Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Der Glukosestoffwechsel ist für Trypanosoma brucei von entscheidender Bedeutung, aber es ist wenig darüber bekannt, wie die Zellen den sich ändernden Glukosespiegel in der Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren. Wir haben Parasiten entwickelt, die einen pH-Biosensor exprimieren, der es uns ermöglicht, den glykosomalen pH-Wert in lebenden Parasiten zu überwachen, was zum Verständnis der dynamischen Reaktionen von Parasiten auf Nährstoffschwankungen beitragen wird. Eine Herausforderung für dieses Experiment wäre die Verfügbarkeit eines Durchflusszytometers, das mit einem Mikrotiterplattenleser ausgestattet ist, sowie die entsprechenden Filtersets zur Messung der Biosensorfluoreszenz.

Darüber hinaus ist T. brucei ein Organismus der Risikogruppe zwei, daher muss das Zytometer in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe zwei untergebracht werden. Es wurde entdeckt, dass der pH-Wert von Glykosomen die Glykolyse beeinflussen kann, da Hexokinase und Phosphofructokinase pH-empfindlich sind. Die zuvor verwendeten pH-Sonden zielten jedoch nicht genau auf das Glykosom in der Blutbahnform ab.

Es wurde ein besseres Werkzeug benötigt, um die Beziehung zwischen glykosomalem pH-Wert und Glykolyse in diesem Parasiten-Lebensstadium zu untersuchen. Der pHluorin2-PTS1-Sensor ist ein Werkzeug, das in dieser Lebensphase besser am Glykosom lokalisiert werden kann als chemische pH-Sonden. Es ist benutzerfreundlich, da Sie die Expression des pH-Sensors nur über Nacht induzieren müssen und die Zellen pHluorin2 herstellen und im Glykosom lokalisieren.

Die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Messung von pHluorin2 erhöht den Durchsatz und verbessert die statistischen Messungen im Vergleich zur Mikroskopie.