Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Informationen auf dem Gebiet der Onkologie bereitzustellen, wie die Identifizierung von vermeintlichen Zielgenen und pathogenen Mechanismen, um potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man die Wechselwirkung von NFAT2 und anderen Transkriptionsfaktoren mit bekannten und neuartigen Zielgenen erkennen kann. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil optimale Fixierungs- und Scherbedingungen schwer zu etablieren sind.
Zu beginnen, füllen Sie eine 1,5-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter 37%Formaldehyd. Dann füllen Sie eine weitere 1,5-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter 1,25 Molarenglycin in einem Fünf-Milliliter-Rohr mit vier Milliliter PBS. Nach der Stimulation der Zellen drehen die Zellen nach dem Textprotokoll, und setzen die Zellen in 500 Mikroliter PBS wieder auf und legen die Röhre in eine eisgefüllte Box.
13,5 Mikroliter 37%Formaldehyd zu den Zellen geben und durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Dann die Suspension bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 57 Mikroliter 1,25 Molarglycin hinzufügen, um die Fixierung zu stoppen.
Und lassen Sie die Suspension bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren. Unmittelbar nach der Inkubationszeit die Zellen auf Eis legen und die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Dann den Überstand ansaugen.
Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter eiskaltem PBS bei 200 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in fünf Milliliter Lyse puffern sie durch Pipettieren nach oben und unten. Dann legen Sie die Proben auf Eis und bebrüten sie mit Schütteln für 10 Minuten.
Danach zentrieren Sie die Rohre bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen. Homogenisieren Sie die Zellen in fünf Milliliter Lyse Puffer zwei und Pipette nach oben und unten zu mischen.
Dann inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 10 Minuten mit Schütteln. Zentrifugieren Sie die Rohre nach der Inkubationszeit fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 500 mal G, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in Scherpuffer eins mit 1X Protease-Hemmer wieder auf.
Dann die Zellsuspension auf Eis für 10 Minuten inkubieren. Übertragen Sie 140 Mikroliter der Zellsuspension auf Beschallungsrohre, die darauf achten, luftblasen zu vermeiden. Die Rohre bei sieben Grad Celsius in einen fokussierten Ultraschallgerät geben und 10 bis sieben und eineinhalb Minuten scheren.
Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 15, 700 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Rohr. Bereiten Sie zunächst 20 Mikroliter Protein A-beschichtete Perlen für jeden Niederschlag in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor.
Lassen Sie die Perlen für eine Minute auf einem magnetischen Rack absetzen und entfernen Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Perlen mit 40 Mikroliter 1X Chip Puffer eins für jeden 20 Mikroliter Protein A-beschichtete Perlen durch Pipettieren nach oben und unten. Lassen Sie die Perlen für eine Minute auf einem magnetischen Rack absetzen und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch dreimal, bevor Sie die Perlen in ihrem ursprünglichen Volumen von 1X chIP-Puffer eins wieder aufhängen. Fügen Sie BSA-Protease-Inhibitor, 5X chIP-Puffer und ChIP-seq-Wasser zu den Perlen hinzu. Als nächstes fügen Sie das geergelten Chromatin hinzu.
Verwenden Sie 10 Mikrogramm Anti-NFAT2-Antikörper, um NFAT2 zu erfassen, und 2,5 Mikrogramm IgG-Antikörper als Kontrolle. Inkubieren Sie die Mischungen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rad, das sich bei sechs Umdrehungen pro Minute dreht. Am nächsten Tag drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7.000 Mal G und inkubieren sie auf dem magnetischen Rack für eine Minute.
Dann den Überstand ansaugen und die Perlen einmal mit den Waschpuffern eins, zwei, drei und vier hintereinander waschen. Drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7000 mal G, bevor Sie die Rohre auf dem magnetischen Rack für eine Minute inkubieren. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie den nächsten Waschpuffer hinzu.
Nach der letzten Wäsche, drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7000 mal G.Inkubieren Sie die Rohre auf dem magnetischen Rack für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und nehmen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Elutionspuffer ein. Dann die Rohre auf dem rotierenden Rad für 30 Minuten inkubieren.
Als nächstes drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute auf ein magnetisches Rack. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr und fügen Sie vier Mikroliter Elutionspuffer zwei hinzu. Um die Eingangssteuerung zu erzeugen, mischen Sie einen Mikroliter des erhabenen Chromatins mit 99 MikroliterN Elutionspuffer ein und vier Mikroliter Elutionspuffer zwei.
Dann die Proben für vier Stunden bei 65 Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Danach 100 Mikroliter 100%Isopropanol in die Röhrchen geben. Wirbel und drehen Sie die Proben für fünf Sekunden bei 7000 mal G.Dann fügen Sie 10 Mikroliter Magnetperlen zu jeder Probe.
Wirbel und inkubieren Sie die Proben auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für eine Stunde. Als nächstes drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute auf ein magnetisches Rack. Den Überstand ansaugen und die Perlen in 100 Mikroliter Waschpuffer eins wieder aufhängen.
Invertieren Sie die Rohre, um sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur zu mischen und zu inkubieren. Als nächstes zentrieren Sie die Rohre kurz. Legen Sie sie für eine Minute in ein magnetisches Rack und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.
Dann 100 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen. Invertieren Sie die Rohre, um sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur zu mischen und zu inkubieren. Danach die Rohre kurz zentrifugieren und eine Minute lang in ein Magnetgestell legen.
Entfernen Sie den Waschpuffer zwei über Aspiration und setzen Sie die Perlen in 55 Mikroliter Elutionspuffer wieder auf. Um die gefällte DNA zu entblühen, inkubieren die Proben in einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute in ein magnetisches Rack.
Schließlich übertragen Sie den Überstand auf neue 1,5-Milliliter-Röhren. Dieses Protokoll wurde zuerst mit Jurkat-Zellen durchgeführt, die LCK als potenzielles NFAT2-Ziel analysieren. Wie hier gezeigt, wurden optimale Ergebnisse durch signifikante Anreicherung der IL-2-Positivkontrolle und LCK-DNA dokumentiert.
SuboptimaleScherung oder fehlende Fixierung kann zu schlechter DNA-Qualität führen. Schließlich wurde dieses Protokoll mit primären menschlichen CLL-Zellen mit CD40L als Positivkontrolle und LCK als experimentelles Ziel durchgeführt. Wie die starke Anreicherung der LCK-DNA zeigt, ist LCK ein direktes NFAT2-Ziel in primären menschlichen CLL-Zellen.
Unzureichendes Scheren, was zu schlechter DNA-Qualität führt, kann suboptimale Ergebnisse liefern. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Fixations- und Beschallungsschritte entscheidend für den Erfolg dieser Methode sind und möglicherweise an die analysierten Zellen angepasst werden müssen.
