Die Freundlichkeit und Großzügigkeit der Dr. Kent McDonald von der UC Berkeley werden sehr geschätzt. Wir danken einem anonymen Gutachter für sehr hilfreiche Anregungen. Die Burch-Smith-Labor wird von Start-up-Fonds von der Universität von Tennessee unterstützt.

HINWEIS: Das Verfahren erfordert QFS äußerster Sorgfalt und Vorsicht durch den Benutzer und stellen wir diese Sicherheitsmaßnahmen hier als Vorsichtshinweise und Hinweise, wo anwendbar. 1.Vorbereitung für HPF Run <ol><li> Vor Beginn der Probenvorbereitung, schalten Sie den Hochdruckgefrier folgenden Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendet HPF Einheit ist ein Wohlwend Compact 02 Einheit (1A), und es dauert etwa ein bis ein-und-ein-halb Stunden von Start-up-Verfahren vor HPF läuft kann beginnen. <ol><li> Einschalten des Wohlwend Compact 02 Hochdruck-Gefrierschrank. <ol><li> Gerät einschalten, indem der Hauptschalter von &quot;0&quot; auf &quot;1&quot;. </li><li> Freidruckluft an die Maschine. </li><li> Frei flüssigem Stickstoff an der Maschine. </li><li> Drücken Sie die Taste &quot;SYSTEM austrocknen&quot;. </li><li> Nach 30 Minuten, drücken Sie die &quot;SYSTEM austrocknen &quot;-Taste. </li><li> Drücken Sie die &quot;ON / OFF&quot;-Taste, um das Gerät einzuschalten. </li><li> Drücken Sie die &quot;Stickstoff&quot;-Taste. </li><li> Lassen Sie die Maschine für 20 Minuten abkühlen lassen, auch wenn der &quot;DRIVE IN&quot;-Taste hat bereits beleuchtet. </li><li> Der &quot;DRIVE IN&quot;-Taste leuchtet. </li><li> Drücken Sie die &quot;Drive in&quot;-Taste. </li><li> Drücken Sie die &quot;AUTO&quot;-Taste. </li><li> Die Taste leuchtet &quot;SYSTEM READY&quot; auf. </li><li> Legen Sie die Temperatur-und Druckfühler in die Druckkammer und verriegeln Sie ihn mit dem Stift. </li><li> Drücken Sie die &quot;JET AUTO&quot;-Taste. Dieser Schritt überprüft, dass der Druckanstieg und Temperaturabfall, wie gewünscht sind; Wesentlichen ein Probelauf. Sharp Temperaturstürze und scharfe Druckerhöhungen erwartet werden (Abbildung 1B). </li><li> Führen Sie zwei weitere JET-Zyklen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung für Receiving gefrorenen Proben <ol><li> Füllen Sie eine isolierte Box mit Cryovial Halter mit flüssigem Stickstoff (siehe Sicherheitshinweise), so dass die Halter vollständig bedeckt (Abbildung 1c). Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Legen Sie die entsprechende Anzahl der Fläschchen, die die FS Medium in der Aluminium-Rohrhalter in den flüssigen Stickstoff (Abbildung 1c). Mit diesem Protokoll bis zu vier Scheiben jeweils eine einzelne Probe, die in einem einzigen Kryoröhrchen platziert werden. HINWEIS: Die Fläschchen sollten mit einem scharfen Instrument wie ein Diamantschreiber und sehr weichen Bleistift markiert werden. <ol><li> Für Fixiermittel bei QFS verwenden 1% OsO 4 und 0,1% Uranylacetat in Aceton 9. Bereiten Sie die Lösung in großen Mengen, verzichten Aliquots von 1,5 ml in Kryoröhrchen und lagern in flüssigem Stickstoff eingefroren. Hinweis: Beachten Sie Sicherheitshinweise für den Umgang mit OsO 4 und Uranylacetat. HINWEIS: OsO 4 </sub&gt; und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalien und sollte im Abzug gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich geschlossene Schuhe, Kittel und Handschuhe. HINWEIS: Die für die Proben für QFS halten Kryoröhrchen sollte eine harte O-Ring, um zu gewährleisten, dass die Rohre bleiben während QFS abgedichtet, um eine Leckage von OsO 4 zu vermeiden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Hefe-Paste durch Mischen Bäckerhefe mit einem ungefähr gleichen Volumen 10% Methanol mit einem Zahnstocher oder andere Instrument, bis die Paste glatt ist. Die Hefe Paste wirkt als ein extrazelluläres Gefrierschutzmittel und wird verwendet, um den Raum um die Probe in dem Probenträger zu füllen. Die Menge der Paste hängt von der Anzahl der Proben; für 10 Proben oder weniger die Paste (1 ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. </li></ol> 3. Hochdruck Einfrieren von Proben <ol><li> Entfernen Sie ein Blatt (oder andere Gewebe) von Interesse aus der Pflanze und legen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Dental Wachs oder andere Schnittfläche. Verwenden Sie einen Schlag von 2,0 mm oder gewünschte Größe, um eine Probe aus dem Blatt geschnitten. Behandeln Sie die Probe vorsichtig mit einer Pinzette und arbeiten so schnell wie möglich. </li><li> Arbeiten unter einem Binokular, legen Sie die Blattscheibe in der 0,2 mm Seite der Typ-A-Probenträger und bedecken vollständig in Hefe-Paste. Sicherzustellen, dass die Platte vollständig gefüllt wird und die Paste auf einer Höhe mit dem Rand des Halters durch Glätten der Paste mit einem feinen Pinsel (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie den Träger in den Probenhalter. Decken Sie die Probe mit dem Probenträger Typ B, flache Oberfläche nach unten. HINWEIS: Der Probenhalter sollte trocken und bei Raumtemperatur. </li><li> Nehmen Probe in Probenhalter, stecken Sie sie in Maschine und initiieren eine Gefrierzyklus durch Drücken der &quot;JET AUTO&quot;-Taste, die in einer oder zwei Sekunden zu vervollständigen sollte. </li><li> So schnell wie möglich arbeiten, entfernen Sie den Halter aus dem Gerät und legen Sie die Spitze hält die sample in flüssigen Stickstoff in dem isolierten Kasten auf der Oberseite des HPF Maschine. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Pinzetten in den flüssigen Stickstoff, um sie zu kühlen. HINWEIS: Nach dem Einfrieren sollten die Träger nur mit flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette gehandhabt werden. Warm (Raumtemperatur) Pinzette sind oft die Ursache des Scheiterns in cryotechniques. </li><li> Öffnen Sie ein Kryoröhrchen mit dem FS Medien, und legen Sie den Deckel auf die Seite der Box. Mit Hilfe eines Paares von flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette vorsichtig entfernen Sie die CD aus dem Probenhalter, so dass die Scheibe immer in den flüssigen Stickstoff oder Dampf. Arbeiten in der Flüssigstickstoffdampf, halten Sie das Rohr mit einem FS vorgekühlten Pinzette und mit der anderen, um den Halter in der FS Fläschchen zu platzieren. Schrauben Sie den Deckel des Fläschchens FS wieder an. Nicht jede Falle von flüssigem Stickstoff in der Ampulle. HINWEIS: Bei der Übertragung von Proben für QFS Kryoröhrchen, sicherzustellen, dass kein flüssiger Stickstoff in den Fläschchen gefangen. Flüssigem Stickstoff erweitert 700-fach bei Erwärmung und jeder Trapped flüssiger Stickstoff Explosionen während dieser Zeit führen. </li><li> Die Schritte 3.1 bis 3.7, bis alle gewünschten Proben werden eingefroren. Mehrere Blattscheiben, die die gleiche Art der Probe kann in der gleichen Ampulle gegeben werden. Beachten Sie, dass der Probenhalter um getrocknete und auf Raumtemperatur zwischen Gefrierpunkt Läufe gebracht werden muss. Um dies schnell zu tun, erhitzen Sie es mit einem Fön, und seine Temperatur durch Berührung zu überwachen. </li></ol> 4. Vorbereitung für die Gefriersubstitution <ol><li> Vollständig einzutauchen das Aluminium Heizblock in flüssigen Stickstoff für 10 Minuten oder bis das Blasensieden stoppt. Während dies vor sich geht, legen eine Schicht aus Trockeneis (1-2 cm) in den Boden des als FS Kammer (Abbildung 3) verwendet Container. Ein Styropor-Behälter oder Eiskübel für FS verwendet werden, zusammen mit zerkleinerten Trockeneis oder Pellets. </li><li> Legen schnell die Kryoröhrchen mit den Proben zusammen mit dem Temperaturfühler in die mittleren Reihen der Heizungsblock. Achten Sie darauf, dass die Deckel auf dieFläschchen fest verschraubt, so dass der FS Medien nicht während FS auslaufen. Beginnt die Aufnahme der Temperatur. <ol><li> Machen den Temperaturfühler, indem ein Thermoelement in der Spitze eines Kryoröhrchen so daß er den Boden des Rohrs erreicht. Verschließen Sie den Deckel der Röhre mit Harz, so dass keine Flüssigkeit austritt. Das Rohr wird mit 1,5 ml Aceton bei Beginn jedes QFS Lauf. </li></ol></li><li> Mit isolierten Kryo oder große Zange, gießen Sie die gesamte Flüssigkeit Stickstoff aus der Heizungsblock. Achten Sie darauf, gießt die Kryoröhrchen. Hinweis: Verwenden Sie PPE einschließlich Kryo und Schutzbrille beim Umgang mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Legen Sie den Block mit den Fläschchen auf die Schicht aus Trockeneis in der QFS Kammer. Sicherstellen, daß der Block so angeordnet ist, daß die Rohre horizontal liegend, aber mit einer leichten Aufwärtsneigung. Es sollte keine Leckage sein, wenn die richtigen Kryoröhrchen eingesetzt werden. </li><li> Pack das QFS Kammer mit Trockeneis, so dass die FS Rohre bedeckt, obwohl es nicht notwendig ist,Decken Sie die Oberseite des Blocks. Den Deckel auf die Kammer. </li></ol> 5. Schnelle FS HINWEIS: Führen Sie die QFS Lauf in einer Abzugshaube in dem Fall, dass eine Leckage von OsO 4 versehentlich trotz anderer Vorsichtsmaßnahmen auftritt. <ol><li> Zeigen QFS Kammer auf einer Plattform Rotationsschüttler in einer Abzugshaube und drehen sich mit 125 Umdrehungen pro Minute für 120 min. Während dieser Zeit wird die Temperatur des Blocks schrittweise auf etwa -80 ° C zu erhöhen. Das Rühren gewährleistet das Mischen der Komponenten zur besseren FS. HINWEIS: Die Platzierung der Shaker in der Dunstabzugshaube und der Position des Abzugshaube Tür sollte sich während der gesamten Prozedur QFS und für jede QFS laufen, um konsistente Erwärmung der Proben zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie das Trockeneis aus der Kammer und weiter Schütteln für eine Stunde. Hinweis: die Temperatur auf etwa -15 ° C bis -20 ° C zu erhöhen. </li><li> Entfernen Sie die Proben und Temperaturfühler aus der QFS Kammer und auf denSchüttler bei Raumtemperatur für weitere 10-15 Minuten, bis sie Raumtemperatur erreichen. Stoppen Sie die Aufzeichnung der Temperatur. </li><li> Während FS, schalten Sie den HPF-Maschine. <ol><li> Schließen der Abgriff des Flüssigstickstofftank, während das HPF Maschine wird mit Stickstoff gefüllt. </li><li> Drücken Sie die &quot;Stickstoff&quot;-Taste. </li><li> Warten Sie, bis das rote &quot;Kolben nach unten&quot; Licht erlischt. </li><li> Drücken Sie die &quot;ON / OFF&quot;-Taste. </li><li> Drücken Sie die Taste &quot;SYSTEM austrocknen&quot;. </li><li> Zufuhr von Druckluft zu der Maschine. </li><li> Nach mindestens 12 Stunden (auf Trocken jeglicher Feuchtigkeit zu gewährleisten), schalten Sie das Gerät durch Drehen des Hauptschalters von &quot;1&quot; auf &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6. Beitrag FS Verarbeitung <ol><li> Die FS-Medien mit Kunststoff-Pipetten und in die entsprechenden Container für toxische Abfälle sorgfältig zu entfernen. HINWEIS: OsO 4 und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalienund sollte im Abzug gehandhabt werden, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) einschließlich geschlossene Schuhe, Kittel und Handschuhe. </li><li> Wasch Proben viermal mit 100% Aceton. Sammeln Sie die ersten zwei Wäschen und legen in der giftigen Abfallbehälter. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Gewebeproben aus den Halterungen. Halten Proben nass mit Aceton als dies geschehen ist, und arbeiten sehr vorsichtig, um zu brechen Proben zu vermeiden. HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, und es kann tatsächlich nützlich die Hefe-Paste fallen weg von den Proben, an dieser Stelle haben. Die Hefe-Paste ist in der Regel sehr dunkel braun, während das Blattgewebe ist immer noch grün. </li><li> Sammeln Sie die Proben in Kryoröhrchen Aceton enthalten. Fahren Sie mit dem Probenvorbereitung (Infiltration und Einbettung) für die TEM nach den üblichen Protokollen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Der Erfolg der hier vorgestellten Protokoll hängt stark von dem Benutzer. Zuerst wird advanced Vorbereitung erforderlich, um sicherzustellen, dass alle notwendigen Materialien leicht verfügbar sind und in ausreichender Menge, um eine gesamte HPF-QFS Lauf abzuschließen. Zweitens muss der Benutzer schnell zu arbeiten, sich von Schritt zu Schritt in einer effizienten Weise, die Handhabung der Proben minimiert und somit Änderungen der nativen Zustand des Gewebes zu minimieren. Sobald Proben werden eingefroren und bevor ...

Unser Wissen über die Ultrastruktur der Zelle kommt hauptsächlich aus Elektronen-Mikroskopie, die Details im Bereich von wenigen Nanometern 1 auflösen kann. Obwohl er so mächtig in auflösenden TEM nicht als benutzerfreundlich, da die Probenvorbereitung erfordert zeitaufwändige und mühsame Protokolle und verlangt einige Erfahrung aus dem Praktiker. Traditionelle Fixierung der Proben wurde die Verwendung von Aldehyden und Osmiumtetroxid vor der Weiterverarbeitung, die eine Dehydratation umfaßt, Einbetten in Harz und dann Schneiden an Ultradünnschnitten, die anschließend mit Schwermetallen verschmutzt sind produzieren kombiniert. Es ist jedoch bekannt, dass chemische Fixierung kann Artefakte einschließlich Proteinaggregation und Verlust von Lipiden 1, und Änderungen an Membranen, die letztlich auf mehrere Zellkompartimente 2 herzustellen. Diese Artefakte sind weitgehend auf die langsame Geschwindigkeit der Fixierung und Dehydratisierung bei Raumtemperatur 3, 4, 5 zurückgeführt. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Kryofixation durch Hochdruckgefrier (HPF) vermeidet die meisten der Artefakte, die durch chemische Fixierung verursacht. Das Prinzip der Kryofixation ist, dass es senkt den Gefrierpunkt von Wasser um 20 Grad, verlangsamt die Keimbildung und das Wachstum von Eiskristallen und erhöht die Viskosität von Wasser in einer biologischen Probe, so dass zelluläre Bestandteile sind im wesentlichen immobilisiert 6, 7. HPF nimmt ein Temperatur Probe zu der flüssigen Stickstoff unter hohem Druck (210 MPa oder 2100 bar) in Millisekunden. Wenn richtig gemacht HPF verhindert die Bildung von großen Eiskristallen, die große Schäden an Ultrastruktur der Zelle führen kann. HPF kann verwendet werden, um Proben von 100-200 um Dicke bei typischen Konzentrationen von gelösten Stoffen biologischen 7 fixieren. Es gibt zahlreiche Beiträge über die Physik und Grundsätze HPF, zB 1, 7, 8. Nach HPF Proben werden bei niedriger Temperatur (-78,5 ° C bis -90 inkubiert und# 176, c) in Gegenwart eines flüssigen organischen Lösungsmittels, das chemische Fixiermittel wie Osmiumtetroxid, in der Regel einige Tage. Bei dieser niedrigen Temperatur wird das Wasser in der Probe durch das organische Lösungsmittel, üblicherweise Aceton oder Methanol 1, 9 ersetzt. Somit wird dieser Prozess aufgerufen Gefriersubstitution (FS). Die Probe wird dann nach und nach erwärmt und während dieser Zeit ist festgelegt, in der Regel mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat 9. Vernetzung bei niedrigen Temperaturen hat den Vorteil einer Fixierung Moleküle immobilisiert sind, die 1. FS erzeugt daher Proben im Vergleich zu denen von herkömmlichen chemischen Fixierung bei Raumtemperatur fixiert höchster Qualität, insbesondere in verbesserten ultra Erhaltung Ergebnisse, bessere Erhaltung der Antigenität und reduziert Verlust von ungebundenen zellulären Komponenten 10, 11. Die meisten FS erfolgt über lange Zeiträume, typischerweise bis zu mehreren Tagen. Dies ist besonders true für Pflanzen Proben 12, 13, 14. Eine aktuelle Protokoll, das von McDonald und Webb entwickelt reduziert die Zeit für die FS von mehreren Tagen auf wenige Stunden 15. In ihren Schnellgefriersubstitution (QFS) Verfahren wird FS über 3 Stunden durchgeführt, während in den super schnell FS (sqfs) Proben werden in 90 Minuten bearbeitet. Die Qualität der Proben durch diese Verfahren hergestellt wird, vergleichbar mit denen von herkömmlichen FS Protokolle ergab. Wir haben die QFS-Protokoll für die Weiterverarbeitung von Pflanzenproben nach HPF angenommen. Dies hat sich nicht nur Zeit, sondern auch Geld sparen, da QFS und sqfs verwenden gemeinsame Laborgeräte statt der kostspielige Handel erhältlichen FS-Maschinen. Pflanzengeweben sind oft sehr schwierig, für die TEM vorzubereiten. Im Durchschnitt sind Pflanzenzellen größer als entweder bakterielle oder tierische Zellen. Die Anwesenheit von hydrophoben, wachsartigen Kutikula, dicke Zellwände, große mit Wasser gefüllte Vakuolen, die organische Säuren, Hydrolasen und Phenol compounds, dass bis zu 90% des gesamten Zellvolumens einnehmen bis 16, und das Vorhandensein von belüfteten Räumen stark vermindert die Wärmeleitfähigkeit des Systems 17. Ferner wird in dem Fall von Pflanzen, die Probendicke fast immer 20 um übersteigt, die Grenze für die Nutzung der chemischen Fixierung. Bei diesen Stärken, die geringe Wärmeleitfähigkeit von Wasser verhindert, dass ein Gefrierrate mehr als -10.000 ° C / s in der Mitte der Probe. Diese Rate ist erforderlich, um schädliche Eisbildung hexagonalen (Eiskristalle mit einer geringeren Dichte und größer als 10 bis 15 nm) zu vermeiden, 8. Zusammen bilden diese aktuellen Herausforderungen sowohl richtige Einfrieren der Probe und anschließende FS. Dennoch ist Kryofixation die beste Methode für die Festsetzung Pflanzenproben. Hier wird ein Protokoll für die HPF-QFS Pflanzengewebeproben dargestellt. Es konzentriert sich auf das Modell Art Arabidopsis thaliana, hat aber auch mit Nicotiana benthamiana verwendet. Die typischen Ergebnisse zeigen, dass HPF-QFS produziert samples vergleichbarer Qualität zu herkömmlichen HPF-FS in einem Bruchteil der Zeit. Mit der richtigen Einstellung, kann dieses Protokoll auch für andere relativ dicken biologischen Proben verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

Seit den 1940er Jahren Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet seit Biologen mit ultra-hochauflösende Bilder von biologischen Materialien. Doch weil der mühsame und zeitraubende Protokolle, die auch verlangen, Erfahrung in der Herstellung von artefaktfreie Proben, TEM ist nicht als eine benutzerfreundliche Technik. Traditionelle Probenvorbereitung für TEM verwendeten chemischen Fixiermittel, um zelluläre Strukturen zu bewahren. Hochdruckgefrier ist Kryofixation von biologischen Proben bei hohen Drücken sehr schnell Kühlraten zu erzeugen, wodurch die Eisbildung, die nachteilig für die Integrität der zellulären Ultrastruktur schränkt. Hochdruck Gefrieren und Gefriersubstitution sind derzeit die Methode der Wahl zur Herstellung der höchsten Qualität Morphologie Harzabschnitte für TEM. Diese Methoden minimieren die Artefakte, die normalerweise mit herkömmlichen Verarbeitungs für TEM von Dünnschnitten verbunden. Nach Kryofixation das gefrorene Wasser in der Probe wird mit Flüssigkeit ersetztorganischen Lösungsmittel bei tiefen Temperaturen, ein Prozess, der Gefriersubstitution. Gefriersubstitution erfolgt typischerweise über mehrere Tage in gewidmet, teure Ausrüstung durchgeführt. Eine Innovation kann das Verfahren in drei Stunden abgeschlossen sein, anstelle der üblichen zwei Tage. Dies wird typischerweise durch mehrere Tage der Probenvorbereitung, die Infiltration und die Einbettung in Epoxyharzen vor dem Schneiden enthält, gefolgt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, die hohe Druckgefrieren und Schnellgefrier Substitution, die Pflanzenprobe Fixierung innerhalb weniger Stunden erreicht werden können. Das Protokoll kann leicht für die Zusammenarbeit mit anderen Geweben oder Organismen angepasst werden. Pflanzengewebe sind von besonderer Bedeutung, da die Anwesenheit von belüfteten Räumen und mit Wasser gefüllte Vakuolen, die eisfreien Gefrieren von Wasser zu verhindern. Darüber hinaus ist der Prozess der chemischen Fixierung besonders lange in Pflanzen durch Zellwände behindert das Eindringen von Chemikalien, tief in das Gewebe. Pflanzengewebe sind daher insbesonsondere Herausforderung, aber dieses Protokoll ist zuverlässig und produziert Proben von höchster Qualität.

Nachfolgend dargestellten Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Wohlwend Compact 02 für HPF (Abbildung 1A) erhalten. Ein großer Vorteil dieses Instruments ist die Leichtigkeit der Verwendung der Probenträger und ihre Halterungen. Bei der Verwendung von anderen Instrumenten, empfiehlt McDonald, dass zwei Benutzer sollten die Durchführung der Probenvorbereitung und HPF, eine Vorbereitung der Proben, während der andere tut das Einfrieren und Transfer zum FS 9 Kryoröhrchen. Doch die Wohlwend Pr...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Aufrufe.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Serie: Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Forschung

Biologie

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.