli Zytoplasma und hat eine bakteriostatische Wirkung 8,10. Die kombinierte Wirkung der Toxine tötet die Zielzellen (Blitz und Schädel). Die Überlebensrate von Zielzellen kann durch Überwachen der Aktivität des hergestellten β-Galactosidase (siehe auch Figur 2) erfaßt werden. P. eineruginosa gegen die Aktivität der Toxine durch die Immunität Proteine ​​TSI1, TSI2 und Tsi3 (orange, gelb und rot Plätzen, jeweils) 8,9,10 geschützt. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Agar-Platten-Assay zu überwachen T6SS-abhängige Abtöten der Bakterien In dieser Zahl sind auf dem oberen Teil der &quot;Auslese-Input&quot; Platten, bestehend aus den Verdünnungsreihen der D gezeigt -., D + und P-Eingang Zellen. Die P Eingangszellen sind blau aufgrund des α-Komplementation des lacZ-Gens und damit produzierten β-Galactosidase, dass spaltet X-Gal. Im unteren Teil wird die &quot;Auslese-Output&quot; Platten aus Verdünnungsreihen der bakteriellen Mischung zwischen einem aktiven (D + / P) gezeigt, </strong&gt;, oder ein inaktives (D - / P), T6SS Donor P. aeruginosa Stamm mit der E. coli Beute. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Die Quantifizierung der Tötung von E. coli durch P. aeruginosa nach 5 h Inkubation. Die Grafik zeigt die CFU Zählung von E. coli beschrieben in der 3,4 Schritt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen eine 3-fache Differenz zwischen dem T6SS + und den T6SS-Stämmen, was darauf hindeutet, dass die meisten der Tötung stattfindet während der 5 ersten Stunden des Kontakts.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Wir beschreiben einen qualitativen Test auf bakterielle Wettbewerb durch die vermittelten überwachen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Type VI Sekretionssystem (T6SS). Der Assay beruht auf der Überlebensrate / Abtötung von Escherichia coli eine tragende Zielzellen<em&gt; LacZ</em&gt;-Reporter. Diese Technik ist einstellbar, um die bakteriziden / Bakteriostase Aktivität T6SS-kompetente Mikroorganismen einzuschätzen.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Aufrufe.  Imperial College London. Wir beschreiben einen qualitativen Test auf bakterielle Wettbewerb durch die vermittelten überwachen Pseudomonas aeruginosa Type VI Sekretionssystem (T6SS). Der Assay beruht auf der Überlebensrate / Abtötung von Escherichia coli eine tragende Zielzellen LacZ-Reporter. Diese Technik ist einstellbar, um die bakteriziden / Bakteriostase Aktivität T6SS-kompetente Mikroorganismen einzuschätzen.

Serie: A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...