Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie bietet einen beispiellosen Blick auf dreidimensionale Gewebe-Ultrastrukturen und kann eine Vielzahl von Fragen beantworten, die bisher unmöglich oder äußerst schwierig zu beantworten waren. Diese Technik ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Produktion dreidimensionaler Datensätze mit minimaler Gewebeaufladung und Artefakten. Und vor allem ermöglicht es die automatisierte Erfassung von Tausenden von Bildern täglich.
Die Standard-Transmissionselektronenmikroskopie bietet eine hervorragende zelluläre Ultrastruktur. Diesen Bildern fehlt jedoch ein dreidimensionaler Kontext und sie können schwer zu interpretieren sein. Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie liefert diesen dreidimensionalen Kontext, der die Interpretation komplexer Prozesse ermöglicht.
Während dieses Protokoll zuverlässig und reproduzierbar ist, erfordern bestimmte Schritte Präzision und sind für den Erfolg dieser Methodik von entscheidender Bedeutung. Dieses Video zeigt diese kritischen Schritte im Detail. Nach der Fixierung der Proben in 0,1 molaren Natriumcodylatpuffer, der 2,5% Glutaraldehyd und zwei millimolares Calciumchlorid enthält, sollten die Proben in Blöcke geschnitten werden, die nicht größer als zwei Millimeter sind, gewürfelt und mit 0,1 molaren Natriumkacodylatpuffer gewaschen werden, der zwei millimolares Calciumchlorid enthält.
Das Gewebe wird dann nacheinander mit Osmiumferrocyanid, Thiocarbohydrazid und Osmiumtetroxid gefärbt. Nach der Osmiumtetroxid-Inkubation das Gewebe über Nacht mit 1% wässrigem Uranylacetat bei vier Grad Celsius behandeln. Am nächsten Morgen lösen Sie 0,066 Gramm Bleinitrat in 10 Millilitern 0,03 molarer Asparaginsäurelösung und verwenden sie ein normales Kaliumhydroxid, um den pH-Wert der Walton-Bleiaspartatlösung auf 5,5 einzustellen.
Nachdem Sie die Lösung im Ofen erwärmt haben, waschen Sie das Gewebe fünfmal für drei Minuten pro Wäsche bei Raumtemperatur, doppelt destilliertes Wasser, bevor Sie das Gewebe für 30 Minuten bei 60 Grad Celsius in eine 60 Grad Celsius warme Walton-Bleiaspartatlösung für 30 Minuten bei 60 Grad Celsius überführen. Am Ende der Inkubation das Gewebe waschen und in einer aufsteigenden, eiskalten Acetonserie dehydrieren, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in Aceton bei Raumtemperatur. Dann legen Sie das Gewebe in einem Verhältnis von 1: 3 von hartgemischten Harz in Aceton für vier Stunden Infiltration auf einer rotierenden Plattform, gefolgt von einer achtstündigen oder nächtlichen Infiltration in einem 1: 1-Verhältnis von Harz zu Acetonlösung auf einer rotierenden Plattform, dann eine Nachtinfiltration in einem 3: 1-Verhältnis von Harz zu Aceton auf der rotierenden Plattform.
Am nächsten Morgen infiltrieren Sie das Gewebe in frischem 100% Harz für eine vier- bis achtstündige, eine über Nacht und eine vierstündige Infiltration bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform. Verwenden Sie am nächsten Morgen einen Holzstab, um eine kleine Menge Harz mit Rußpulver zu mischen, bis das Harz mit dem Pulver gesättigt ist, aber immer noch flüssig ist und nicht körnig wird. Die Residenz sollte dicker Tinte ähneln und in der Lage sein, langsam ohne sichtbare Klumpen zu tropfen Legen Sie die Gewebeprobe in eine Silikonkautschukform und nehmen Sie ein Bild für eine spätere Referenz der Probenorientierung innerhalb des Harzblocks auf.
Wenn die Probe an Ort und Stelle ist, bedecken Sie das Gewebe mit dem rußgesättigten Harz an der Spitze der Silikonform, wobei das Etikett die experimentellen und Gewebedetails in der Form am gegenüberliegenden Ende des Harzes anzeigt. Dann legen Sie die Form für etwa eine Stunde in einen 65-Grad-Celsius-Ofen mit einer Steigung. Wenn das mit Ruß angereicherte Harz ausreichend ausgehärtet ist, entfernen Sie die Form aus dem Ofen und füllen Sie den Rest der Form mit klarem Harz, wobei Sie darauf achten, dass das Etikett sichtbar bleibt.
Wenn die Probe mit klarem Harz bedeckt wurde, legen Sie die Silikonform für 48 Stunden wieder in den 65-Grad-Celsius-Ofen, nicht auf einer Steigung, und entfernen Sie dann die Form. Um den Block für die Bildgebung vorzubereiten, legen Sie die in Harz eingebettete Probe auf ein Mikrotomfutter, wobei das konische Ende etwa fünf bis sechs Millimeter aus dem Futter herausklebt. Verriegeln Sie die Probe mit der Stellschraube an Ort und Stelle und legen Sie die Probe unter eine Wärmelampe.
Nach einigen Minuten legen Sie das Futter in einen Stereomikroskophalter und verwenden Sie eine neue, zweischneidige Rasierklinge, um dünne Abschnitte parallel zur Blockfläche zu machen, bis das Gewebe sichtbar ist, das im Vergleich zu den Teilen des Harzes, die ohne Gewebe sind, weniger reflektierend und körnig ist. Befestigen Sie einen Aluminiumprobenstift im Trimmstifthalter und machen Sie mehrere tiefe, kreuz und quer verlaufende Kratzer in der Vorderseite des Stifts, um eine größere Oberfläche für den Klebstoff zu schaffen, der zum Halten der Probe an Ort und Stelle verwendet wird. Legen Sie die Probe unter eine Wärmelampe und drücken Sie den Rasierer ein bis zwei Millimeter direkt in den Harzblock, bevor Sie einen zweiten, senkrechten Schnitt gleicher Tiefe in den Block machen, um das überschüssige Harz von der Gewebeprobe wegzuschneiden, so dass der Block etwa drei Millimeter durchmessern und zwei bis drei Millimeter hoch ist.
Erwärmen Sie nach diesem ersten Trimmen den Block erneut unter der Wärmelampe und schneiden Sie mit einer neuen, zweischneidigen Rasierklinge die Oberseite des Harzblocks etwa einen Millimeter unter dem beschnittenen Teil in einem einzigen, glatten Schnitt ab. Legen Sie den Trimmstifthalter, der den geschnittenen Aluminiumstift enthält, in die Stereomikroskopbuchse und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf die Stiftfläche auf, so dass er den Stift vollständig bedeckt, ohne einen sichtbaren Meniskus zu bilden. Verwenden Sie eine Pinzette, um das getrimmte Stück Gewebeblock für einige Sekunden auf die Mitte der Probenstiftfläche zu drücken, und lassen Sie den Kleber einige Minuten einwirken.
Wenn der Kleber gründlich getrocknet ist, lokalisieren Sie das Gewebe auf dem erhöhten Teil des Harzblocks und schneiden Sie den erhöhten Teil des Harzes, der die Gewebeprobe enthält, mit einem zweischneidigen Rasierer auf eine Fläche von nicht mehr als einem Quadratmillimeter. Entfernen Sie langsam und vorsichtig so viel überschüssiges Harz wie möglich, lassen Sie den Block in einer Dimension etwas länger und verwenden Sie eine endgültige Metallfeile, um das überschüssige Harz in dem Bereich außerhalb des erhöhten Teils, der die Gewebeprobe enthält, zum Rand des Stifts zu winkeln. Entfernen Sie Harzpartikel und Staub aus der vorbereiteten Probe, bevor Sie eine dünne Schicht Silberfarbe und Goldsputtern auf die gesamte Probenblockoberfläche auftragen.
Schneiden Sie nach der Beschichtung überschüssige Silberfarbe von den Blockflächen ab und legen Sie den montierten und beschnittenen Block in das bauchige Ende eines maßgeschneiderten Transferpipettenrohrs mit dem entsprechenden Etikett. Mit Hilfe der SBF-SEM-Bildgebung wurde ein Netzwerk von elastinfreien Mikrofibrillenbündeln in der erwachsenen Maushornhaut identifiziert. Dieses Netzwerk ist in verschiedenen Schichten organisiert, wobei die Fasern eng mit Keratozyten verbunden sind und sogar in flachen Invaginationen auf der Keratozytenoberfläche liegen.
Die Anwendung dieses Protokolls hat zur Entdeckung einer bisher unbekannten Population zentraler Hornhautnerven geführt, die mit basalen Epithelzellen an der Stroma-Epithel-Grenze verschmelzen. Die SBF-SEM-Bildgebung der zentralen Hornhaut zeigt das Vorhandensein von limbalen Vaskulaturen, Nervenbündeln und zugehörigen Zellen, die für die 3D-Rekonstruktion manuell segmentiert werden können. Einige Fallstricke dieses bildgebenden Verfahrens sind die Verwendung einer zu langen Pixelverweilzeit, die dazu führen kann, dass nachfolgende Bilder wellig und verzerrt sind, kleine Entladungen von Elektronen aus der Blockfläche, die zu schnellen Kontraständerungen der Linien führen, Messerkratzer auf der Blockfläche aufgrund eines beschädigten Messers oder Ablagerungen am Rand des Messers Artefakte aus einem ausgedehnten Elektronenstrahl konzentrieren sich auf die Blockfläche, während sich die Probe noch in der Bildgebungskammer befindet, unsachgemäße Gewebefixierung, die zur Trennung von Zellstrukturen und Bindegewebe führt, und Bildüberspringen als Folge einer großen Menge an Aufladung innerhalb des Gewebes oder Harzblocks.
Beim Schneiden des Gewebeblocks ist es wichtig, ein gutes Verständnis dafür zu haben, wo sich das Gewebe innerhalb des Blocks befindet, um nicht versehentlich wichtige Probenregionen wegzuschneiden. Wenn höher aufgelöste Bilder bestimmter zellulärer Strukturen oder Wechselwirkungen gewünscht werden, kann die Bildgebung gestoppt, der Block aus dem Mikroskop entfernt und Abschnitte auf einem Ultramikrotom geschnitten werden, wo sie in einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet werden können Die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie ermöglicht eine völlig einzigartige Sicht auf biologische Gewebe. Mit diesem Protokoll konnten wir schnell qualitativ hochwertige Datensätze erfassen und die Palette der Gewebe, die wir erforschen können, erweitern.
