We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

1. Manuelle Abstracted Model Generation Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Chimera, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden. Verwenden Sie diesen Ansatz, wenn das einzige Ziel ist es, ein geometrisches Modell (zB ein Ball und Stick-Modell), um geometrische Messungen zu machen, anstatt die Anzeige der Lautstärke Form der Objekte zu erstellen. <ol><li> Importieren Sie die Datenmenge in ein geeignetes Programm zur manuellen abstrahierten Modell-Generation. <ol><li> Wählen Sie Datei&gt; Öffnen Karte zu ziehen Sie die Datei öffnen-Dialog. Navigieren Sie zum Speicherort der Datei der gewünschten Karte. </li><li> Ziehen Sie den Volume Viewer (Extras&gt; Volume-Daten&gt; Volume Viewer), und wählen Sie Eigenschaften&gt; Anzeigestil, Daten mit verschiedenen Wiedergabearten anzuzeigen. </li><li> Stellen Sie die Schwelle für die Anzeige, indem Sie die vertikale Leiste auf dem Histogramm in der Volume ViewerFenster. </li></ol></li><li> Navigieren Sie durch das 3D-Volumen (zB Scheibe für Scheibe), um einen Bereich von Interesse für die Segmentierung wählen Beschneiden, eine kleinere Teilvolumen, wenn nötig. <ol><li> Im Dialog Volume Viewer, klicken Sie auf Achse, und wählen Sie X, Y, oder Z. </li><li> Im Dialog Volume Viewer, wählen Sie Eigenschaften&gt; Flugzeuge. Klicken Sie auf eine Tiefe zu setzen, um die entsprechend der Anzahl im linken Feld Ebene anzuzeigen, und klicken Sie auf Alle, um alle Ebenen anzuzeigen. </li><li> Im Dialog Volume Viewer, wählen Sie Eigenschaften&gt; Unterregion Auswahl. <ol><li> Klicken und ziehen Sie, um einen rechteckigen Rahmen um den Bereich von Interesse zu schaffen. </li></ol></li></ol></li><li> Platzmarkierungen entlang der Merkmal von Interesse und verbinden sie mit Linkern gegebenenfalls (oft automatisch vom Programm erledigt), bis das Modell fertig ist. <ol><li> Von der Volume Viewer-Menüleiste Extras&gt;Tracer-Dialog, um die Lautstärke Tracer Dialog zu öffnen. In der Volume Tracer Dialog wählen Sie Datei&gt; Neu Marker Set. </li><li> In der Volume Tracer Dialog, überprüfen Maus&gt; Platzmarkierungen auf hohe Qualität, Platz Markierungen auf Datenebenen, verschieben und Größe ändern Marker, Link-Marker, um neue Marker ausgewählt, und Link-Marker nacheinander ausgewählt. </li><li> Klicken Sie auf das Farbfeld Markierung, und wählen Sie eine Farbe. Wiederholen Sie diesen Schritt für Link Farbe. </li><li> Geben Sie Radien für die Markierung und Link-Modell-Bauelemente. </li><li> In der Volume Tracer-Fenster, wählen Sie Platz Marker mit [right] Maustaste, und legen Radien für Marker und Links. </li><li> Klicken Sie rechts auf den Volumendaten zur Festlegung Marker zu beginnen. Marker werden automatisch verbunden werden. </li><li> In der Volume Tracer Dialog, wählen Sie Datei&gt; Speichern aktuellen Marker-Set, dann Datei&gt; Schließen Marker Set. </li></ol></li&gt; <li> Öffnen Sie eine neue Markierung gesetzt (Schritt 1.3.1) ein Modell in eine zweite gewünschte Merkmal von Interesse zu beginnen. Nutzen Kontrastfarben zwischen Markersets auf Unterschiede in den Eigenschaften zu betonen. </li></ol> 2. Manuelle Tracing von interessierenden Merkmalen Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Amira, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden. Verwenden Sie diesen Ansatz, wenn die Bevölkerungsdichte relativ gering ist und wenn die Genauigkeit der Merkmalsextraktion ist von größter Bedeutung, da manuelle Rückverfolgung ist eine zeitraubende Ansatz. <ol><li> Importvolumen von Daten in ein Programm mit manueller Rückverfolgung Optionen. Software mit dieser Fähigkeit bieten in der Regel zumindest ein grund Pinsel-Werkzeug. <ol><li> Für große Volumina oder Schichtaufnahmen (zB 16-Bit 2.048 x 2.048 oder größer .rec oder Schichtaufnahmen in .mrc IMOD generiert): Wählen Sie Open Data&gt; Rechtsklick auf filename.rec&gt; Format ...&gt; Wählen Sie Raw als LargeDiskData </i&gt;&gt; Ok&gt; Laden. Wählen Sie den entsprechenden Rohdaten Parameter von Header-Informationen&gt; Ok. Wechseln und Speichern unter einem neuen <a href="http://filename.am/">filename.am</a> Datei für die Verwendung in den folgenden Schritten. </li><li> Für kleinere 3D-Bildstapel-Dateien (zB, 3D-oder TIF-oder .mrc .rec): Open Data&gt; Wählen filename.tif oder filename.mrc. Knebel und Rechtsklick&gt; Speichern unter <a href="http://filename.am/">filename.am</a> . Wenn ein Fehler generiert oder das Programm nicht mehr reagiert, kann die Datei zu groß sein und kann durch folgenden Schritt 2.1.1 geöffnet werden. </li></ol></li><li> Navigieren Sie durch die Scheiben, um eine 3D-Untervolumen für die Segmentierung zu wählen, und dann auf diesen Bereich von Interesse zu beschneiden. <ol><li> Im 3D-Viewer-Fenster, wählen Sie Orthoslice Image-Datei zu öffnen. Verwenden Sie Schieberegler unten, um durch Scheiben zu navigieren. </li><li> Um größere Daten als LargeDiskData geöffnet beschneiden, Kniedateinamen in Pool Fenster&gt; Rechtsklick&gt; LatticeAccess. Enter gewünschten Kastengröße&gt; Übernehmen. Sparen Sie neue Datei. </li></ol></li><li> Erstellen Segmentierung Datei. <ol><li> Schalten Sie die Datei in der Pool-Fenster&gt; Rechtsklick&gt; Beschriftung&gt; Labelfield. Eine neue Datei wird erstellt und automatisch in der Registerkarte Segmentierung Editor geladen. </li></ol></li><li> Verfolgen Sie die Grenze des ersten Merkmal von Interesse, dann füllen Sie den Spuren von Hand oder mit einem Befehl spezifisch für die verwendete Software. Folgen Sie dem Merkmal von Interesse durch alle Scheiben und wiederholen Sie den Handverfolgung Segmentierung. Verwenden Sie die folgenden Befehle bei der Verwendung von Amira: <ol><li> Um das Pinsel-Werkzeug verwenden, Pinselgröße ändern, wie gewünscht, dann verwenden Sie den Mauszeiger auf den Rand des Merkmal von Interesse zu verfolgen. </li><li> Füllen Sie den Bereich mit verfolgt Abkürzung &quot;f&quot;. Fügen Sie die Auswahl, indem Sie auf die Schaltfläche mit dem Plussymbol oder die Verknüpfung &quot;a&quot;. Wenn nötig, drücken Sie &quot;u&quot; rückgängig zu machen, und &quot;s&quot; zu subtrahieren oder zu löschen. </li></ol&gt; </li><li> Erzeugen eine Oberflächendarstellung zur Visualisierung und Grund qualitative oder quantitative Analyse pro Software-Benutzerhandbuch Unterricht. <ol><li> In der Objektpool Registerkarte, drücken Sie die Dateinamen-labels.am im Pool-Fenster&gt; Rechtsklick&gt; SurfaceGen. </li><li> Wählen Sie die gewünschten Oberflächeneigenschaften&gt; Übernehmen. Eine neue Datei wird filename.surf im Pool erstellt werden. </li><li> Um die segmentierte Volumen visualisieren, Kippschalter filename.surf in Pool Fenster&gt; Rechtsklick&gt; Surface. </li><li> Verwenden Sie die Werkzeuge in der 3DViewer Fenster verschieben, drehen, vergrößern und in der 3D-Volumen. </li></ol></li><li> Entpacken Sie die genaue Dichte und bestimmen Messungen wie Volumen oder Fläche. Export in andere Programme für fortgeschrittene Anzeige, Analyse und Simulation. <ol><li> Auf 3DViewer Fenster auf Messen Werkzeug&gt; Wählen Sie die entsprechende Option (2D-und 2D-Länge Winkel für Messungen an einem einzigen 2D-Ebene, 3D-Länge und 3D-Winkelfür Messungen an einem 3D-Volumen). </li><li> Klicken Sie auf Netzoberfläche, um die gewünschte Länge, Abstand und Winkel zu messen. Die Werte werden im Fenster Eigenschaften aufgelistet werden. </li></ol></li></ol> 3. Automatisierte dichtebasierte Segmentierung Hinweis: Die Einzelheiten der Methode unten beschriebenen spezifischen Amira, aber auch andere Software-Pakete können stattdessen verwendet werden. <ol><li> Verwenden Sie diesen Ansatz auf Datensätze mit jeder Sorte von Kontrast, Schärfe oder Gedränge, um die Dichten von Interesse zurücktreten. </li><li> Importvolumen von Daten in ein Programm mit Schwellen, Zauberstab oder anderen Werkzeugen Dichte-basierte automatische Segmentierung ausgestattet. Folgen Sie den Schritten in 2.1-2.1.2 in die Richtungen für die manuelle Rückverfolgung skizziert. </li><li> Navigieren Sie durch Scheiben und wählen Sie Bereich für die Segmentierung. Wenn nötig, schneiden Sie einen kleineren 3D-Teilvolumen für die Segmentierung. Folgen Sie den Schritten in 2.2-2.2.2 in die Richtungen für die manuelle Rückverfolgung skizziert. </li><li> Wählen Sie die Dichte vonein Merkmal von Interesse, in der Regel durch Anklicken oder Anbringen einer Markierung oder Ankerpunkt auf der Funktion. Wenn in der Software erlaubt, geben Sie eine Zahl Bereich umfasst Pixelintensität des Features und passen diese Toleranz, wie gewünscht. Dichten zu dem Merkmal gehört, wird in Übereinstimmung mit der Intensität des Pixels oder Toleranzwert des Ankers aufgenommen wird. Verwenden Sie die folgenden Befehle bei der Verwendung von Amira. <ol><li> Verwenden Sie den Zauberstab für Features mit unterscheidbaren Margen. <ol><li> Klicken Sie auf den Bereich von Interesse, dann Schieberegler im Display und Masking einstellen, um die korrekte Wertebereich zu erfassen, so dass die Funktion vollständig markiert ist. Auswahl hinzuzufügen Verknüpfung mit &quot;a&quot;. </li></ol></li><li> Verwenden Sie den Threshold-Tool für Funktionen, ohne sich deutlich Margen. </li><li> Wählen Sie den Threshold-Symbol. Stellen Sie Schieberegler, um Dichte innerhalb wünschenswerten Bereich so einstellen, dass nur die Merkmale von Interesse sind maskiert. Klicken Sie auf Select-Taste und dann Auswahl hinzuzufügen Verknüpfung mit220; a &quot;. </li><li> Zu Segment gesamte Volumen, wählen Sie Alle Scheiben vor der Zugabe Auswahl. </li><li> So entfernen Sie Rauschen, wählen Segmentation&gt; Entfernen Inseln und / oder Segmentierung&gt; Glatte Etiketten. </li></ol></li><li> Erzeugen eine Oberfläche für die Visualisierung und qualitative Analyse, wie im Handbuch beschrieben Verfolgung Abschnitt 2.6-2.6.2. Wenn gewünscht, den Export in andere Programme für ausreichend 3D-Display, quantitative Analyse und Simulationen. </li></ol> 4. Maßgeschneiderte Automatisierte Segmentierung Hinweis: Verwenden Sie diesen Ansatz, um kundenspezifische Skripte für die automatische Segmentierung, die Erfahrungshintergrund in der Informatik die Möglichkeit, eine genaue Dichtemodell aus einem großen Volumen zu erstellen erfordert, sondern ermöglicht erstellen. <ol><li> Werkzeuge (spezielles Beispiel des Shape-Betreute Segmentierung in MATLAB 27) <ol><li> Bildvorverarbeitung: Führen Entrauschen, Hintergrundentfernung und Bildverbesserungmit der folgenden Rohrleitung: <ol><li> Laden Sie das Bild mit dem Befehl imread. <ol><li> In der Befehlszeile eingeben: &gt;&gt; im = imread ($ image_path), wobei $ image_path ist die Lage des Bildes analysiert werden. </li></ol></li><li> Von der Bildverarbeitung Toolbox, rufen Wiener-Filter mit einem geschätzten oder bekannten Rausch-power-to-Signal-Verhältnis (NSR). </li><li> Auf der zuvor bearbeiteten Bild, rufen Sie die Bildöffnungsfunktion IMOPEN auf die Hintergrundebene zu schätzen, dann zuteilen, das Ergebnis als eine andere Maske. <ol><li> In der Befehlszeile eingeben:. &gt;&gt; Hintergrund = IMOPEN (im, Strel ($ shape_string, $ size)), in diesem Verfahren, ist $ shape_string gleich &#39;Festplatte&#39; der Variablen $ Größe wird durch den Analysator gegeben dh &gt;&gt; Hintergrund = IMOPEN (im, Strel (&#39;disk&#39;, 15)). </li></ol></li><li> Subtrahieren des gefilterten Bildes mit dem Hintergrund. <ol><li> In der Befehlszeile eingeben: &gt;&gt; im2 = im -Hintergrund </li></ol></li><li> Abhängig von der Qualität der Ergebnisse, führen Bildnormierung mit oder ohne adaptive Otsu-Verfahren 28, die mit der Funktion imadjust von der Bildverarbeitungs Toolbox aufgerufen werden können. <ol><li> In der Befehlszeile eingeben: &gt;&gt; im3 = imadjust (IM2) </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Merkmale von Interesse für die Segmentierung, die Begrenzung der Bereiche von Interesse durch Zuschneiden des normalisierten Bildes. <ol><li> Mit dem Befehl imtool, erkunden Sie die Region von Interesse, die beschnitten werden soll, und geben Sie die Koordinaten für den Befehl: &gt;&gt; im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), wo der Vektor [x1 y1 x2 y2] entspricht das Quadrat Region abgeschnitten. </li></ol></li></ol></li><li> Formerkennung / Betreute Form Klassifizierung: Trainieren Sie den Algorithmus durch konkrete Beispiele für jede andere Kategorie von Objekten (lineare Spuren in einem 2D-Bild über die Merkmale von Interesse). <ol><li> Prüfen Sie, ob VLFEAT 29 API erfolgreich installiert wurde und besuchen Sie die Website VLFEAT für tiefer gehende Dokumentation. </li><li> In der Befehlszeile eingeben: &gt;&gt; [BAUM, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K $ NLEAVES) wobei $ K ist die Anzahl der Cluster verwendet werden soll oder die Anzahl der Klassen der Beobachter will die Daten in zu arrangieren, und $ NLEAVES ist die gewünschte Anzahl von Blattgruppen, dh &gt;&gt; [BAUM, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4.100) </li><li> Verwenden Sie manuell segmentiert Funktionen als Eingabe für VLFeat. HINWEIS: Dieses Open-Source-C-basierte Bibliothek wird in Abhängigkeit von der Art der gewählten Methode am besten für den Datensätzen arbeiten Pixel Patch, Patch-Cluster und Cluster-Zentrum Positionierung durchzuführen. Die verfügbaren Optionen reichen von k-Mittelwert-Clustering zu Texton Basierte Ansätze 30 und der Ausgang ist eine Zahlenmatrix, die von den gewünschten Eigenschaften für den gegebenen Exemplare anhand beschreibt. </li></ol></li></ol></li><li> Segmentierung: Verwenden Sie diese fuLLY automatisierten zwar rechenintensiv, Ansatz Segment mehrere Klassen von Objekten gleichzeitig, die als getrennte Karten für die weitere Analyse und Visualisierung geschrieben wird. <ol><li> Laden Sie die zuvor erzeugte Zahl Array (Modell). </li><li> Rufen Sie die Support-Vektor-Maschine (SVM)-Funktion in VLFeat, mit dem Modell und das Bild als Eingangs segmentiert werden. <ol><li> In der Befehlszeile eingeben: &gt;&gt; [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0,1), wobei x die ursprünglichen Bildausschnitt im2_crop und y ist das Ziel, dem Bild, das manuell segmentiert wurde. Verwenden Sie &gt;&gt; ISEG = VL_IMSEG (I, Etiketten), die Ergebnisse nach den von der Clusterbildung erzeugt Etiketten zu färben. HINWEIS: Auf der Grundlage der Merkmale des Modells, werden VLFeat das Bild auf der Anzahl der Klassen zu klassifizieren (Merkmale von Interesse) von Anfang an zugeordnet. Je nach dem Grad der gewünschten Genauigkeit, ist es möglich, dieses Verfahren mit anderen Ansätzen oder Schätzung CLUST kombinierener Parameter wie Rumpf und Clusterzentren. Der Ausgang der SVM-Algorithmus ist ein Wahrscheinlichkeitsmodell und mehrere binäre Masken der gewünschten Klassen in den neuen Datensätzen. </li></ol></li><li> Ergebnisse speichern, indem Sie den Befehl: &gt;&gt; imwrite (im, $ format, $ filename), wobei $ Format ist &#39;tiff&#39; und $ filename ist der Pfad für die Ausgabedatei. </li><li> Zur Visualisierung von Bildern, geben Sie den Befehl: &gt;&gt; imshow (im). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Effektive Strategien für die Gewinnung von relevanten Merkmalen aus 3D EM Volumina dringend erforderlich, um mit der Daten Tsunami, der vor kurzem getroffen hat biologische Bildgebung erforderlich halten. Während Daten kann in Stunden oder Tagen erzeugt werden, dauert es viele Monate, um die 3D-Volumen in der Tiefe zu analysieren. Daher ist es klar, dass die Bildanalyse wurde zum Engpass für wissenschaftliche Entdeckungen; ohne angemessene Lösungen für diese Probleme, Imaging Wissenschaftler werden Opfer ihres eigenen Erfolgs. Dies ist zum Teil auf die hohe Komplexität der Daten und auch das makromolekulare Verdrängung typischerweise in biologischen Zellen, in denen Proteine ​​und Proteinkomplexe aneinander angrenzen und im wesentlichen als kontinuierlicher Gradient von Graustufendichten angezeigt gefunden. Das Problem wird durch die Probenvorbereitung und Imaging Unvollkommenheiten kompliziert, und in einigen Fällen Bildrekonstruktionsartefakte, die zu weniger als perfekt volumetrischen Daten, die Herausforderungen für die vollautomatische Ansatz darstellen könnenES. Wichtigsten jedoch ist die Tatsache, dass die Experten in der Probenvorbereitung, Imaging, und der biologischen Interpretation nur selten gut in Computational Science versiert sind und daher Hinweise, wie effektiv nähern Merkmalsextraktion und Analyse. Deshalb durch den Einsatz von verschiedenen Beispielen, erklärt das Protokoll, wie Daten für die Segmentierung sowie die Schritte für die manuelle abstrahierten Modell Generierung, die automatische Segmentierung Dichte-basierte, manuelle Rückverfolgung von interessierenden Merkmalen und maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung vorzubereiten. Die manuellen und automatischen Ansätze in dem Verfahren beschrieben in einer Vielzahl von Segmentierungs Software, von denen einige hier erwähnt gefunden werden, aber andere ähnliche Funktionen und sind gleichermaßen gut geeignet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit von jedem der 3D-Segmentierungsansätze variiert für jede andere Art von Datensätzen. Obwohl die verschiedenen Ansätze qualitativ produziert similar 3D-Renderings als Endprodukt, die Menge an Zeit und Mühe auf jede verbrauchte während des Segmentierungsprozesses erheblich variiert. Die Empfehlungen für geeignete Bildeigenschaften und persönlichen Ziele pro Segmentierungsansatz sind in Abbildung 5, die in den folgenden vier Unterabschnitten näher erläutert wird zusammengefasst. Diese Kriterien wurden auf die sechs Datensätze Obwohl die 5 aufgebracht, wie in der Entscheidung Flussdiagramm von 6 gezeigt. Und 6 sind lediglich dazu da, um eine Begründung für jeden Datensatz liefern und wie die einzelnen Kriterien wurden in den Entscheidungsprozess gewichtet, bieten sie nicht eine narrensichere Anleitung, sondern ein Ausgangspunkt. Es gibt einfach zu viele Kriterien, die die Entscheidungsprozesse beeinflussen: einige sind objektive Kriterien, wie beispielsweise Daten-Set Eigenschaften, während andere eher subjektive Kriterien, wie das angestrebte Ziel. Es ist sicher zu sagen, dass die Datenmengen, die einen hohen lev anzeigenel Kontrast mit scharfen klaren Grenzen, haben Eigenschaften, die auch getrennt und relativ homogene (nicht zu unterschiedlich) sind, und werden mit dem Ziel der Darstellung einer Dichtemodell für eine große Anzahl von Objekten verarbeitet, werden automatisierte Ansätze überlegen sein, wenn nicht für die Tatsache, dass manuelle Ansätze würde einfach Ressource (Zeit) -prohibitive sein. Auf der anderen Seite, wenn Kontrast niedrig ist, ist die Daten unscharf und erfordert Wissen eines Experten, sind die Objekte überfüllt, und die Merkmale zeigen eine hohe Vielfalt und sind somit heterogene So kann man keine andere Wahl als die manuelle Merkmalsextraktion / Segmentierung. Hand Abstracted Model Generation Hand abstrahierten Modell-Tracing ist besonders wirksam bei der Segmentierung lineare Elemente, die Bereitstellung Samen Punkte (Kugeln), die automatisch verbunden werden können (Sticks). Wie Bälle und Stöcke-Modelle können sehr mächtig, um eine Länge zu messennd Ausrichtung eines solchen Modells und bieten eine ausreichend abstrahiert Modell für qualitative Prüfung und quantitative Analyse. Hand abstrahierten Modellgeneration wird häufig verwendet, wenn die Minimierung Ressourcen auf der Analyse verbracht ist wichtiger als absolute Treue zu den Formen der ursprünglichen Daten. Es ist am erfolgreichsten mit linearen und homogenen Merkmale von Interesse (zB Filamente, Rohre). Daten hingegen Knusprigkeit und Gedränge nicht eine große Rolle spielen bei der Bestimmung den Erfolg dieser Methode, so lange wie das menschliche Auge kann das Objekt von Interesse zu erkennen. Manchmal werden solche Modelle auch als Skelett-Segment der Karte 3D in einer Zone um das Skelett eingesetzt werden. Obwohl das Modell ist abstrakt und nicht ein Spiegelbild der genauen Dichten, stellt sie eine skelettierte Version der 3D-Dichte und ermöglicht störungsfreie Visualisierung und qualitative Analyse so. Quantitative Messungen wie Länge kann auch aus dem Näherungsmodell bestimmt werden. Für eineBeispiel Software mit manueller abstrahierten Modellgeneration, besuchen Sie bitte die Chimera ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html</a> . Hand Tracing von interessierenden Merkmalen Hand Pinsel Verfolgung funktioniert gut mit fast allen Dateneigenschaften, aber es ist auch die zeitaufwändige Methode. Manchmal ist die einzige Technik zum Extrahieren eines Merkmals von Interesse aus einem komplexen Bildsatz enthält eine Vielzahl von Funktionen, wie die dünne und gewundene Zellmembran. Ein nützliches Werkzeug, in einigen Programmen ermöglicht Interpolation zwischen intermittierend segmentiert Scheiben, wenn die Funktion von Interesse ändert reibungslos. Handverfolgung am effizientesten eingesetzt, wenn die Daten ist knackig und hat mittlere bis hohe Kontrast werden, es kann aber auch genutzt werden,für anspruchsvollere Datensätzen, so lange wie der Benutzer mit dem Objekt von Interesse bekannt. Die Datenkomplexität kann von diskreten Objekte bis hin zu komplexen und überfüllten Datensätzen, in denen Objekte dicht gepackt liegen. Im letzteren Fall kann eine manuelle Segmentierung die einzige Wahl sein, da die automatische Ansätze oft schwer, Segment die gewünschte Lautstärke und extrahieren zu viel oder zu wenig. Schwierig Feature Morphologien, wie gefaltet Blätter oder Volumina, kann auch mit dieser Methode gewonnen werden. Allerdings sollte der Anwender im Auge zu behalten, dass ein Datensatz mit mehreren schwierigen Eigenschaften können nur segmentiert werden, wenn die Populationsdichte der Merkmale von Interesse ist gering, da die Segmentierung der hohen Bevölkerungsdichten der Merkmale von Interesse wird zeit unerschwinglich. Ein Beispiel für die Software mit manueller Rückverfolgung, besuchen Sie bitte Amira ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guid</a>e.pdf. Automatisierte dichtebasierte Segmentierung Im Gegensatz zu den manuellen Techniken, die automatisierte Ansätze im Allgemeinen weniger zeitaufwendig, was ein wichtiger Faktor bei der Segmentierung eines großen Stapels von Bildern ist. Jedoch können einfache Schwellen nicht so genau zu sein, und viel mehr Zeit kann auf Raffinesse und Kuration der automatisch segmentierten Volumen ausgegeben werden. Automatisierte Segmentierung Dichte-basierte funktioniert am besten auf Datensätzen, die eine große Anzahl von ähnlichen Eigenschaften von Interesse, dass alle erfordern Segmentierung anzuzeigen. Wenn die Daten komplexer, können diese automatisierten Techniken noch als einen ersten Schritt zu dienen, wird aber wahrscheinlich erfordern eine manuelle Eingriffe auf der ganzen Linie, um ein Teilvolumen die Funktion von Interesse enthält angeben. Diese Strategie funktioniert in der Regel gut auf lineare Morphologien oder gewundenen Bände, aber es selten erfolgreich mit dünnen gewundenen Blättern, wie istZellmembranen. Minimalem Benutzereingriff mit automatisierten Ansätze ermöglicht die Segmentierung durch große oder kleine Mengen, während aufwendet wenige Benutzer Ressourcen wie Zeit im Gegenzug für hohe Wiedergabetreue. Ein Beispiel für die Software mit automatisierten Segmentierung Dichte-basierte, besuchen Sie bitte Amira ausführliche Bedienungsanleitung im Internet unter <a href="http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf">http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf</a> . Maßgeschneiderte Automatisierte Segmentierung Maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung ermöglicht die Strom Anpassung von Algorithmen für eine bestimmte Datenmenge, aber es ist oft spezifisch für die Datensatz oder Datentyp, für eine begrenzte Anzahl von Merkmalseigenschaften falls und kann nicht einfach verallgemeinert werden. Die hier präsentierten Verfahren unterscheidet sich von den allgemeinen automatisierte Segmentierungsansätze, wie zum Beispiel Wasserscheide Eintauchen und andere Ebene<html> Set-Methoden, die auf einem programmierten Bestimmung des kritischen Saatpunkte verlassen, gefolgt von schnellen Marsch Würfel Expansion aus diesen Samen Punkten. Eine Variation dieses Themas ist Randsegmentierung, wo Gradientenvektors Informationen informiert Feature-Grenzen. Im Gegensatz dazu angepasst Skript hier stützt sich auf eine Trainingsstufe, wo der Benutzer manuell verfolgt einige Beispiele. Durch maschinelles Lernen, werden spezifische Algorithmen erkennen und dann lernen, selbstständig Eigenschaften und Datenmerkmale konsequent in den Spuren gefunden zu erkennen. Ein Experte Benutzer kann die Algorithmen umzuschulen und die Genauigkeit der Segmentierung zu verbessern, indem mehr Beispiel wird, um eine größere Menge von Merkmalskriterien liefern. Insgesamt kann Schwellen und verwandte Ansätze, oder auch maßgeschneiderte Ansätze nicht so nützlich, um ein einzelnes Merkmal von Interesse aus einem Bild mit komplexen Vielfalt von Organellen oder Formen zu extrahieren, wie Kuration kann nur als arbeitsintensiv, da manuelle Verfolgung sein. &quot;&gt; Strategien für die Selektierung Daten und Wahl eines Segmentierungsansatz Angesichts der subjektiven und objektiven Kriterien in Abbildung 4 und Zusammenfassung von geeigneten Datensätzen in Abbildung 5 dargestellt, kann das Entscheidungsschema in Abbildung 6 dargestellt eine effektive Beurteilung der Merkmalsextraktion Strategien für eine Vielzahl von Datensätzen zu unterstützen. Die Datensätze werden in vier aufeinanderfolgenden Entscheidungen, von denen jede eine der vier jeweiligen Ziele sowie die vier subjektiven Kriterien in 4 eingeführt umfassen gesichtet. Als Beispiel ist 6 rationelle Selektierung für jede der sechs Daten Sätze in Abbildung 3 dargestellt. Zweifellos für jeden Datensatz gibt es nicht einen einzigen eindeutigen Pfad, sondern verschiedene Wege durch diese Matrix folgende Kriterien für die Entscheidungsfindung, die führen können to gleich oder verschieden Empfehlung für die Datensegmentierung. Während jeder Datensatz wird seinen eigenen Satz von Eigenschaften, die nicht vorhergesehen werden können, sind sechs Beispiele gegeben, die jeweils mit einer Erläuterung der Gründe für die bevorzugte Merkmalsextraktion / Segmentierungsansatz gepaart. Die meisten enthalten auch einen Vorschlag für eine alternative Route, die Entscheidung entweder Ergebnisse bei der Verwendung der gleichen oder einer anderen Segmentierungsansatz (Figur 6). Die Kinozilium ist eine scharfe Daten mit klar definierten Grenzen, die automatisierte Ansätze mehr Aussicht auf Erfolg eingestellt ist. Alle Funktionen von Interesse sind gut voneinander getrennt, wodurch ein wieder automatisierten Ansatz. Außerdem sind die Eigenschaften von Interesse ähnlich zueinander, so dass es eine relativ homogene Datensatz ideal für maßgeschneiderte Segmentierung. Schließlich war es das Ziel, die gesamte Funktion zu extrahieren, Begünstigung eines halbautomatischen Ansatz. Als Folge wurde der Schluss gezogen, dass eine automatisierte Schwellwerte (Fest grüne Linie) sowie eine kundenspezifische (zB, Form überwacht Segmentierung) Ansatz (gestrichelte grüne Linie) sind beide wahrscheinlich auf diesem Datensatz gut tun. Ähnliche Kriterien, wenn auch in einer anderen Reihenfolge bei der Entscheidungsfindung Netzwerk platziert, gelten für den Fall von Bakterien. Eine maßgeschneiderte Ansatz wird zum Teil empfohlen, da dieser Datensatz war sehr groß; Daher verbieten begrenzten Ressourcen eine arbeitsintensive manuelle Eingriffe / Segmentierungsansatz. Während Schwellen würde akzeptable Ergebnisse geliefert haben, war die kundenspezifische Ansatz in der Lage, Schlüsselziel der Studie ausführen, um die rundlichen Bakterienformen aus den extrazellulären Metallablagerungen, die sich entweder in-zwischen die Bakterien oder direkt neben den Bakterien zu trennen und damit die maßgeschneiderten Ansatz bevorzugt wurde. Für Stereozilien Datensätzen, die erste Überlegung war das angestrebte Ziel: Das Ziel kann entweder die gesamte Dichte zeigenoder geometrische Modelle zu erstellen. Das Volumen von Interesse war überfüllten Raum, und das Ziel war es, Segment eine große Anzahl von Objekten getrennt, wie Objekte, um anschließend ausführen quantitative volumetrische Analyse, einschließlich Längen, Zahlen, Abstände, Ausrichtung, etc. Es war hilfreich, dass die Objekte der Interesse waren vor allem linear, und das machte geometrische Modell Tracing die Methode der Wahl. Allerdings, wenn anstatt das Ziel war es, die gesamte Dichte, dann ist die lineare Funktion Morphologie sowie relativ hohen Kontrast mit scharf definierten Grenzen würde eine automatisierte Schwellen Protokoll möglich machen zu zeigen. Die Zellmembranen und Mitochondrien Daten Fällen sind eine Herausforderung für die automatisierte Ansätze aufgrund ihrer Kategorien der Morphologie-Funktion: Blätter gefaltet und Volumen auf. Das Ziel ist, die Zelle oder den Mitochondrien Umriss genau zu verfolgen, aber es gibt nur begrenzte Ressourcen, um dies zu tun. Darüber hinaus sind die Eigenschaften der interest sind komplex und nicht leicht automatisch erkannt oder Form-codiert sind, obwohl für die Mitochondrien-Daten setzt die kundenspezifische Scripting-Ansatz für die Bakterien hat möglicherweise mit weiteren Anpassung angewendet werden. Glücklicherweise ist die Membran und Mitochondrien selbst nur einen kleinen Teil des gesamten Volumens und somit ist eine einfache manuelle Rückverfolgung, wenn auch zeitaufwendige Vorgehensweise. Handverfolgung ist auch die Methode der Wahl für solche Datensätze, wenn der Kontrast nicht gering, und die Grenzen sind nicht unscharf. Als ein Ergebnis, auch wenn sie einen beträchtlichen Teil der Datensätze darstellen, müssen diese gewundenen Blätter manuell verfolgt werden, einfach aufgrund des Fehlens einer Alternative. Die Anlage Datensatz stellte seine eigenen Herausforderungen, denn das Ziel war es, alle Objekte Segment, die dicht angeordnet sind und machen einen überfüllten Landschaft. Anzeige der Dichte-Messungen ist, würde über die Form und Organisation der Objekte, sondern b ermöglicheneil manuell Segmentierung jedes Faden Objekt wird zu teuer, automatische Schwellen anstelle beschäftigt. Die verschiedenen Schritte und die entsprechenden Ergebnisse bei der Erstellung eines 3D-Modells wurden hier angezeigt, aber noch wichtiger ist, die Dateneigenschaften und persönlichen Kriterien gefunden, für die Bestimmung des besten Pfades der Segmentierung sind auch aufgeklärt worden sein. Die wichtigsten Merkmale der Bilddaten selbst enthalten, was hier als Gegensatz Gedrängt, Knusprigkeit, und die Anzahl von verschiedenen Formen oder Eigenschaften (wie beispielsweise Organellen, Filamenten, Membranen) beschrieben. Subjektiven Kriterien zu berücksichtigen sind das angestrebte Ziel der Segmentierung (Mess / Zählen, skelettiert Darstellung der Daten / Anzeigen Volumen in 3D-Renderings), morphologische Merkmale des Merkmal von Interesse (linear, längliche, vernetzte, komplexe, gewundene), die Dichte der Merkmale von Interesse in Bezug auf das gesamte Volumen (der Anteil der Objekte, diewichtig und extrahiert werden müssen) und den Ausgleich der Kompromisse von Ressourcen aufwendet, um die Segmentierung der Treue der Originaldaten und die abnehmende Rendite auf die Investition, die inkrementelle Verbesserungen für wesentlich höhere Zuweisung von Ressourcen. Der Bereich der Bildsegmentierung hat sich in den letzten Jahren gereift ist, doch gibt es keinen Königsweg, kein Algorithmus oder ein Programm, das alles kann. Datensatzgrößen haben aus Hunderten von Megabyte, routinemäßig Zehn Gigabyte aufgewachsen, und sie sind jetzt zu Terabyte überschreiten, so dass manuelle Segmentierung in der Nähe unmöglich. So brauchen mehr Ressourcen, um in den clever und zeitsparende Merkmalsextraktion Ansätze, die den menschlichen Entscheidungsprozess imitieren investiert werden. Solche Bemühungen müssen mit (1) geografischen Informationssystem (GIS) kombiniert werden basierte semantische hierarchischen Datenbanken (ähnlich wie bei Google Earth), (2) Datenabstraktionstechniken (dh den Übergangvon einem Voxel zu geometrisch / volumetrische Darstellung) mit computergestützten Entwurf (CAD)-Software, um die Datenmenge erheblich zu reduzieren und ermöglicht so die Anzeige von größeren Volumina 35, (3) Simulationstechniken, wie sie häufig in den verwendeten kompatiblen Ingenieurwissenschaften, sowie (4) Erweiterte Animation und Film machen Fähigkeiten, einschließlich fly-through-Animationen (ähnlich dem, was für die Spieleindustrie entwickelt). Klar, effiziente Merkmalsextraktion und Segmentierung liegt im Herzen dieser kommenden Revolution in der Zell-hochauflösende Bildgebung, und während bessere Ansätze werden immer benötigt werden, hier präsentiert die Grundsätze, sowie die Beispiele, was Ansatz wurde für verschiedene Datentypen genommen , liefert einige wertvolle Informationen, um eine Entscheidung, auf dem Ansatz zu nehmen.

Traditionell ist die Elektronenmikroskopie (EM) Feld ist in 1) der Strukturbiologie Zweig mit hohen und super-hochauflösende TEM-geteilt worden, in der Regel mit impliziten oder expliziten Datenmittelung, um die dreidimensionale (3D) Struktur der makromolekularen Komplexen mit Untersuchung kombiniert ein definierter Zusammensetzung und in der Regel eine relativ kleine Größe 1-4, und 2) die zelluläre Bildgebung Branche, in der gesamten zellulären Szenerien werden visualisiert 1,5,6. Während die Strukturbiologie Zweig hat eine spektakuläre Entwicklung in den letzten vier Jahrzehnten durchgemacht, die Zellbiologie Filiale wurde vor allem auf zwei Dimensionen oft auf weniger-als-optimal konservierten Proben beschränkt. Erst mit dem Aufkommen der Elektronentomographie in den letzten zehn Jahren hat zellbiologische Bildgebung ultra in die dritte Dimension 5,7, wo in der Regel durchschnittlich nicht als die zellulären Landschaften, und damit die Merkmale von Interesse durchgeführt werden, erweitert, sind in der Regel eindeutig. Obwohl visualisiert zellulären Szenen sind oft atemberaubend für das Auge, effiziente Extraktion der Merkmale von Interesse und die anschließende quantitative Analyse solcher hoch komplexen zellulären Mengen zurückbleiben, zum Teil, weil die genaue Proteinzusammensetzung ist in der Regel unbekannt, daher macht es schwierig zu interpretieren, diese zellulären 3D-Volumen. Zu diesem Zeitpunkt wird umfangreiches Know-how biologischen oft um komplexe Schichtbilder zu interpretieren, oder auch, um die wichtigen Regionen und wesentliche Komponenten in der 3D-Volumen zu identifizieren benötigt. Als weitere Komplikation ist die Visualisierung von 3D-Volumen bemerkenswert nicht trivial. 3D-Volumen kann gedacht werden und somit als Stapel von 2D-Bildern visualisiert. Scheibe-für-Scheibe Inspektion von aufeinanderfolgenden 2D-Bildern reduziert die Komplexität, sondern begrenzt auch die Merkmalsextraktion und somit eine quantitative Analyse auf die zwei Dimensionen. Für die meisten 3D-Objekte, die Darstellung von 3D-Volumen lediglich als ein Stapel von aufeinanderfolgenden Ebenen führt aber zu einer unvollständigen eind schiefe Perspektive in 3D Natur eines bestimmten Systems. Alternative Formen der Sichtprüfung erfordern entweder Volumen-Rendering oder Oberflächen-Rendering, die angesichts der oft-dichte Natur eines zellulären Volumen-kann leicht zu einer Sichtbehinderung von verschachtelten Objekten führen oder zu überwältigen einen Benutzer insgesamt, wodurch interaktive manuelle Segmentierung schwierig. Um diese Barrieren, eine große Vielzahl von automatisierten Merkmalsextraktion zu beheben (Segmentierung) Ansätze entwickelt worden, die in der Regel entweder dichte oder Gradienten-basierten 8-10 sind. Diese Verfahren sind in der Regel Segment das gesamte Volumen unabhängig davon, welche Bereiche oder Funktionen sind von Interesse für die Experten, auch wenn einige neuere Methoden können eine bestimmte Funktion von Interesse gezielt wie Aktinfilamente 11. Darüber hinaus können die Programme ausführt automatisierte Segmentierung manchmal bei der Herstellung einer großen Anzahl von Untervolumina zur Folge (beispielsweise bei der Anwendung Wende immersion Segmentierung), die oft müssen manuell wieder in, die das ganze Merkmal von Interesse oder weitere Segmentierung unterzogen werden zusammengeführt werden. Dies gilt insbesondere für komplexe und füllten Datensätze wahr, wodurch die meisten Rendering-Computer-Algorithmen können nicht nur die Eigenschaften von Interesse mit Treue und erhebliche Anstrengungen curation von einem Experten zu extrahieren sind oft erforderlich, um eine gewünschte segmentierten Volumen herzustellen. Darüber hinaus kundenspezifische Lösungen für eine hochspezifische Problem werden oft als eine wissenschaftliche Tagung Papier ohne Wert darauf gelegt, sie breiten veröffentlicht, mit wenig und umfassende Werkzeuge für die Forschung zugänglich, die nicht über intime Kenntnisse der Mathematik, der Informatik und / oder Computergrafik. Eine kundengerechte Programmierung Software-Umgebung, die eine Reihe von Bildanalyse-Bibliotheken, kann ein leistungsfähiges Werkzeug-Set ermöglicht es Benutzern, ihre eigenen Module effizient zu schreiben für eine genaue Segmentierung sein. Allerdings erfordert dieser Ansatz extensive Ausbildung und einen Hintergrund in der Informatik, um die Vorteile seiner vielen Funktionen oder Fähigkeiten für die Bildanalyse zu nehmen. Man kann in so einem vielseitigen Software-Umgebung für bestimmte Datensätze, wo die Funktionen sind mehr spärlich, zB arbeiten, durch den Einsatz leistungsfähiger Form-basierte Ansätze, die auf die einzigartige Geometrie der &quot;Vorlagen&quot;, um Objekte von Interesse aus ihrer Umgebung zu trennen 12,13 vertrauen . Eine faire Vielzahl von Computer-Grafiken Visualisierungspakete existieren für interaktive manuelle Segmentierung und Modellbau. Einige Pakete sind im Handel erhältlich, während andere akademische Herkunft und kostenlos verteilt, wie zum Beispiel: University of California San Francisco Chimera 14, University of Colorado IMOD 15, und der University of Texas in Austin 16 VolumeRover. Doch die Vielzahl und Komplexität der Funktionen und Möglichkeiten diese Programme besitzen steiler die Lernkurve für each. Bestimmte Visualisierungsprogramme bieten eine einfache geometrische Modelle, wie Bälle und Stöcke in verschiedenen Größen, die um ein vereinfachtes Modell der komplexen 3D-Volumen zu erstellen in die Dichtekarten platziert werden können. Diese Modelle erlauben dann einfache geometrische und Volumenmessungen und damit mehr als nur der &quot;schönes Bild&quot; zu gehen. Solche manuellen Verfolgung von Objekten funktioniert gut für Volumen, wo nur eine kleine Anzahl von Objekten, die verfolgt und extrahiert werden müssen. Die jüngste Entwicklung von großen Volumen 3D ultra Imaging jeweils mit fokussiertem Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) 17-20 oder serielle Blockfläche Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) 21 stellt jedoch die zusätzliche Komplikation, die die Größe der 3D-Daten Gruppen können von Gigabyte auf Dutzende und Hunderte von Gigabytes, Terabytes und sogar die reichen. Daher sind solche großen 3D-Volumen praktisch unzugänglich Handmerkmalsextraktion und damit effiziente benutzergeführte halbautomatischen Leistungure-Extraktion wird einer der Engpässe für die effiziente Analyse von 3D-Volumen in absehbarer Zukunft sein. Präsentiert hier sind vier verschiedene Segmentierungsansätze, die routinemäßig auf einer großen Palette von biologischen Bildtypen verwendet werden. Diese Verfahren werden dann auf ihre Wirksamkeit bei verschiedenen Arten von Datensätzen verglichen werden, so dass eine Zusammenstellung in einer Führung um Biologen entscheiden, was die beste Segmentierung Ansatz zur wirksamen Merkmalsextraktion ihrer eigenen Daten sein. So detailliert Benutzerhandbücher sind für die meisten der beschriebenen Programme zur Verfügung, ist das Ziel nicht zu potenziellen Nutzern vertraut mit einer dieser besonderen Pakete zu machen. Stattdessen ist das Ziel, die jeweiligen Stärken und Schwächen dieser verschiedenen Segmentierungsstrategien indem sie beispielsweise auf sechs Datensätze mit unterschiedlichen Eigenschaften aufweisen. Durch diesen Vergleich wird eine Reihe von Kriterien entwickelt worden, die entweder auf den Zielbildeigenschaften der Basis von3D-Datensätzen, wie beispielsweise Daten dagegen Knusprigkeit Gedrängt und Komplexität oder entstammen subjektive Erwägungen, wie der gewünschten Ziels für die Segmentierung, Morphologien der Merkmale segmentiert werden, Populationsdichte der Merkmale von Interesse, das heißt die Fraktion das Volumen durch das Merkmal von Interesse ist, und wie geht man optimal mit endlichen Ressourcen wie Zeit und Verfügbarkeit von Personal besetzt. Diese verschiedenen Datensätzen Beispiel veranschaulichen, wie diese objektiven und subjektiven Kriterien können sequentiell in einer Vielzahl von Kombinationen eingesetzt werden, um eine Kopplung von bestimmten Merkmalsextraktion Ansätze mit bestimmten Typen von Datensätzen zu erhalten. Die angegebenen wird hoffentlich helfen Anfängern Empfehlungen mit einer großen Vielzahl von Segmentierungsoptionen konfrontiert das wirksamste Segmentierungsansatz für ihre eigenen 3D-Volumen. Während der Schwerpunkt der Arbeit ist die Merkmalsextraktion, die Aufmerksamkeit auf die Datenerfassung und Vorverarbeitung Daten ist entscheidend für die effiziente segmentation. Oft Färbung der Proben können ungleichmäßig sein, und daher sollten potenzielle Färbung Artefakte in der Segmentierung Verfahren berücksichtigt werden. Jedoch gibt Fleck gewöhnlich höher Signal-Rauschen und erfordert daher weniger Filterung und andere mathematische Behandlung der Zellvolumina, die eventuell auch in Artefakten führen kann. Die jeweiligen RAW-Bilddatensätze müssen an den richtigen Kontrast und Kamerapixel Einstellungen erworben werden, ausgerichtet und in eine rekonstruierte 3D-Volumen. Für Tomogramme werden typischerweise ausgerichteten Bilder rekonstruiert gewichtete Rückprojektion, und der Datensatz wird normalerweise Rauschunterdrückungsalgorithmen wie nichtlineare anisotrope Diffusion 22, bilaterale Filter 23 oder rekursiven Medianfilterung 24 unterzogen. FIB-SEM und SBF-SEM Bilddaten werden von Kreuzkorrelation aufeinander folgenden Scheiben in XY nutzen Programme wie ImageJ 25 ausgerichtet ist. Kontrastverstärkung und Filterung angewendet werden, um die Eigenschaften zu steigernZinsen und damit zu de-Rauschen des Bildstapels. Filterung kann entweder auf das gesamte Volumen vor der Selektion oder der ausgewählten Untervolumina Untervolumen durchgeführt werden, als Filter Ansätze rechenintensiv sein. Downsampling der Daten (Binning), die manchmal zur Lärmminderung und / oder Reduzierung der Dateigröße verwendet wird, ist nur zu empfehlen, wenn die Daten wurde erheblich im Vergleich zu der erwarteten Auflösung überabgetastetes. Nach Lärmminderung, können die bearbeiteten Bilder dann durch verschiedene Methoden segmentiert werden, und der Fokus in dieser Studie ist auf der folgenden vier: (1) Hand abstrahierten Modellgeneration durch die Erstellung einer Kugel-Stab-Modell, (2) Handverfolgung von interessierenden Merkmalen, (3) automatisierte Schwelle basierte Dichte, und (4) maßgeschneiderte automatisierte Segmentierung über ein Skript für projektspezifische Segmentierung. Grenze Segmentierung 8 und immersive Wasserscheide Segmentierung 10 gibt bessere Alternativen zu einfachen Schwellen, aber the der gleichen Kategorie gehören und die nicht explizit in dieser Diskussion einbezogen. Manuelle Rückverfolgung von Dichten erfordert skizziert die Eigenschaften von Interesse, in Scheiben schneiden-by-Scheibe, die die Beibehaltung der ursprünglichen Dichte des jeweiligen Teilbereichen Zell kann. Dieser Ansatz ermöglicht eine maximale Kontrolle über das Segmentierungsverfahren, aber ist ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess. Automatisierte Schwellenbasis (und verwandte) Dichte Segmentierungsansätze sind halbautomatisch, wobei ein Algorithmus wählt Pixel, basierend auf einem Satz von benutzerdefinierten Parametern. Mehrere akademische (kostenlos) Visualisierungspakete wie UCSF Chimera, IMOD, Fidschi 26 und VolumeRover zur Verfügung stehen, als auch kommerzielle (bezahlte Lizenzen erforderlich) Pakete und beide Arten enthalten in der Regel eine oder mehrere dieser Segmentierungsansätze. Die in dieser Arbeit werden die verschiedenen Methoden zu veranschaulichen Software-Pakete beinhalten sowohl kommerzielle Programme und akademischen Open source Programme zur manuellen Erzeugung eines abstrakten Modells, sowie die manuelle und automatische Dichte Segmentierung. Allerdings kann Open-Source-Software manchmal bieten erweiterte Optionen durch die Möglichkeit der Anpassung. Ein Vergleich dieser Techniken mit verschiedenen Arten von Datensätzen führte zu der folgenden Darstellung von Regeln und Hinweise, wie die Segmentierung der verschiedenen biologischen Daten 3D-Volumen, die unseres Wissens bisher noch nicht veröffentlicht worden zu nähern. Somit ist das erste systematischen Vergleich der verschiedenen Ansätze und ihre Nützlichkeit auf Datensätze mit unterschiedlichen Eigenschaften für Benutzer mit unterschiedlichen Zielen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

Moderner 3D-Elektronenmikroskopie Ansätze seit kurzem die beispiellosen Einblick in die 3D ultra Organisation von Zellen und Geweben, wodurch die Visualisierung großer makromolekularer Maschinen, wie Haftkomplexe, sowie Strukturen höherer Ordnung, wie das Zytoskelett und Zellorganellen in ihrer jeweiligen Zell-und Gewebe Kontext. Angesichts der inhärenten Komplexität der zellulären Volumen, ist es wichtig, zuerst extrahieren Sie die Merkmale von Interesse, um die Visualisierung, Quantifizierung und damit Verständnis für ihre 3D-Organisation ermöglichen. Jeder Datensatz wird durch verschiedene Merkmale, beispielsweise Signal-zu-Rausch-Verhältnis, Frische (Schärfe) der Daten definiert, die Heterogenität der seine Funktionen, Gedränge von Funktionen, Vorhandensein oder Fehlen von charakteristischen Formen, die für eine einfache Identifizierung zu ermöglichen, und der Prozentsatz des gesamten Volumens, das eine spezifische Region von Interesse befindet. Alle diese Eigenschaften zu berücksichtigenbei der Entscheidung über die zu nähern, um für die Segmentierung zu nehmen. Die sechs verschiedenen 3D ultra Datensätze vorgestellt wurden von drei verschiedenen Bildgebungs erhalten nähert: Harz eingebettet Buntelektronentomographie, fokussierten Ionen Strahl-und Serienblock Face-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM, SBF-SEM) leicht fleckig und stark gefärbte Proben sind. Aus diesen Datensätzen wurden vier verschiedene Segmentierungsansätze angewendet: (1) vollständig manuellen Modellbau folgte allein durch Visualisierung des Modells, (2) Handverfolgung Segmentierung der Daten, gefolgt von Oberflächendarstellung, (3) halbautomatische Ansätze verfolgt durch Surface-Rendering, oder (4) automatisiert maßgeschneiderten Segmentierungsalgorithmen, gefolgt von Oberflächendarstellung und quantitative Analyse. Je nach Kombination der Datensatz Eigenschaften wurde festgestellt, dass typischerweise eine dieser vier kategorische Ansätze übertrifft die anderen, aber abhängig von der exakten Sequenz von Kriterien, More als ein Ansatz erfolgreich sein kann. Basierend auf diesen Daten schlagen wir eine Triage System, das sowohl objektive Daten-Set Merkmale und subjektive persönliche Kriterien für die Analyse der verschiedenen Datensätze kategorisiert.

Watch this Scientific Journal Video about From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data at JoVE.com

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Der Engpass für Mobil 3D-Elektronenmikroskopie ist die Merkmalsextraktion (Segmentierung) in hochkomplexen 3D-Dichtekarten. Wir haben eine Reihe von Kriterien, die den Orientierungsrahmen in Bezug auf die Segmentierungsansatz (manuell, halbautomatisch oder automatisch) ist am besten geeignet für verschiedene Datentypen entwickelt, so dass ein Ausgangspunkt für eine effektive Segmentierung.

Von Voxel zu Wissen: ein praktischer Leitfaden für die Segmentierung der Elektronenmikroskopie Komplexe 3D-Daten

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Aufrufe.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  Der Engpass für Mobil 3D-Elektronenmikroskopie ist die Merkmalsextraktion (Segmentierung) in hochkomplexen 3D-Dichtekarten. Wir haben eine Reihe von Kriterien, die den Orientierungsrahmen in Bezug auf die Segmentierungsansatz (manuell, halbautomatisch oder automatisch) ist am besten geeignet für verschiedene Datentypen entwickelt, so dass ein Ausgangspunkt für eine effektive Segmentierung. 

Serie: From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Eine Anleitung zu einem stark geneigten bauen fegte Fliese Mikroskop für erweiterte Sichtfeld der Einzelmolekül-Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...