Diese Probenvorbereitungstechnik wurde entwickelt, um die beste Qualität der Ultrastrukturkonservierung mit dem am besten geeigneten Kontrast für die bildgebende Modalität in einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop zu kombinieren. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für Proben, die eine Vorbereitung durch Hochdruckeinfrieren für eine zuverlässige Ultrastrukturkonservierung erfordern, aber während der Gefriersubstitution für Volumenabbildungen nicht genügend Kontrast erhalten. Für eine minimale Harzeinbettung ist es wichtig, so viel Harz wie möglich zu entfernen, um später im fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop eine angemessene Ausrichtung zu ermöglichen.
Um zu beginnen, verwenden Sie die Pipette, um einen Tropfen von 20%PVP PBS auf die Schneidmatte zu tropfen. Tauchen Sie den sezierten nervus tibialis in das Tröpfchen ein. Verwenden Sie das Skalpell, um zwei Millimeter Länge der Probe zu schneiden.
Verwenden Sie feine Zangen, um die Probe in einem 0,2 Millimeter tiefen Metallprobenträger vom Typ A zu platzieren. Übertragen Sie den Träger in die mittlere Platte der Patrone. Legen Sie den hexadecanbeschichteten Typ B Träger als Deckel auf die Oberseite.
Schließen Sie die Baugruppe, indem Sie die obere Hälfte der Patrone senken. Schließen Sie die dreiteilige Patrone in der Ladestation des Hochdruckgefrierschranks. Drücken Sie die Prozesstaste und fahren Sie entsprechend der Betriebsanleitung des Herstellers fort.
In einem Bad mit flüssigem Stickstoff Probenträger in Kryo-Fläschchen mit zwei Millilitern gefrorener 0,1%Tanninsäure und Aceton legen und die Kappen schließen. Legen Sie die Kryo-Fläschchen in die Gefriersubstitutionseinheit, die auf minus 90 Grad Celsius eingestellt ist. Starten Sie das Programm und halten Sie die Proben dort für 100 Stunden.
In der Gefriersubstitutionseinheit die Proben 30 Minuten lang dreimal mit zwei Milliliter Aceton waschen. 2%Osmiumtetroxid in 0,1% Uranylacetat zur Abkühlung in die Gefriersubstitutionseinheit geben und sieben Stunden lang bei minus 90 Grad Celsius in die Proben geben. Wenn die Programmtemperatur in der Gefriersubstitutionseinheit minus 20 Grad Celsius erreicht, halten Sie die Proben dort weitere 16 Stunden auf.
Wenn die Temperatur auf 4 Grad Celsius steigt, entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Fläschchen und füllen Sie reines Aceton aus. Entfernen Sie die Kryo-Fläschchen aus der Gefriersubstitutionseinheit. Die Probenhandhabung vor dem Einfrieren und nach der Osmofikation ist entscheidend, da die Probe stark beschädigt werden kann.
Verwenden Sie in einer Dunstabzugshaube die Metallträger aus den Kryofläschchen und übertragen Sie die Proben von den Trägern, um sie in eine 150 Millimeter tiefe, mit Aceton gefüllte Uhrenglasschale zu tauchen. Verwenden Sie feine Zangen, um die Proben in zwei Milliliter-Reaktionsröhren zu übertragen, die mit Aceton gefüllt sind. Stellen Sie die Mikrowelle 40 Sekunden lang auf 250 Watt ein und starten Sie die Mikrowelle, um die Proben zu waschen und viermal zu wiederholen.
Pipette einen Milliliter 1%Thiocarbohydrazid-Lösung in das Reaktionsrohr und setzen Sie es in die Mikrowelle. Schalten Sie die Vakuumfunktion mit zwei Minuten ein und zwei Minuten aus, iterieren für insgesamt 14 Minuten und stellen Sie sie auf 150 Watt. Starten Sie die Mikrowelle.
Waschen Sie die Probe viermal in Aceton wie zuvor. Pipetten Sie einen Milliliter 2%Osmium-Tetroxid-Lösung in das Reaktionsrohr. Legen Sie die Probe in die Mikrowelle und verwenden Sie die gleichen Mikrowelleneinstellungen wie bei der Thiocarbohydrazid.
Waschen Sie die Probe viermal in Aceton wie zuvor. Einen Milliliter 25%Harz in Aceton in das Reaktionsrohr geben und in die Mikrowelle geben. Schalten Sie die Vakuumfunktion für drei Minuten ein und stellen Sie sie auf 250 Watt ein.
Starten Sie die Mikrowelle. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um den nervus tibialis aus dem Reaktionsrohr zu entfernen und auf ein Stück Kunststofffolie zu legen. Legen Sie eine Halogenlampe in der Nähe der Proben, um das Harz zu erwärmen.
Mit einem Zahnstocher die Probe vorsichtig auf die Kunststofffolie schieben, bis kein restliches Harz mehr nachgewiesen wird. Setzen Sie die Kunststofffolie mit der Probe in den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius ein, um die Proben für mindestens 48 Stunden zu polymerisieren. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die polymerisierten Proben zusammen mit der Kunststofffolie in einer Größe auszuschneiden, die dem SEM-Stub entspricht.
Verwenden Sie einen Zahnstocher, um leitfähiges Silberharz auf die SEM-Stubs hinzuzufügen und die geschnittenen Proben daran zu befestigen. Und dann Harz um die Proben hinzufügen. Die SEM-Stubs in den Ofen stellen, um bei 60 Grad Celsius mindestens 4 Stunden oder über Nacht zu polymerisieren.
Positionieren Sie die SEM-Stubs nach der Polymerisation in einem Sputternmantel. Stellen Sie den Sputterlackturm auf 35 Milliampere und wenden Sie 10 Nanometer dicke Goldbeschichtung oder -beschichtung für eine Minute auf. Legen Sie die SEM-Stubs nach der Beschichtung in das fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop.
In dieser Studie wurde ein verbessertes Protokoll für nervus tibialis der Maus sowie C.elegans durchgeführt, um die optimale Konservierung und den Kontrast zu veranschaulichen, um 3D-Volumenaufnahmen mit einem fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop durchzuführen. Standardprotokolle leiden oft unter einem Mangel an Membrankontrast, wo das erweiterte Protokoll einen starken Membrankontrast bietet. Die Querschnittsbilder von C.elegans mit erweitertem Protokoll und Standardprotokoll zeigen einen deutlichen Unterschied.
Neben den Querschnittsbildern von nervus tibialis trägt das erweiterte Protokoll dazu bei, einen stärkeren Membrankontrast im Vergleich zum Standardprotokoll zu zeigen. Nach der Nachbearbeitung werden die Elektronenmikroskopdaten mit IMOD, einem Bildverarbeitungs- und Modellierungsprogramm, visualisiert. Der blau hervorgehobene Bereich zeigt segmentierte Axone.
Der rot hervorgehobene Bereich zeigt die Remak-Bundles. Die gelb- und orange hervorgehobenen Bereiche zeigen Myelinscheiden. Und der türkis hervorgehobene Bereich zeigt Mitochondrien.
Virtuelles Reslicing und das dreidimensionale Modell veranschaulichen die Feingewebearchitektur und helfen, ihre Funktion zu verstehen. Andere Volumen-Rasterelektronenmikroskopie-Methoden können ebenso eingesetzt werden wie serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie und Arraytomographie. Dieses Protokoll kann auch für die Transmissionselektronenmikroskopie und andere Probentypen wie Proben aus dem zentralen Nervensystem verwendet werden.
Osmiumtetroxid, Thiocarbohydrozid und Uranylacetat sind giftige Chemikalien und sollten sorgfältig verwendet werden. Das Harz ist auch schädlich und sollte mit Vorsicht verwendet werden. Persönliche Schutzausrüstungen wie Handschuhe und Labormantel sollten für das gesamte Protokoll getragen werden.
