Detrusor glatte Muskelzellen bilden die Wand der Harnblase, die letztlich erleichtert die Urin-Voiding und Lagerung. Unser Protokoll bietet eine validierte und zuverlässige Methode zur frischisolierten einzelnen glatten Muskelzellen. Frisch isolierte menschliche Detrusor-Glatte-Muskelzellen bieten die Möglichkeit für elektrophysiologische und molekulare Untersuchungen auf Einzelzellebene.
Durch die Untersuchung einzelner Detrusor glatte Muskelzellen aus Kontrolle, normale, und kranke menschliche Harnblasen, haben wir die Möglichkeit, pharmakologische Ziele wie Ionenkanäle zu validieren. Einzelne menschliche Detrusor-Glatte-Muskelzellen sind ideal für elektrophysiologische Experimente wie die Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Hier stellen wir ein Beispiel für die Untersuchung eines einzelnen Ionenkanals namens TRPM4 vor, einem transienten Rezeptorpotential-Melastatin-Vierkanal, der ein nichtselektiver Kationenkanal ist.
Anfänger können mit Sezieren und enzymatische Behandlungsschritte kämpfen, die Effizienz und Vertrautheit erfordern, einschließlich der Anerkennung wichtiger wichtiger Schritte für die Gewinnung frisch isolierter DSM-Zellen. Es ist wichtig, mit der humanen Blasenhistologie vertraut zu sein, Protokollschritte zur Isolierung einzelner Zellen bleiben belastbar und erwarten zunächst, suboptimale Zellen mit diesem Protokoll zu erhalten. Beginnen Sie mit der Untersuchung der gesamten Dicke Harnblase Probe.
Die Probe, Schleimhaut nach oben und serosa nach unten auf eine Silikon-Enantiomer-beschichtete 150 mm runde Schale mit eiskaltem DS gefüllt und sorgfältig entfernen Sie alle Schleimhaut durch scharfe Sezierung. Schneiden Sie mehrere Schleimhautfreie Detrusor glatte Muskel- oder DSM-Stücke aus. Legen Sie drei bis sechs DSM-Stücke in eine Röhre mit einem bis zwei Millilitern vorgewärmten DS mit Papain und Dithiothreitol oder DS-P.
Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten, stellen Sie sicher, dass die Röhre alle 10 bis 15 Minuten schütteln. Nach der Inkubation den DS-P aus dem Rohr nehmen und die DSM-Stücke kurz mit eiskaltem DS waschen. Übertragen Sie das DS mit DSM-Stücken in ein neues Rohr und entfernen Sie das DS, sodass die DSM-Stücke an der Unterseite des Rohres bleiben. Fügen Sie ein bis zwei Milliliter DS mit Kollagenase Typ II oder DS-C in das Rohr.
Und bebrüten es bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln. Das DS-C entsorgen und die enzymbehandelten DSM-Stücke fünf- bis zehnmal mit eiskaltem DS waschen. Nach der letzten Wäsche lassen Sie das DS in der Röhre und trituieren Sie die Stücke vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteurpipetette, um einzelne DSM-Zellen freizusetzen. Pipette 0,25 bis zu einem Milliliter Zellsuspension auf eine Glasbodenkammer, die auf der Bühne eines invertierten Mikroskops sitzt, und inkubieren Sie sie für mindestens 45 Minuten, damit die Zellen haften können.
Entfernen Sie dann das DS aus dem Bad und ersetzen Sie es durch E-Lösung über Superfusion. Ziehen Sie mehrere Patchelektroden, polieren Sie die Elektrodenspitzen und beschichten Sie die Spitzen bei Bedarf in Zahnwachs. Füllen Sie die Spitze einer Patchelektrode mit der Pipettenlösung ohne Amphotericin-B, indem Sie die Elektrode kurz in die Lösung tauchen.
Der Erfolg der Patchklemmenelektrophysiologie hängt von der DSM-Zellqualität und der Amphotericin-B-Löslichkeit ab. Füllen Sie die Elektrode mit der gleichen Pipettenlösung mit Amphotericin-B und montieren Sie die Elektrode auf einen Halter, der mit einer Patchklemmen-Verstärkerkopfstufe verbunden ist. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Elektrode direkt unter der Oberfläche der extrazellulären Lösung zu platzieren, so dass die Spitze der Elektrode gerade untergetaucht ist.
Bestimmen Sie dann den Elektrodenwiderstand mit hilfe der Membrantestfensterfunktion der kommerziellen Erfassungssoftware und bringen Sie die Elektrode auf die interessenfreie Zelle vor. Beim Berühren der Zelloberfläche mit der Elektrode eine Giga-Dichtung bilden, indem man über Schläuche einen sanften, schnellen Unterdruck auf die Elektrode ausübt. Dies führt zu einem Unterdruck an der Elektrodespitze, was zu einer erfolgreichen Giga-Dichtung führt, wie der Membrantest bestätigt.
30 bis 60 Minuten für das Amphotericin-B die Pipette diffundieren und in die Plasmamembran eingeführt werden, wodurch Poren, die in erster Linie für monovalente Kationen selektiv sind, gebildet werden. Überwachen Sie die Giga-Dichtung mit der Membrantestfunktion weiter. Wenn die Patchperforation optimal ist, heben Sie die Kapazitätstransienten auf, indem Sie die Zifferblätter für die Zellkapazität und den Serienwiderstand am Verstärker anpassen.
Sobald die stabilen Spannungs-Schritt-Kationströme beobachtet sind, zeichnen Sie Ströme mit dem Routing-Spannungsschrittprotokoll auf, wie im Manuskript beschrieben. Wenden Sie eine Verbindung oder eine physiologische Testbedingung an, um sie durch Superfusion zu testen und zeichnen Sie die Reaktionen für die Kontroll- und Testbedingungen sowie das Auswaschen auf. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um gesunde, frische DSM-Zellen für funktionelle und molekulare Studien zu isolieren.
Gesunde einzelne DSM-Zellen zeichnen sich durch spindelförmige Morphologie, gestochen scharfe, gut definierte Kanten, einen klar definierten Halo um die Zelle und halbkontraktiles Aussehen unter dem Mikroskop aus. Darüber hinaus reagieren die frisch isolierten DSM-Zellen auf mechanische Stimulation und Auf Carbachol. Zellfragmente und nicht lebensfähige oder überautierte Zellen sollten in nachfolgenden Patch-Clamp-Experimenten vermieden werden.
Die isolierten Zellen wurden in amperhotericin-B perforierten Patch-Clamp-Experimenten eingesetzt, bei denen Vollzellströme entweder mit einem Spannungsschritt-induzierten oder Rampenprotokoll in drei verschiedenen menschlichen DSM-Zellen gemessen wurden. Experimente ergaben, dass 9-Phenanthrol, ein TRPM4-Kanalhemmer, menschliche DSM-Kationströme effektiv und reversibel hemmte. Die 9-Phenanthrol-empfindliche Stromkomponente veranschaulicht eine stärkere Hemmung bei positiven Spannungen und nach außen korrigierend.
Der Zustand der enzymatischen Behandlungsschritte, Schritte 2.2 und 2.3, einschließlich Temperatur, Dauer der Enzymbehandlungen, Enzym-Losquellen und Qualität von DSM-Zellen, sind schlüsselfertige Faktoren für die Erlangung hochwertiger menschlicher DSM-Zellen. Menschliche DSM-Zellen eignen sich auch ideal für die Bewertung intrazellulärer Zweitbotenwerte, einschließlich Kalzium und zyklischer AMP, den Nachweis von Proteinausdrücken durch Immunzytochemie und Co-Expression durch in situ proximale Prozessassay und mRNA-Expression durch RT-PCR, qRT-PCR, Mikroarrays und Sequenzierung der nächsten Generation. Menschliche DSM-Zellen haben unser Verständnis der Rollen von BK, Calcium, TRPM4 Kanälen in der Harnblase erweitert.
Zukünftige Entwicklungen werden es ermöglichen, elektrophysiologische oder pharmakologische Eigenschaften gezielt mit den Transkriptom- oder Proteomprofilen zu verknüpfen.
