The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Michigan State University gegründet geführt. 1. Systemvorbereitungs und Setup <ol><li> Achten 5 l physiologischer Kochsalzlösung (PSS), die die für eine Gewebebad Kontraktion Experiment, das bis zu 50 ml Gewebebäder verwendet benötigte Menge ist; siehe Tabelle 2 PSS Rezept. Berechnen insgesamt erforderliche Volumen durch die Anzahl der Gewebebädern Badumwälzungen und anschließende Multiplikation mit der Anzahl der erforderlichen Gewebe Wäschen. <ol><li> Verwenden Sie Tabelle 2 als Leitfaden für die Herstellung von PSS. Auflösen der Salze in etwa 4 l Wasser. HINWEIS: HPLC - Typ I Wasser wird empfohlen </li><li> 8 ml 1 M CaCl 2 -Lösung (147 g / l Bei Verwendung des Dihydrat-Salz) zu der Lösung, so dass die Gesamtlösung ist 1,6 mM Calcium. </li><li> Quanten sufficit PSS Lösung auf 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Vorheizen Gewebebad System auf 37 ° C durch Einschalten der rezirkulierenden erhitztes Wasserbad. Critical Schritt: Jede Komponente des Systems ist mit Wassermantel, sicherzustellen, dass sie in Serien miteinander verbunden sind. Die Durchflussrichtung ist von entscheidender Bedeutung - dafür sorgen, dass Wasser fließt in jede Komponente auf dem niedrigsten Stacheldraht-Anschluss und bei der höchsten Stacheldraht Verbindung. </li><li> Schalten Sie Datenerfassungssystem. Macht auf den Kraftaufnehmer mindestens 15 min vor dem Experiment zu temperieren. HINWEIS: Die meisten Kraftaufnehmer beschäftigen Dehnungsmessstreifen, die empfindlich auf Temperaturschwankungen sind und eine thermische Drift zunächst nach Spannung gesetzt wird. </li><li> Starten Sie Software zur Datenerfassung und gewährleisten Zusammenhang mit Datenerfassungssystem. Bitte folgen Herstellung Anweisungen zur Aktivierung Datenaufzeichnung. </li><li> Achten Sie darauf, die Kraftaufnehmer vor Gewebe im Gewebe Bad und vor Datenaufzeichnung gestartet platziert kalibriert; follow Anweisungen des Herstellers für die Kalibrierung. </li><li> Schließen Sie das Gewebebad System zu einem 95% O 2/5% CO 2 für medizinische Zwecke Gasflasche und auf Gaslecks und dann das System drucklos. </li><li> Füllen Sie die Gewebebad Behälter mit PSS und die Lösung Zeit, um eine optimale Temperatur zu erreichen. Prime das System und entfernen Sie Luftblasen im System und Schläuche. </li><li> Prüfen Gewebebad Belüfter konsistente Lösung Belüftung, die die PSS-Puffer oxygeniert und liefert die Brownsche Bewegung, Medikamente, die im Gewebebad während des Experiments eingeführt wird verteilen gewährleisten. Stellen Sie sicher, Belüftung / Blasen nicht Gewebebewegung, die Datenaufzeichnungen stören verursachen; verringern Gasstrom nach Bedarf. HINWEIS: Die Gewebebad und Datenerfassungssystem sind nun bereit, das Experiment zu starten. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> Idealerweise sezieren Gewebe aus dem Tier unmittelbar vor der Verwendung und kann direkt into PSS. HINWEIS: Einige Gewebe können in PSS über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden, aber entsprechende Kontrollen muss getan werden, um Gewebefunktion nach längerer Lagerung zu validieren; siehe Abschnitt 6. </li><li> Verwenden Sie die Aorta als das Gewebe in dieser Übung. </li><li> Anesthetize die Ratte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts und legen Sie die Rattenrückenseite nach unten. Betäubung Bestätigen über eine Zehen Prise und dem Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 70 mg / kg Pentobarbital durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Richtlinien des Instituts für Nager Anästhesie können abweichen. </li><li> Erstellen eines Pneumothorax durch Herstellen eines Einschnitts mit einer Schere entlang der Membran an der Unterseite der Rippen. Dann setzen die Inzision von der Unterseite des Brustkorbs zum Sternum und halbieren. </li><li> Präparieren Sie weg oder legen beiseite jene Organe, die an der Spitze der Wirbelsäule sind und suchen Sie die Aorta, die direkt entlang der Wirbelsäule liegt. HINWEIS: Diese step bietet eine klare Arbeitsraum zu sezieren die Aorta. </li><li> Sever alle Verbindungen zu der Aorta; aus der Speiseröhre, der Lunge usw., und schneiden die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule in der Ebene der Membran. </li><li> Halten Sie das Aorta mit einer Pinzette und mit einer Schere die Aorta von der Wirbelsäule zu sezieren. Starten Sie die Dissektion in der unteren Membranfläche angrenzend an die Wirbelsäule und die Arbeit zum Herzen hin. Achten Sie darauf, zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um nicht ziehen oder zerren an der Aortagewebe, die das Gewebe schädigen können zu nehmen. </li><li> Unmittelbar danach die Aorta in die vorbereitete Dissektion Schale mit PSS. HINWEIS: Dissektion der Aorta in Ringe am besten in einem Seziertisch Gericht, das einen schwarzen Silastic Stiftung hat getan. Dies ermöglicht die Verwendung von Drähten, die verwendet werden können, um die Aorta kanülieren und an der Schale befestigt werden, wodurch die Stabilität während der Dissektion Schale. Der schwarze Hintergrund bietet dagegen das Sezierung hilft. Es sollte bei Verwendung Kanülieren Drähte Endothels entnommen werdenial Zellschicht kann mit überschüssiger Reibung der Draht gegen das Lumen des Gefäßes entfernt werden können. </li><li> Werfen Sie einen Draht und einen kleinen Winkel von 90 ° an einem Ende und drücken Sie den abgewinkelten Ende in das Silastic Grundlage, um den Führungsdraht zu verankern. Legen Sie die gesamte Aorta in der Dissektion Gericht. </li><li> Halten Sie das Ende des Führungsdrahtes mit einer Pinzette, und dann sanft führen Sie das Kabel in das Lumen der Aorta. </li><li> Verwenden einer Pinzette, und schieben Sie die Aorta auf den Draht. Wenn das freie Ende des Führungsdrahtes zu sehen ist, die Kurve der Draht vorsichtig und legen Sie das freie Ende in die Silastic Gründung der Schale, um das Gewebe zu stabilisieren. </li><li> Mit kleinen Vannas Schere und Pinzette, entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe und alle anderen Fremdgewebe, Blutgerinnsel, usw., bis der thorakalen Aorta erscheint weiß und etwas faserig. </li><li> Entfernen Sie die gereinigt Aorta aus Draht und mit einer Schere die Aorta in Ringe, die etwa 3-5 mm in der Breite sind abgeschnitten. </li><li> Ein Aortaring auf einer von einem Paar von tiUSGABE Haken, indem Sie den Haken und mit einer Pinzette vorsichtig schieben Sie den Ring auf Haken. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Haken. Achten Sie darauf, um die Haken zu gewährleisten nicht verheddern; siehe Abbildung 3. </li><li> Überprüfen Sie, dass jeder Haken hat eine andere Seidenfaden befestigt. Überprüfen Sie, ob ein Haken hat einen kleinen verknoteten Schleife aus Seide, die zur Befestigung an einer Glas- oder Edelstahlstange ermöglicht, während die andere ist eine 4.10 cm langes Stück Faden, der von Hand gebunden mit dem Kraftaufnehmer sein wird; siehe Abbildung 3. HINWEIS: Wenn die Aorta an den Haken befestigt ist, ist das Gewebe, bereit, in das Gewebebad angebracht zu werden; siehe Abbildung 3. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,14 bis 2,15, um eine zweite Aortenring im zweiten Gewebebad Kammer montieren. </li></ol> 3. Die Gewebe Platzierung in Bath <ol><li> Man beachte, dass in diesem System werden die Gewebebädern selbst stationär sind. Zu dieser Zeit füllen die Gewebebäder mit warmen, belüfteten PSS und lassen Sie die Lösung zu kommen, um Temperature. </li><li> Mit der Seidenfaden, binden eine der Haken an der Gewebepräparation mit dem Stift auf dem Edelstahlstange. Dieses Ende in das Gewebe Badkammer. Schließen Sie den Stab zu einem Ringständer und das andere Ende in der Färbung Gericht mit PSS gefüllt, um Gewebe in Puffer eingetaucht zu halten; siehe Abbildung 3. <ol><li> Setzen Sie den Stab und Gewebe im Gewebebad Kammer und stellen Sie sicher, das Gewebe ist vollständig in PSS eingetaucht und der Stab ist sicher; siehe Abbildung 3. </li><li> Binden Sie die andere Naht auf den Kraftaufnehmer und stellen Sie sicher, um ein Durchhängen in der Naht zwischen dem Gewebe und den Kraftaufnehmer zu verlassen. HINWEIS: Dieser Durchhang wird durch Anpassung des Mikrometer entfernt werden; siehe Abbildung 3. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 4. Einstellen Passive Tension HINWEIS: Jedes Gewebe hat eine Länge (Lo), an der glatten Muskelzellen reagieren optimally. Vorversuche die optimale Streckziehspannung, welche erzielt diese Länge ist für jeden einzelnen Gewebetyp durchgeführt werden, zu prüfen, zu bestimmen. Die Brustaorta von Ratten hat eine optimale passive Dehnungsspannung von 4 g. <ol><li> Verwenden Sie die Mikrometer / Zahnstange und Ritzel, um die Spannung zu erhöhen, 2 g und warten auf das Gewebe zu Plateau zu erreichen. Sobald Plateau erreicht ist, erhöhen Spannung eine weitere 2 g und warten auf das Gewebe zur Stabilisierung. HINWEIS: In den Aortenringe, nachdem die Anfangsspannung von 2 g ist untergegangen und Plateau erreicht, sollte das Gewebe dann auf ~ 1,6 g entspannen. Eine zweite Anwendung von 2 g würde das Gewebe zu bringen ~ 3,6 g, aus dem das Gewebe wieder zu entspannen und die Spannung nimmt ab. Somit nach Zugabe von 4 g Gesamtspannung, sollte die Software angeben etwa 3,2 g Spannung. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Arzneimittelherstellung <ol><li> Äquilibrieren Sie die Gewebe für60 min nach dem Auftragen passive Spannung auf das Gewebe. </li><li> Während des Gleichgewichtsphase, waschen Sie die Gewebe alle 15-20 min. Lassen Sie das Gewebe Bad und ersetzen Sie die PSS mit PSS aus einem Reservoir erwärmt. HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Gewebe zu entspannen, die durch den Verlust der passive Spannung angedeutet ist. </li><li> Während dieser Zeit der Zubereitung von Drogen für den Versuch, die mindestens 1.000 mal konzentrierter als die tatsächliche Konzentration in dem Bad benötigen, so dass nur ein kleines Volumen des Medikaments Lager benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. </li></ol> 6. Erste Herausforderung <ol><li> Am Ende des Äquilibrierungsperiode, waschen das Gewebe ein letztes Mal, Daten speichern und wieder auf Null alle Eingänge. </li><li> Wählen Sie einen Agonisten (Verbindung, die aktive Kontraktion verursachen wird), auf die das Gewebe reagiert. HINWEIS: In der Brustaorta von Ratten, die arteriellen glatten Muskeln aktiv zu einer alpha-adrenergen Rezeptor-Agonisten Vertrag aufgrund der Innervation derGewebe durch das sympathische Nervensystem. Ein adrenergen Agonisten nicht sinnvoll in Darmgewebe sein da adrenergen Agonisten verursachen Entspannung. In diesem Fall könnte ein Rezeptor-Agonisten, wie Acetylcholin (cholinergen Rezeptor) verwendet werden. Eine Alternative zu beiden Phenylephrin und Acetylcholin ist, eine Nicht-Rezeptor-Agonisten, wie hohen Kalium (K) als den ersten Auftrag. In der glatten Muskulatur arbeitet hohen K indirekt offenen Kalziumkanäle und damit als ein allgemeiner Index der glatten Muskulatur Integrität angesehen. <ol><li> Führen Sie die erste Herausforderung oder den Wake-up Herausforderung durch Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad. Um diese Konzentration in 50 ml Gewebebad zu erreichen, fügen Sie 50 ul einer 10 -2 M Phenylephrin Lösung. HINWEIS: 50 ul in 50 ml PSS ist ein 1/1000-Verdünnung, so dass die Endkonzentration 1,000x weniger als Lager oder 10 -5 M. Die Kenntnis der Menge und konsistente Pflege des Volumens innerhalb Gewebebad chamber ist entscheidend für die Bestimmung der endgültigen Arzneistoffkonzentration. </li></ol></li><li> Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad und erlauben die Kontraktion zu Spitze und dann Plateau, wenn die Steigung der Daten zu Null wird. Stellen Sie sicher, jeden experimentellen Ereignis post experimentelle Analyse helfen zu erfassen. </li><li> Nach dem Hochplateau, waschen Sie die Agonisten gründlich durch Entleeren und Auffüllen des Gewebebad Kammer mit neuen PSS. Stellen Sie sicher, diese Ereignisse als auch aufzuzeichnen. ANMERKUNG: Eine Faustregel ist, dass die Konzentration des Agonisten in der Wanne verringert 10fach mit jeder Wäsche. Obwohl, kann mehr als 3-4 Wäschen notwendig sein, um das Gewebe wieder auf sein Gleichgewicht Grundlinientonus (Zug) zu bringen. </li><li> Lassen Sie das Gewebe Rest zu Studienbeginn Ton für ~ 10 min, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 7. Experiment HINWEIS: Prazosin, ein alpha-adrenergen Rezeptor-Antagonist, wird dem Gewebebad Kammer eingebracht, um die Konzentration bzw. verschiebenonse Kurve auf Phenylephrin (PE); dies ist eine nachweisbare Antagonismus. <ol><li> Einem Bad, fügen dem Fahrzeug (H 2 O) in dem Prazosin wurde aufgelöst. Zum anderen, fügen Sie die entsprechende Konzentration von Prazosin. In diesem Fall werden 25 ul Fahrzeug einem Bad und 25 ul von 10 -5 M Konzentration von Prazosin zu der anderen, um eine 5 x 10 -9 M oder 5 nM Konzentration in dem Bad zu erreichen. Anmerkung: Während der Zugabe des Fahrzeugs unnötig erscheint in diesem Beispiel, ist es zwingend, so zu tun, als mit anderen Fahrzeugen, die eine potentielle vasoaktiven zu sein (beispielsweise DMSO, Ethanol, Acetat) haben. Fügen Sie die entsprechenden Fahrzeugs, auch wenn wenig Beweise gibt es für vasoaktive sein. </li><li> Lassen Fahrzeug / Prazosin in den Bädern und nicht das Gewebe Waschen für 1 Stunde. <ol><li> Während Gewebe im Gleichgewicht, bereiten mehrere Konzentrationen von Agonisten (PE). Umfassen ein breites Spektrum von Konzentrationen von Konzentrationen entlocken keine Antwort (zB &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) zu Konzentrationen, die die maximale Reaktion (übertreffen zB 10 -4 M PE). Seit Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind logarithmisch in der Natur, machen sechs separate Stammlösungen von PE (10 -6 bis 10 -1 M) über Verdünnungsreihen von der 10 -1 M-Stammlösung. Sicherstellen, dass die für jede Konzentration benötigte Volumen etwas größer als das Dreifache des Gesamtvolumens für alle Bäder (dh&gt; 300 ul) benötigt. </li></ol></li><li> Mit Hinzufügen Agonisten, wie in Tabelle 1 beschrieben. HINWEIS: Dieses Experiment wird eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf PE zu generieren; jede Iteration berücksichtigt die Menge der Substanz bereits an dem Bad zugesetzt. Zugänge auftreten, bis sie Kontraktion nicht mehr zu erhöhen, oder die gesamte Kurve ein Plateau erreicht hat. <ol><li> Fügen Sie jede Wirkstoffkonzentration einzeln, bis das Gewebe Schwelle erreicht ist. </li><li> Wenn keine Änderung auftritt, fügen Sie den nächsten Konzentration in derSerie; siehe Tabelle 2. Anmerkung: Der Zeitpunkt dieser Zusätze hängt von der Agonist verwendet. Zum Beispiel, Noradrenalin und Phenylephrin Kontraktion entwickelt sich schnell, und sollte innerhalb weniger Minuten ein Plateau. Im Gegensatz dazu entwickelt Endothelin-1 Kontraktion langsam und nicht für fast 45 Minuten ein Plateau. Andere Experimente können auf dem Gewebe nach dem Aufbau einer Kurve, wie dies getan werden kann, solange wie (1) die Substanz auswäscht; und (2) gezeigt werden kann, dass das Gewebe wieder in den normalen Kontraktionsverhalten und wird nicht durch den vorhergehenden Stimulationen beeinflusst. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Achten Sie darauf, die Daten unmittelbar vor und nach einem Eingriff zu sparen (zB aufwachen oder Voll Kurve). </li><li> Suche und den Gewebegrundlinie für jedes Gewebe Badkammer / Eingangskanal, der in der Datenanalyse helfen werden. </li><li> Sobald die Grundlinie gesetzt wird, suchen Sie die maximale Reaktion für jede Konzentration, und notieren Sie die change von der Grundlinie. Nacheinander durch jede der Konzentrationen bewegen und notieren Sie die Grundlinienverschiebung. </li><li> Graph der resultierenden Daten. Tun Sie dies in jedem Grafik-Programm. HINWEIS: Graph Pad Prism für Pharmakologen gestaltet, und dies ist für die Art des Experiments hier vorgestellt. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Die Messung der isometrischen Kraft als Forschungswerkzeug ist über 150 Jahre alt, aber es die prototypische Technik zur Charakterisierung Rezeptor in kontraktilen Gewebe 2 ist weiterhin. Die Leistungsfähigkeit dieser Technik besteht in ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit: durch Aufzeichnen Antworten durch zunehmende Konzentrationen eines Agonisten in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Antagonisten hervorgerufen, kann eine Vielzahl von Informationen über die pharmakologischen Eigenschaften eines jeden Medikaments Rezeptors abgeleitet werden, die bindet es 3-5. Experimente dieser Art sammeln auch Informationen über die Wettbewerbs versus nicht wettbewerbsfähig Natur der verwendeten Antagonisten sowie Rezeptorheterogenität und unspezifische Medikamentenwirkungen 6-8. Somit kann mit einfachen Permutationen dieser isolierten Gewebebad Experiment kann eine relativ vollständige pharmakologische Profil der Rezeptoren, Agonisten induzierten Muskelkontraktion Vermittlung erzeugt werden. In Bezug auf Agonismus, the relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten eines bestimmten Gewebes kann berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion inkubiert. 2 stellt modifizierte Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten wurden mit der maximalen Kontraktion durch PE erreicht markiert als max markiert, die als solche gekennzeichnet ½ maximale Kontraktion und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EC50-Wert erreicht. Leider hat die Verwendung Agonist abhängiger Parameters nur um festzustellen, Rezeptorbindungseigenschaften kann kompliziert sein 9. Idealerweise zusätzliche Experimente unter Verwendung von Rezeptor-Antagonisten erlauben die Berechnung von zwei wichtige Parameter, die Schlüssel zu definieren, die Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor sind: -log 10 des Antagonisten Dissoziationskonstante (pK B) und der 10 -log des molaren Antagonist Konzentration notwendig, zwei-fache Rechtsverschiebung in der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (pA 2) 10 auslösen. Sowohl K B und 2 pA Verstärkungs ihre Nützlichkeit aus der Tatsache, daß sie Agonisten-unabhängigen Werten, und konstant, selbst zwischen verschiedenen Geweben 11. Aus den Daten in Abbildung 2 kann pK B unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden, und basierend auf EC 50 -Werte anderswo berechnet: EC 50 in Abwesenheit von Prazosin = 2 x 10 -8 M EC 50 in der PreSinn von Prazosin = 7 x 10 -6 M Lösen für K B in der folgenden Gleichung: log (dr-1) = log [B] - log K B Wo: [B] = Antagonistenkonzentration, oder 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = Dosisverhältnis von EC50-Wert in Gegenwart von Antagonisten / EG 50 in Abwesenheit. Wenn es eine Verschiebung nach rechts, so wird dieser Wert größer als eins sein. Somit: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M oder 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Setzt man für [B] und dr: log (350-1) = -8 - log K B 2,54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Dieser Wert für Prazosin ist konsistent mit den erhaltenen Werten, wenn Prazosin wirkt mit einem α 1 -adrenergen receptbzw. 12,13, was darauf hindeutet, daß der adrenerge Rezeptor vermitteln Kontraktion auf Phenylephrin ist das α 1 -adrenergen Rezeptor. Mehrere Schritte sind kritisch für den Erfolg dieser Versuche. Gewebe muss in PSS nach der Sektion bleiben, um den Verlust der Lebensfähigkeit des Gewebes zu verhindern. Jede isometrische Muskelvorbereitung hat eine optimale Länge Spannungsbeziehung, die maximale Kraft vor dem Passiv Spannung 14,15 erzeugt. Für die in diesem Protokoll beschriebenen Experiment wurde eine optimale passive Spannung zuvor kurz Zugabe Schritten von 0,5 g passiver Spannung auf das Gewebe bestimmt. Das Gewebe sollte ohne Ton beginnen und dann nach 30 min Äquilibrierungspuffer wurde das Gewebe mit einer maximalen Konzentration von KCl (80 mM), die aktive Ton erzeugt in Frage gestellt. Dann wurde das Gewebe gewaschen und bis zur Grundlinientonus zurückzukehren. Nach 15 Minuten zu Beginn der Studie wurde eine weitere 0,5 g passive Spannung gesetzt und dieser Prozess wiederholt, bis ein Plateau vonaktive Spannung wurde mit zusätzlichen passiven Spannung erreicht. In Vorversuchen wurden 4 g insgesamt passive Spannung bestimmt, um eine maximale aktive Spannung Generation in Aortenringen erreichen, und somit diese Summe der Spannungen an die Ringe vor der Äquilibrierung gegeben. Verfahrenstechnisch ist es am besten vor passive Spannung Anwendung auf Null, sondern kann jederzeit vor dem Versuch erfolgen. Überdehnung Gewebe an jedem Punkt in dem Experiment oder Dissektion wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit des Gewebes und experimentellen Ergebnissen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Anordnen Gewebe in der Wanne, wie dieser Schritt hat die höchste Wahrscheinlichkeit übermäßige Dehnung. Ausreichendes Waschen, in Anzahl und Dauer ist für reproduzierbare Effekte erforderlich. Eine zweite Herausforderung zu früh nach einer ersten Herausforderung, vor oder Gewebe wurden zum Ausgangsspannung zurückgesendet werden, in abweichenden Reaktionen führen. Wenn Studium reversible Antagonisten / Inhibitoren sollten Gewebe nicht vor gewaschen, um zusätzlich Agonist, als inhibitor Konzentration verringert. Es gibt bemerkenswerte Vorteile und Nachteile für den isolierten Gewebebad Assays. Nachteile: Die Gewebe können unterschiedliche Grade der Beschädigung während der chirurgischen Entfernung oder der Platzierung der Ringe an den Haken zu erfahren. Da die Endothelzellen der inneren Auskleidung des Aortenrings muss darauf von der Platzierung des Rings an Haken ergriffen, um nicht diese Zellschicht zu beschädigen. Gewebe können auch deutlich unterschiedliche Zeitdauern, in denen sie lebensfähig Gewebebad sind, und dies hat zu ermitteln; nicht alle Gewebe gleich sind. In diesem Sinne kann Gewebe in ihrer Reaktionsfähigkeit im Laufe des Tages ändern, so dass Zeitkontrollen zu einem notwendigen Steuer für jedes Experiment. Ein gutes Beispiel dafür ist die Meerschweinchentrachea, die Kontraktilität maximal um 100% während einer typischen 8 h Experiment verbessert. Medikamente, die in Wasser schlecht löslich sind, kann in dem PSS auszufällen. Schließlich kumulative einnd nicht kumulative Zugaben von einem Medikament, das ein Agonist könnte zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, wenn Rezeptordesensibilisierung auf den Agonisten auftritt; Angiotensin-II ist ein solches Medikament, das schnelle Tachyphylaxie zeigt. Vorteile: Einer der Hauptvorteile der Gewebebad-Experimente ist, dass es in Echtzeit; kann man den Versuch sehen, wie es sich entwickelt und kann schnell machen Schlussfolgerungen und nächste Schritte zu planen, sowie Fehlerbehebung während eines Experiments. Ein Experiment dauert einen Tag, um zu tun. Multiple Gewebe kann typischerweise von einem Tier hergestellt werden, so dass ein Tier als seine eigene Kontrolle dienen, und das erhöht die Festigkeit eines Experiments. Man kann auch das Gewebe von anderen Faktoren zu isolieren, so daß eine relativ reine Reaktion des Gewebes auf das Medikament zu testen. In vitro Experimente wie Gewebebad System ermöglichen auch die Verwendung einer kleinen Menge an Arzneimittel im Vergleich zu einem in vivo-Versuch. Die hier beschriebene grundlegende experimentelle Design sein kannextensiv modifiziert, um die Aufnahme von zusätzlichen Parametern oder die Einführung von anderen externen Stimuli ermöglichen. Zum Beispiel Zugabe von Elektroden ermöglichen elektrisches Feld Stimulation der Nerven innervieren 16,17. Mit dem Zusatz von thermischer oder pH-Sonden können die Effekte von Temperatur und pH auf die kontraktilen Reaktionen gemessen 18,19 werden. Auf ähnliche Weise können Sauerstoff ganz oder teilweise mit N 2 auf Hypoxie induzierte Effekte zu bewerten ersetzt werden. Darüber hinaus können die gleichen Grundprinzipien der isometrischen Kontraktionsmessung in diesem Video verwendet, um Systeme, die die gleichzeitige Messung der isometrischen Spannung Entwicklung und Veränderungen der intrazellulären Calcium 20 gestatten zu entwickeln. Signaltransduktion wird auch leicht untersucht, da Systeme existieren, die eine Gewebeprobe während einer Reaktion schnell zu gefrieren, so dass die Aktivität eines Signaltransduktionsweges System kann biochemisch verifiziert werden. Die Variation equipment die verwendet werden können, dies zu tun, ist enorm. Das ganze System, entweder von Hand gebaut oder automatisiert, können aus mehreren verschiedenen Unternehmen erworben werden. Die Gewebebäder und Gewebe-Halter im Sinne dieses Protokolls sind mundgeblasen (Gewebebäder) und von Hand gebaut (Inhaber) durch eine in-house Michigan State University Werkstätten.

Die Disziplin der Pharmakologie ist die isolierte Gewebebad System seit über 150 Jahren verwendet. Die Vielseitigkeit dieses Systems hat Wissenschaftler erlaubt in der ganzen Welt, um Rezeptoren und Rezeptor-Signaltransduktion zu charakterisieren, mit dieser Erkenntnis, die die Grundlage von Therapien, die Millionen von Menschen mit Erkrankungen oder Störungen, wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Diabetes, gastrointestinalen Erkrankungen, Blasen behandelt wurden Dysfunktion, Asthma und Schluckstörungen, um nur einige zu nennen. Bis heute bleibt das isolierte Gewebebad eine wichtige Facette der Arzneimittelentwicklung und Grundlagenforschung, da es dem Gewebe als Gewebe funktionieren. In diesem JoVE Lektion wird ein formales Protokoll gemeinsam genutzt, um eine visuelle und virtuelle Experiment unter Verwendung der Daten aus einer isolierten Gewebebad Experiment, das isometrische Kontraktion misst, die Rezeptorcharakterisierung ermöglicht demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Gewebe eine lebendend als Ganzes funktioniert Gewebes mit einer physiologischen Ergebnis (Kontraktion oder Relaxation), die für den Körper ist. Es ist eine Synthese von Schritten (drug-Rezeptor-Wechselwirkung, Signaltransduktion, second messenger Erzeugung, Änderung in der glatten Muskulatur Erregbarkeit und Veränderung der Gewebefunktion). Während andere Techniken ermöglichen Studium jedem dieser Schritte (zB Radioligand für die Arzneimittelaffinität, die Messung der zweiten Boten-Bindung), ermöglicht die Integration aller dieser Schritte 1 das isolierte Gewebebad Technik. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Beibehaltung der Gewebefunktion ermöglicht die Berechnung der wichtigsten pharmakologischen Variablen, die in einem Gewebe gegen ein Mobil Einstellung mehr sinnvoll sind; es näher kommt, wie die untersuchten Medikamente würden im Körper als Ganzes zu arbeiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

In Bezug auf Agonismus, kann die relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten in einem gegebenen Gewebe berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion (Abbildung 1) inkubiert. Abbildung 2 präsentiert geändert Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten markiert die maximale Kontraktion durch PE erreicht markiert max, der ½ maximalen Kontraktion als solche markiert und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EG erreicht <sub&gt; 50 Wert. Das war in diesem donegraphically example.Computer Software, die zur Kurvenanpassung und die Berechnung der EC 50 -Werte können logistische Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet werden, verwendet. Bei der Erzeugung und Interpretation dieser Ergebnisse ist es wichtig, sowohl niedrige als auch hohe Konzentrationen von Agonisten zu verwenden, um die Konzentration-Antwort-Kurve zu erstellen. Ohne genug Punkte, um eine stabile Basislinie und die maximale Hochebene zeigen, kann EC 50 und E MAX nur geschätzt werden. Dies wurde graphisch in diesem Beispiel gemacht. Computersoftware, die logistischen Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet, kann für die Kurvenanpassung und Berechnung von EC 50 Werte verwendet werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Schematische Bad Tissue-Karikatur, die einen Ring von Gewebe in der doppelwandigen platziert, mit Wassermantel Gewebe bath. Puffer und Abfluss werden durch eine 3-Wege-Glashahn in die Basis der Kammer integriert geregelt. O 2 / CO 2 wird über einen Belüfter, der mit einer Dichtung des Lecks der PSS oder Gas zu verhindern abgedichtet eingeblasen wird. Umluft Eingang unter dem Ausgabe, um eine ordnungsgemäße Rückführung zu erhalten und die Bildung von Luftblasen, die Temperatur disregulation führen würde, zu verhindern. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Brustaorta von Ratten + Endothel Die Abbildung zeigt vier getrennte Experimente (verschiedene Tiere und von verschiedenen Forschern auf verschiedenen Setups, wie durch unterschiedliche Farben dargestellt getan), die Fähigkeit von Prazosin, um eine PE-induzierten Kontraktion verschieben testen. Prazosin (5 nM) deutlich verschoben PE-induzierte Kontraktionskurve nach rechts in einer parallelen Weise. Abbildung 3: Brustaorta von Ratten + Endothelium Graphical Schätzung der EC 50 Werte für PE in Abwesenheit (Fahrzeug) und Anwesenheit (Prazosin) des Antagonisten.. Grüne Linie (Gruppe C) nur markiert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Salz </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Liter </td><td> FINAL mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (Gramm) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37,99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1,75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1,45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6.25 </td><td> 14,9 </td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0,05 </td><td> 0,03 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: normale physiologische Salzlösung (PSS) Rezept Inhalt des bikarbonatgestützte PSS in diesem Experiment verwendet.. Eingeschlossen sind die Molekulargewichte aller Salze und die Menge an 5 l dH 2 O zugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erzielen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Die Konzentration im Bad </td><td> Die Zugabe von Agonist zu Bad gemacht </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Tissue Badezusatz Agonist-Konzentrationen Die Menge des Agonisten zu jedem Bad zu Pro hinzugefügt werdenperly konstruieren kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven. Die gewünschte Badkonzentration durch Zugabe von sequentiellen Mengen von steigenden Konzentrationen des Agonisten erreicht wird. Jedes hinaus berücksichtigt die Konzentration des Agonisten bereits im Bad vorhanden. Dies wird durchgeführt, um die Zunahme des Volumens im Gewebebad, das von unter Verwendung steigender Mengen von einer einzigen Konzentration des Agonisten führen würde minimieren.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

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JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

135.8K Aufrufe.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Serie: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Forschung

Biologie

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Die Maus Cremaster Muscle Vorbereitung Intravital Imaging der Mikrozirkulation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...