Diese Studie wurde von NIH R37 R01 DK57284 DK54824 und Zuschüsse an LB unterstützt

Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der IACUC Ausschuss an der Universität von Pittsburgh genehmigt. 1. Lösungen <ol><li> Vorbereitung Krebs-Lösung nach der Rezeptur. Zusammensetzung in mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1,9, MgSO 4 1,2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, Glucose 11,7. </li><li> Belüften Krebs mit 95% O 2, 5% CO 2 und legen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad auf während des Experiments verwendet werden. Beiseite stellen ~ 200 ml belüftete Krebs-Lösung bei Raumtemperatur bis zur Gewebe Präparation verwendet werden. </li><li> Messen pH-Wert (~ 7,4) und Osmolarität (~ 300 mOsm) von belüfteten Krebs. </li></ol> 2. Versuchsaufbau (Schematische Abbildung 1A) <ol><li> Füllen belüfteten (95% O 2, 5% CO 2) Kammer mit 10 ml Krebs. </li><li> Starten Sie die Umwälzpumpe, um die Kammern auf 37 ° C erwärmen; schalten Sie die notwendige Ausrüstung: Verstärker (n), Stimulator (s) und Aufnahme-Software. </li><li> Kalibrieren Wandler mit einer 1-g-Gewicht. </li></ol> 3. Gewebe (1B) Entfernen Sie die Blase von einem erwachsenen weiblichen Sprague Dawley naiven Ratte (200-250 g; ~ 10-12 Wochen alt) die folgenden Schritte: <ol><li> Bereiten Dissektion Bereich und notwendigen Instrumente: Rasierer, Pinzette mit Zähnen, Skalpell, Schere seziert, Mikroschere, zwei Pinzette (Autoren bevorzugen Dumont Pinzette # 3), Gewebe-Clips (oder Seidennaht), eine Sylgard beschichtet Dissektion Gericht mit Krebs und Gewebedissektion Pins. </li><li> Betäuben das Tier mit Isofluran Inhalation (4% in O 2) in der Ansaugkammer. Verwenden Tier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Das Niveau der Narkose kontinuierlich zu überwachen durch die Beobachtung der Atemfrequenz, Reaktion auf äußere Reize, und der Verlust der hinteren Extremität Reflex zurücktreten. </li><li> Wenn das Tier betäubt Rasur der unteren Bauch einrea. Setzen die Beckenorgane über eine Mittellinie Bauchschnitt. Identifizieren Sie die Blase und Harnröhre. Entfernen Sie die Blase durch Schneiden an der Blasenhals in der Nähe von proximalen Harnröhre. Zeigen Gewebe sofort in der Sylgard beschichtet Gericht mit belüfteten Krebs-Lösung gefüllt. </li><li> Falls nötig, entfernen Sie zusätzliche Gewebe zu dieser Zeit: Harnröhre, Stücke von Magen-Darm-Trakt (GI) und / oder der Prostata, usw. </li><li> Zu opfern, das Tier mit IACUC zugelassenen Methoden (zB Narkosedosierung oder CO 2 Ersticken, gefolgt von einem sekundären Methode). </li><li> Präparieren von Gewebe Stifte einfügen durch die Blasenkuppel, Hals, und der Harnleiter, um das Gewebe für die weitere Präparation zu stabilisieren. Sie das Gewebe nicht zu dehnen. Entfernen Sie Fett, Bindegewebe, proximalen Harnröhre, Harnleiter und, falls vorhanden. </li><li> Öffnen Sie die Blase von der Basis bis zur Kuppel ein Flachblatt zu erstellen, Serosaseite down / up luminalen Seite (Abbildung 1B). Platzieren Sezieren Stifte an jeder Ecke des Gewebes. Blase entfernen dome und Halsgewebe. </li><li> Wenn der Zweck des Experiments ist es, den Beitrag der Schleimhaut (Urothel und Lamina propria - siehe Diagramm 1C) zu bestimmen, um die Kontraktion der glatten Muskulatur, vergleichen Sie die Eigenschaften der Detrusorstreifen mit und ohne die Schleimhaut befestigt. Dazu vor dem Schneiden des Gewebes in Streifen, entfernen Sie vorsichtig die Schleimhautschicht mit Iris Frühling Schere und feinen Pinzette unter einem Binokular. Am Ende des Experiments, fixieren die Streifen für H &amp; E-Färbung, um die vollständige Entfernung der Schleimhaut zu bestätigen. Beachten Sie, dass diese Prozedur in der Maus Blase einfacher als im Rattenblase. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe längs von der Basis bis Kuppel in Streifen von ca. 2 x 8 mm (Abbildung 1B). Krawatte oder fügen Sie eine Gewebeclip an beiden Enden jedes Streifens. ANMERKUNG: Eine Rattenblase können in der Regel in 4 Streifen geschnitten werden, aber die Anzahl der Streifen kann zunehmen oder abnehmen, je nach dem Tier / Blasengröße. </li><li> Übertragen Sie die Streifen an der expermentellen Kammern. Befestigen Sie ein Ende jedes Streifens an einem Kraftaufnehmer, der die Gewebekontraktion misst, und die andere auf eine feste Glas / Metallstange. HINWEIS: Gewebekammern variieren in der Größe (0,2 ml bis 20 ml oder größer). Typische Kammern für Nager Blasen sind 5-20 ml, die eine ausreichende Höhe für die Streifen vollständig in Lösung eingetaucht werden kann. Einige Kammern sind mit eingebauten Stimulationselektroden, andere nicht. Es sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass alle Anschlüsse der Elektroden sind in gutem Zustand, sonst elektrische Feldstimulation ist nicht zuverlässig. </li><li> Tragen Sie eine definierte Menge an Kraft, um jeden Streifen durch vorsichtiges Dehnen der Gewebe, bis Ausgangsspannung erreicht 1 g (~ 10 mN). Zunächst wird das Gewebe dazu neigt, sich zu entspannen, die als Abnahme der Ausgangsspannung aufgezeichnet wird. Wasch Gewebe etwa alle 15 min mit dem warmen belüfteten Krebs und stellen Sie die Ausgangsspannung bis 1 g nach jeder Wäsche. Lassen Sie Gewebe für ~ 1-2 Stunden oder bis ins Gleichgewicht Basisspannung stabil ist (dh keine weiteren Gewebe Entspannung). </li><li> Test der Lebensfähigkeit von Gewebe durch Zugabe von KCl (80 mM), die direkt in das Bad für ~ 5 min oder bis zu einem Plateau Reaktion erreicht ist. Antworten auf hohe Konzentrationen von KCl kann auch während des Experiments oder am Ende des Experiments wiederholt und zum Normalisieren Reaktionen auf andere Medikamente oder zwischen den Streifen (siehe Normalisierung unter Datenanalyseabschnitt) werden. </li><li> Wasch Gewebe mehrfach (3-5x) mit dem warmen belüfteten Krebs, damit das Gewebe vor, eine Behandlungsbedingungen zurückzukehren. </li></ol> 4. Stimulationsprotokolle <ol><li> Um die Auswirkungen der Pathologie auf die spontane myogene Aktivität oder Tonus der glatten Muskulatur zu untersuchen, verwenden glatten Muskelstreifen aus verschiedenen Tiermodellen wie SCI, boo, oder Neugeborenen. Abbildung 2 veranschaulicht die Anwendung dieser Methode, um Änderungen in der Blase spontane Aktivität während der Entwicklung zu untersuchen und nach der SCI. Zusätzlich können pharmakologische Wirkstoffe zur sp modulierenontaneous Aktivität. Abbildung 3 veranschaulicht die Wirkung der KCNQ Kanalmodulatoren, Flupirtin und XE991, auf die spontane Aktivität und Tonus der glatten Muskulatur. </li><li> Pharmakologische Stimulation der glatten Muskulatur Konstrukt Konzentrations-Wirkungskurven durch Zugabe von Verbindungen aus konzentrierten Stammlösungen direkt zu dem Bad in definierten Zeitintervallen. Verwenden Drogen-und Fahrzeug in parallelen Streifen für Fahrzeug und Einmaleffekte zu berücksichtigen. <ol><li> Machen Stammlösungen der gewünschten Testverbindungen bei 1000x das endgültige Arbeitskonzentration. Für Carbachol (CCH), einer Muscarin-Rezeptor-Agonist, bereiten folgende Bestände: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Endkonzentrationen im Bad beträgt 10 -8 M bis 10 -5 M (4C, D). Für Medin B (NMB), ein Bombesin-Rezeptor-Subtyp 1-Agonisten, bereiten folgende Bestände: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M und Endkonzentrationen in dem Bad gibt 10 -11 M bis 10 -6 M. Sowohl KM und NMB werden erwartet, um Gewebe Kontraktilität erhöhen. </li><li> Für eine 10 ml Gewebe Bad, fügen Sie 10 ul jeder CCh Stammlösung, sobald die Reaktion ein Plateau (4C, D) erreicht. In parallelen Streifen hinzufügen gleiche Mengen des Fahrzeugs (Wasser). Ebenso werden 10 ul jeder Medin B Stammlösung jedes ~ 5 min. HINWEIS: Beachten Sie die erregende Wirkung von NMB und vom CCH auf der glatten Muskulatur in Streifen von verschiedenen Spezies in Abbildung 4. </li><li> Untersuchen die Eigenschaften Entspannung der glatten Muskulatur in der Vor-kontrahierten Gewebe mit einer erregenden Mittel, in der Regel CCh oder KCl. </li><li> Um eine Antwort Agonisten blockieren, Vorbehandlung des Gewebes für 10-20 min mit dem Antagonisten zu Gewebepenetration, vor der Stimulation Agonisten zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Für neuronale stimlation der glatten Muskulatur, die auch als elektrische Feldstimulation (EFS) befolgen Sie die Schritte 1 bis 3,13 und weiter wie unten beschrieben. EFS soll selektiv Nerven gegenüber der glatten Muskulatur zu aktivieren. Parameter für die Stimulation sollte sorgfältig ausgewählt werden, um direkte Stimulation der glatten Muskulatur zu vermeiden. <ol><li> Etablieren Stimulationsparameter: Art des Reizes (Einzelimpulse oder Züge), Dauer (Impulsdauer und Bahn Dauer), Frequenz und Intensität, wie in den Schritten unten beschrieben und in den Figuren 5A, B dargestellt. <ol><li> Für Einzelpuls-Stimulation, eingestellte Impulsdauer, Inter-Stimulus-Intervall und die Anzahl der gewünschten Reize. Übliche Parameter Stimulationsdauer Einzelimpulse 0,05-0,3 ms Dauer in gewünschten Intervallen (5A) geliefert. Folgen Sie Schritt für 4.3.1.4 Reizstärke. </li><li> Für Zug-Stimulation, setzen Sie den Zug Dauer und unter Zug-Intervall. Typische Werte für Blasengewebe sind 3-10 sec geliefert mindestens 1 min auseinander (5B). Wenn Gewebe Müdigkeit auftritt (dh EFS Kontraktionen während Kontrollzeitraum zu verringern), erhöhen Sie den Abstand zwischen den Zug. </li><li> Stellen Sie die Frequenz der Zug Reize (Anzahl der Impulse in einem Zug - Figur 5B). Führen Sie einen Frequenzgang reicht von 0,5 bis 50 Hz. Typische Frequenzen für Blasen sind 10-20 Hz, die reproduzierbare und stabile Kontraktionen von ATP und ACh vermittelte geben. Beachten Sie die frequenzabhängige Reaktionen auf Stimulation EFS Maus Blasenstreifen in Figur 5 zeigt, wie dieses Verfahren verwendet werden, um den Beitrag der cholinergen und purinergen Mechanismen der Neurotransmission zu bewerten. </li><li> Etablieren Intensität des Reizes: systematisch erhöhen Sie die Intensität (Spannung) des Reizes, bis die Amplitude der Kontraktion ein Plateau erreicht (wenn Züge mit halten die Frequenz konstant). </li><li> Stellen die Intensität des Reizes in Abhängigkeit von derZiel des Experiments. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu erhöhen, dann verwenden Sie submaximalen Intensität, dass die Amplitude der Kontraktion ist ~ 50% der maximalen Kontraktion. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu verringern, dann die Intensität eingestellt auf ~ 80% der maximalen Amplitude, um Gewebe Ermüdung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Sobald Stimulationsparameter (Dauer, Häufigkeit und Intensität) eingerichtet sind, erlauben ~ 20-30 min für EFS- hervorgerufenen Kontraktionen zu stabilisieren vor Drogentests. HINWEIS: (; 0,5-1 um ​​TTX) Um die Selektivität von EFS für neuronale Übertragung, Block neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin überprüfen. Dieser Schritt zu Beginn des Experiments als TTX wäscht relativ einfach. Darüber hinaus führen diese am Ende des Versuchs (siehe Schritt 4.3.5. Unten). </li><li> Die Stammlösungen bei 1,000x die letzten Arbeitskonzentrationen für: Alpha-, Beta-Methylen ATP (ABMA; eine purinergen Rezeptor-Aktivatorund Desensibilisierer) 10 -2 M, Atropin (ein Muskarin-Rezeptor-Antagonist) 10 -3 M (5C). Beachten anderen Beispielen in 6. Die 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), erhöht die Gewebekontraktionsfähigkeit und SB-203186 (3 x 10 -3 M), einem 5HT4-Rezeptor-Antagonisten, kehrt Cisaprid-Effekten. </li><li> Um die Auswirkungen der ABMA und Atropin auf EFS (5C) zu testen, führen zwei Steuerfrequenzkurven. Werden 10 ul von 10 -2 M ABMA dem Bad für eine Endkonzentration von 10 uM. Dies wird das Gewebe durch eine direkte Stimulation der Rezeptoren im purinergen die glatte Muskulatur kontrahieren. Nach der Antwort auf die Grundlinie zurück, wiederholen Frequenzkurven. Werden 10 ul 10 -3 M Atropin für eine endgültige KonzentratIonen von 1 uM. Nach ~ 10 min (für die Atropin benötigt, um Muscarinrezeptoren blockieren), wiederholen Frequenzkurven. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, Wasser, in jedem Schritt. HINWEIS: Für andere Beispiele in Abbildung 6, mit 10 ul jeder Cisaprid Stammlösung in definierten Zeitabständen (~ 15 min, siehe Diskussion), gefolgt von 10 ul SB-203186-Stammlösung direkt in die Badewanne und ihre Wirkung auf die Überwachung EFS-induzierten Kontraktion. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, DMSO. Beachten Sie die Auswirkungen von Cisaprid, ein 5HT4-Rezeptor-Agonist, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe in Abbildung 6. Zusätzlich beobachten die Wirkung von DMSO, das Fahrzeug für Cisaprid, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe . </li><li> Am Ende des EFS-Protokoll überprüfen die Selektivität des EFS durch die Blockierung neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &amp;# 181; M). Wenn TTX-resistenter Kontraktionen noch vorhanden sind, ist es empfehlenswert, die Dauer und die Intensität des Reizes in nachfolgenden Experimenten einzustellen. </li></ol></li><li> Für die Ermittlung der Auswirkungen von Drogen auf Pre-oder Post-synaptische Stellen (7A) befolgen Sie die Schritte 1 bis 4.3.2. Etablieren reproduzierbare Antworten auf Carbachol und EFS, dann fügen Medikament X. </li><li> Am Ende des Experiments, unclip oder lösen die Streifen, tupfen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Seidenpapier, um zusätzliche Flüssigkeit zu beseitigen und messen das Gewicht jeder Streifen mit einer Waage. Auch messen die Länge Gewebe mit einer Schieblehre, um die Querschnittsfläche zu bestimmen. Diese Informationen werden für die Normalisierung von Daten verwendet (siehe Abschnitt 5.4). </li></ol> 5. Datenanalyse Analyse von Daten mittels geeigneter Software (zB WinDaq, LabChart). <ol><li> Für spontane Aktivität, wählen Sie ein Fenster von mindestens 30 sec vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Antwort und mirasure Amplitude und Frequenz der myogene Aktivität (3). <ol><li> Verwenden schnelle Fourier-Transformation-Analyse, um das Spektrum von Frequenzen beitragen, Antworten kontraktil und bestimmen, ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Teilen der Blase (zB Kuppel gegen den Hals) oder mit der Entwicklung, Pathologie und Drogen 8. </li></ol></li><li> Für Wirkungen auf glatte Muskulatur Wählen Sie ein Fenster von mindestens 10-30 Sekunden vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Reaktion und messen Amplitude der Kontraktion. </li><li> Effekte auf neural hervorgerufenen Kontraktionen zu messen Amplitude, Dauer und die Fläche unter der Kurve der Kontraktionen (mindestens 3) vor und an der Spitze des medikamenteninduzierten Reaktion. HINWEIS: Es ist notwendig, sowohl die Amplitude und die Fläche unter der Kurve der EFS-induzierten Kontraktionen zu messen, da purinerger und cholinerge Komponenten unterschiedliche Kinetik. Die purinergen Komponente ist schnell und vorübergehend (ATP aktiviert purinergic ionotropen Kanäle wie P2X1, die schnell Einstrom von Calcium zu ermöglichen, dann werden sie zu desensibilisieren) und trägt so mehr zu der Peak-Amplitudengang und kleiner in der Fläche unter der Kurve. Die cholinergen Komponente ist langsamer und anhaltender (ACh aktiviert metabo Muskarinrezeptoren, die mehr Zeit benötigen, um die intrazelluläre Signalwege, die letztlich zu aktivieren Ionenkanäle, die die glatte Muskulatur depolarisieren eine Kontraktion induzieren zu aktivieren). Somit wird die muskarinischen Komponente besser durch Messen der Fläche unter der Kurve erfasst. </li><li> Normalisieren die Daten, um Ergebnisse in Streifen und pharmakologische Behandlungen zu vergleichen. Der Parameter für die Normierung gewählt sollte nicht durch die Testverbindungen beeinflusst werden, pathologischen Zustand studiert oder experimentelles Design. Unter diesen Parametern Verwendung Leiste Gewicht, Querschnittsfläche, KCl Reaktionen (4B),% der maximalen Reaktion (7B) oder% der maximalen Reaktion auf einen anderen Kontraktionsmittel(ZB CCH) oder Entspannen Mittel (zB Papaverin). </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, in vitro die Kontraktilität der glatten Muskulatur Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Anzahl von wichtigen wissenschaftlichen Fragen Blase Physiologie und Pathologie sowie der Unterstützung der Entdeckung neuer Medikamente zur Blase Dysfunktion im Zusammenhang beziehen sich auf eine einfache. Wir haben die Verwendung dieses Verfahrens zur Bewertung der Entwicklungs, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Blasenmuskulatur Kontraktilitä...

Die glatte Muskulatur der Blase entspannt, Urin Reinrichtungen und Verträge Harnausscheidung zu entlocken. Entspannung wird durch intrinsische Eigenschaften der glatten Muskulatur und Tonic Freisetzung von Noradrenalin (NE) von den sympathischen Nerven, die adrenergen Beta-Rezeptoren (β 3 AR in Menschen) in der Detrusor aktiviert vermittelt. Entleerung wird durch die Hemmung der sympathischen Eingabe und Aktivierung der parasympathischen Nerven, die ACh / ATP, um die glatte Muskulatur der Blase 1 Vertrag Veröffentlichung erreicht. Zahlreiche pathologischen Bedingungen, einschließlich Gehirn und / oder Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Diabetes, Blasenauslassobstruktion oder interstitielle Zystitis, kann zutiefst verändern Blasenfunktion, mit gravierenden Auswirkungen auf die Lebensqualität des Patienten 2. Diese Bedingungen ändern, die Kontraktilität der glatten Muskulatur durch Beeinflussung einer oder mehrerer Komponenten der Blase: die glatte Muskulatur, den afferenten und efferenten Nerven und / oderSchleimhaut. Mehrere in vivo und in vitro-Verfahren zur Blasenfunktion zu untersuchen wurden entwickelt. In vivo ist Zystometrie die primäre Messung der Blasenfunktion. Obwohl dies ein intaktes Präparat, das Sammeln von Informationen unter beinahe physiologischen Bedingungen ermöglicht, gibt es eine Reihe von Umständen, unter denen die Verwendung von glatten Muskelstreifen bevorzugt. Diese umfassen Situationen, in denen chirurgische und / oder pharmakologischen Manipulationen das Überleben und die Stabilität der Zubereitung in vivo oder beeinflussen, wenn die Untersuchungen erfordern die Verwendung des menschlichen Gewebes oder teure Chemikalien. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine Überprüfung der Wirkungen von Drogen, Alter und Pathologie von jeder Komponente der Blase, dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut-und abführenden Nerven. Blasenstreifen wurden über die Jahre von vielen Gruppen verwendet worden, um eine Reihe von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten. Sie wurden eva verwendetluate Veränderungen in myogene Spontanaktivität von Pathologie induziert. Diese Tätigkeit wird angenommen, dass auf die Dringlichkeit und Häufigkeit Symptome der überaktiven Blase (OAB) beitragen, und ist daher ein Ziel für Drogen, die für OAB 3-9 entwickelt. Blasenstreifen wurden auch verwendet, um myogene und neuronale Faktoren, die Tonus der glatten Muskulatur mit dem Ziel der Entdeckung von Ionenkanälen und / oder Rezeptoren und / oder die intrazelluläre Signalwege, die gezielte könnte entweder Relaxation oder Kontraktion der glatten Muskulatur induziert werden modulieren untersuchen 3,10- 13. Andere Studien haben sich auf die Art der Neurotransmission, einschließlich Sendern und Rezeptoren beteiligt und Änderungen Pathologie 14,15 induzierte konzentriert. Darüber hinaus ist die Methode für den Vergleich zwischen verschiedenen Arten von Gewebe 16 zwischen den Organen 18 19-21, und die Bewertung der Arzneimittel Struktur-Aktivitäts-Beziehungen 22-24 verwendet wurde. Eine Erweiterung dieser Methode wurde verwendet, um measure die Wirkung von Drogen auf die Transmitterfreisetzung aus efferenten Nerven 25. Weiterhin ist eine Vielzahl von Geweben (Blase, Harnröhre, Gastrointestinaltrakt, GI) von Tieren oder Menschen (von Operationen bzw. Organspendergewebe für Forschung anerkannt) geerntet und aus einer Vielzahl von Tiermodellen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks (SCI), Blasenausgangsobstruktion (BOO) oder interstitielle Zystitis (IC) können mit dieser Technik untersucht werden. In dieser Arbeit veranschaulichen wir die Anwendung dieses Verfahrens zusammen mit notwendigen experimentellen Protokollen mehreren vorstehend erwähnten wissenschaftlichen Fragen anzugehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Equipment</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Tissue Bath System with Reservoir</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">159920</td>
			<td style="width:180px;">isolated tissue baths</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Warm water recirculator pump</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TPZ-749</td>
			<td style="width:180px;">to keep tissue baths to 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Computer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Data Acquisiton System</td>
			<td style="width:123px;">DataQ Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DI-710-UH</td>
			<td style="width:180px;">To view, record and analyze data</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:180px;">Transducer amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Grass stimulator</td>
			<td style="width:123px;">Grass Technologies</td>
			<td>Model S88</td>
			<td style="width:180px;">Stimulator</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia System</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td>ACV-1205S</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:237px;"><a name="RANGE!A10">Anesthetizing Box</a></td>
			<td style="width:123px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">500116</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia Masks</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AC-09508</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Materials and surgical instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">sylgard</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:180px;">To pin, dissect &#38; cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td style="width:180px;">To dissect/cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:237px;">Insect Pins</td>
			<td style="width:123px;">ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td>
			<td style="width:119px;">Size 5</td>
			<td style="width:180px;">To pin tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Bench Pad</td>
			<td style="width:123px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">56617-014</td>
			<td style="width:180px;">Absorbent bench underpads</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Rat surgical Kit</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INSRATKIT</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">2 Dumont #3 Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500064</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500092</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500236</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel blade</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500239</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Professional Clipper&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">CLP-223&#160;45</td>
			<td style="width:180px;">To remove fur</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Suture Thread</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">18020-50</td>
			<td style="width:180px;">Tie tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Clips</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">158802</td>
			<td style="width:180px;">Attach tissue to rod/transducer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">1g weight</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Mettler Toledo</td>
			<td>11119525</td>
			<td style="width:180px;">For transducer calibration</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Chemicals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="170">
			<td height="170" style="height:170px;width:237px;">Krebs Solution:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium Chloride 
			Potassium Chloride 
			Monobasic Potassium Phosphate 
			Magnesium Sulfate 
			Dextrose 
			Sodium Bicarbonate 
			Calcium Chloride 
			Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Sigma 
			EMD 
			Baker</td>
			<td style="width:119px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; S7653 
			P217-500 
			P285-3 
			M65-500 
			D16-500 
			S5761 
			CX0130-2 
			2444</td>
			<td style="width:180px;">To prepare Krebs solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">029405</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">&#160;Oxygen tank</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">ox251</td>
			<td style="width:180px;">To use with anesthesia system</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">Moxn00hn36D</td>
			<td style="width:180px;">To aerate Krebs solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

Wir beschreiben ein in vitro Verfahren zur glatten Blasenmuskel-Kontraktions zu messen, und ihre Verwendung zur Untersuchung der physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Muskulatur sowie Änderungen von Pathologie induziert. Dieses Verfahren liefert wichtige Informationen für das Verständnis der Funktion der Blase unter Überwindung großen methodischen Schwierigkeiten bei in vivo-Versuchen festgestellt, wie chirurgischen und pharmakologischen Manipulationen, die Stabilität und das Überleben der Zubereitungen betreffen, die Verwendung von menschlichem Gewebe und / oder den Einsatz von teuren Chemikalien. Es bietet auch einen Weg, um die Eigenschaften der einzelnen Blasenkomponente (dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut, Nerven) bei gesunden und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Die Harnblase wird von einem narkotisierten Tier, in Krebs-Lösung gelegt und in Streifen schneiden entfernt. Streifen werden in einer Kammer mit warmem Krebs-Lösung gefüllt war. Ein Ende ist mit einem isometrischen tensio befestigtn Wandlers an Kontraktionskraft zu messen, wird das andere Ende an einem feststehenden Stab angebracht ist. Gewebe wird durch direkte Zugabe Verbindungen dem Bad oder durch die elektrischen Feldstimulationselektroden, die Nerven, ähnlich wie bei Auslösung Blasenkontraktionen in vivo aktivieren stimuliert. Wir zeigen die Anwendung dieses Verfahrens auf die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur während der Entwicklung und nach einer Versuchsrückenmarksverletzung zu bewerten, die Art der Neurotransmission (Sender und Rezeptoren beteiligt sind), Faktoren der Modulation der glatten Muskelzellen-Aktivität beteiligt ist, die Rolle der einzelnen Komponenten Blase, und Arten und Organ Unterschiede in Reaktion auf pharmakologische Mittel. Zusätzlich ist es für die Untersuchung der intrazellulären Signalwege in der Kontraktion und / oder Relaxation der glatten Muskulatur, Drogen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Auswertung der Transmitterausschüttung beteiligt sind, verwendet werden könnte. Die in-vitro-Verfahren Kontraktilität der glatten Muskulatur wurde ausgiebig genutzt for mehr als 50 Jahren und hat Daten, die wesentlich zu unserem Verständnis der Blasenfunktion sowie der pharmazeutischen Entwicklung von derzeit klinisch zur Blasenmanagement verwendeten Verbindungen beigetragen vorgesehen.

Spontane Aktivität Myogenic Spontane myogene Aktivität ist ein wichtiger glatten Muskulatur Merkmal, das ändert sich mit der postnatalen Entwicklung 6-9 und Pathologie (zB, SCI, BOO) 3-5 unterzogen. Da diese Aktivität wird angenommen, daß die Symptome der überaktiven Blase (OAB) 2 tragen, ist von großem Interesse für die Entwicklung von wirksamen Behandlungen für OAB und andere Störungen der glatten Muskulatur eine Auswertu...

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Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Dieses Manuskript stellt eine einfache, aber leistungsstarke, In-vitro-Verfahren zur Auswertung der glatten Muskulatur Kontraktilität in Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe oder Nervenstimulation. Hauptanwendungen sind Drogen-Screening und Verständnis Gewebe Physiologie, Pharmakologie und Pathologie.

Glatten Muskulatur der Blase Streifen Kontraktilität als eine Methode zur unteren Harnwege Pharmakologie Bewerten

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

bladder-smooth-muscle-strip-contractility-as-method-to-evaluate-lower

Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Dieses Manuskript stellt eine einfache, aber leistungsstarke, In-vitro-Verfahren zur Auswertung der glatten Muskulatur Kontraktilität in Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe oder Nervenstimulation. Hauptanwendungen sind Drogen-Screening und Verständnis Gewebe Physiologie, Pharmakologie und Pathologie. 

Serie: Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Maus Blasenwand Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Forschung

Medizin

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

Manuelle Muskeltests: eine Methode zur Messung Extremität Muscle Strength Applied an kritisch kranke Patienten

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Method to Measure Tone of Axial and Proximal Muscle

The control of tonic muscular activity remains poorly understood. While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance of relaxed limbs1, no systems are available to study tonic muscle control in a natural, active state of antigravity support. We have developed a device (Twister) to study tonic regulation of axial and proximal muscles during active postural maintenance (i.e. postural tone). Twister rotates axial body regions relative to each other about the vertical axis during stance, so as to twist the neck, trunk or hip regions. This twisting imposes length changes on axial muscles without changing the body's relationship to gravity. Because Twister does not provide postural support, tone must be regulated to counteract gravitational torques. We quantify this tonic regulation by the restive torque to twisting, which reflects the state of all muscles undergoing length changes, as well as by electromyography of relevant muscles. Because tone is characterized by long-lasting low-level muscle activity, tonic control is studied with slow movements that produce "tonic" changes in muscle length, without evoking fast "phasic" responses. Twister can be reconfigured to study various aspects of muscle tone, such as co-contraction, tonic modulation to postural changes, tonic interactions across body segments, as well as perceptual thresholds to slow axial rotation. Twister can also be used to provide a quantitative measurement of the effects of disease on axial and proximal postural tone and assess the efficacy of intervention.

We have developed a device (Twister) to study the regulation of tonic muscle activity during active postural maintenance. Twister measures torsional resistance and muscular responses in standing subjects during twisting of the body axis. The device can be flexibly configured to study various aspects of tonic control across the neck, trunk, and/or hips.

Methode, um Tone von Axial-und der proximalen Muskulatur messen

The control of tonic muscular activity remains poorly understood.  While abnormal tone is commonly assessed clinically by measuring the passive resistance ...

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

Probe-basierte konfokale Laser Endomikroskopie der Harnwege: Die Technik

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Harnblase Aufdehnung evozierte viszeromotorische Antworten als Modell für Bladder Pain in Mäuse

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

Kontraktilität Messungen der menschlichen Gebärmutter glatten Muskulatur um Hilfe Medikamentenentwicklung

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ion channels and electrogenic pumps that regulate Vm in disease conditions could potentially alter Vm, vascular tone, and blood flow. Thus, a basic understanding of electrophysiology and the methods necessary to accurately record Vm in healthy and diseased states are essential. This method will allow modulating Vm using different pharmacological agents to restore Vm. Although there are several methods, each with its advantages and disadvantages, this article provides protocols to record Vm from cannulated resistance vessels such as the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. Middle cerebral arteries are allowed to gain myogenic tone in a myograph chamber, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes. The Vm signal is collected through an electrometer, digitized, and analyzed. This method provides an accurate reading of the Vm of a vessel wall without damaging the cells and without changing the membrane resistance.

The primary goal of this article is to provide details of how to record membrane potential (Vm) from the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. The cannulated middle cerebral artery is equilibrated to gain myogenic tone, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes.

Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...