Das hier beschriebene manuelle Tauchverfahren ist ein kostengünstiges, zuverlässiges Verfahren zur Vorbereitung von Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie. In diesem Video zeigen wir, wie sie den manuellen Kolben einrichten, Kryogen vorbereiten und manuelles Blotting und Eintauchen von EM-Gittern durchführen. Bereiten Sie die manuelle Absturzumgebung vor.
Dieses Verfahren sollte in einem Kühlraum durchgeführt werden, der bei 40 Grad Celsius mit einer Luftfeuchtigkeit von mehr als 95% gehalten wird. Wir empfehlen die Verwendung der hier gezeigten Materialien und wie im Online-Protokoll beschrieben für manuelles Abtupfen und Eintauchen. Bereiten Sie das Kryogen Dewar und den manuellen Kolben vor. Um das Kryogen Dewar zusammenzubauen, installieren Sie zuerst die Plattformbasis an der Unterseite des blauen Styropor-Dewar, um sicherzustellen, dass es flach und eben ist.
Legen Sie dann den Ethanbehälterhalter auf die Plattformbasis und setzen Sie den Messing-Ethanbehälter ein. Platzieren Sie schließlich die rotierende Netzspeicherplattform. Als nächstes suchen Sie den eintauchenden Dewar an der Basis des manuellen Kolbens.
Zentriere das Ethangefäß unterhalb des Taucharms und befestige den eintauchenden Dewar an der Basis. Um die manuelle Tauchhöhe einzustellen, befestigen Sie zuerst frisches Klebeband an der Basis des Taucharms. Als nächstes befestigen Sie eine Klemmpinzette, indem Sie das Klebeband sicher um den Taucharm und die Pinzettenbasis wickeln.
Stellen Sie sicher, dass die Pinzette fest befestigt ist, indem Sie leicht auf sie klopfen. Halten Sie den Taucharm und senken Sie die Pinzette langsam in das Messing-Ethangefäß, indem Sie das Fußpedal drücken. Stellen Sie die Position des eintauchenden Dewar so ein, dass sich die Pinzette in der Mitte des Messing-Ethangefäßes befindet.
Die Spitzen der Pinzette sollten nicht mit der Größe oder dem Boden des Messing-Ethangefäßes in Berührung kommen, um Schäden an der Pinzette und dem manuellen Kolben zu vermeiden. Sobald die Position eingestellt ist, setzen Sie den manuellen Taucharm zurück. Bereiten Sie das Kryogen vor.
Die Kryogenpräparation sollte in einem gut belüfteten Raum durchgeführt werden und die richtige persönliche Schutzausrüstung sollte jederzeit getragen werden. Zu Beginn, schlechter flüssiger Stickstoff direkt in den eintauchenden Dewar, stoppt, wenn der flüssige Stickstoffgehalt die Oberseite des Messingethangefäßes erreicht. Das System sollte kalt genug sein, um fortzufahren, nachdem der flüssige Stickstoff aufhört, heftig zu sprudeln.
Dies dauert ungefähr fünf Minuten. Ethan kommt als komprimiertes Gas und muss kondensiert werden. Um den Gasstrom für eine optimale Ethankondensation einzustellen, führen Sie die Spitze der Ethangasleitung in ein 250 mil Becherglas Wasser ein und beobachten Sie das Blubbern.
Der Gasstrom sollte einen stetigen Strom von Blasen erzeugen, der die Wasseroberfläche nicht gewaltsam stört. Um mit der Kondensation von Ethan zu beginnen, platzieren Sie die Spitze der Ethangasleitung am Boden des Messingethangefäßes. Rühren Sie langsam die Metallspitze um und beginnen Sie, das Ethan zu verflüssigen.
Sobald das Ethan zu kühlen beginnt, macht es ein hörbares Geräusch. Füllen Sie das Messing-Ethangefäß zu drei Vierteln mit flüssigem Ethan. Füllen Sie den eintauchenden Dewar mit flüssigem Stickstoff ab und stellen Sie sicher, dass er das Messing-Ethangefäß berührt, aber nicht in dieses eindringt.
Die Zugabe von flüssigem Stickstoff ist für ein gleichmäßiges Ethangefrieren notwendig. Legen Sie den Schaumstoffdeckel auf den blau abfallenden Dewar und lassen Sie das Ethan vollständig erstarren. Starten Sie den Ethangasstrom neu und legen Sie vorsichtig die Spitze der Gasleitung in das feste Ethan.
Es ist wichtig, die Spitze senkrecht in das Gefäß zu legen und Ethan am Boden abzugeben. Rühren Sie langsam die Metallspitze um, um das Ethan zu schmelzen und den Gehalt an flüssigem Ethan bis zur Oberseite des Gefäßes zu bringen. Schließen Sie den Deckel für etwa eine Minute und lassen Sie das Ethan an den Rändern des Messinggefäßes erstarren, bis zwei bis drei Millimeter festes Ethan sichtbar sind.
Das Ethan hat jetzt eine Temperatur, die ideal für das Einfrieren biologischer Proben ist. Befestigen Sie den eintauchenden Dewar vorsichtig an der Basis des manuellen Kolbens. Befestigen Sie eine Klemmpinzette, indem Sie das Klebeband sicher um den Taucharm und die Pinzettenbasis wickeln.
Halten Sie den Taucharm fest und senken Sie die Pinzette langsam in das flüssige Ethan, indem Sie das Fußpedal drücken. Stellen Sie die Position des eintauchenden Dewar so ein, dass sich die Pinzette in der Mitte des flüssigen Ethans befindet und den Kontakt mit dem festen Ethanring vermeidet. Bereiten Sie Tauchmaterialien und Zubehör vor.
Bereiten Sie das Löschpapier vor, indem Sie jedes kreisförmige Filterpapier in etwa einen Zentimeter breite Streifen schneiden. Vermeiden Sie es, die Mitte des Löschpapiers zu berühren, und entsorgen Sie die kleineren Endstücke. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Löschpapierstreifen trocken, sauber und frei von Verunreinigungen sind.
Bevor Sie eintauchen, platzieren Sie die Gitterboxen in den eintauchenden Dewar in den richtigen Schlitzen. Stellen Sie sicher, dass das Gitter unsere freie Rotation abdeckt. Bereiten Sie CryoEM-Proben durch Einfrieren vor.
Befolgen Sie aufgrund der Vielfalt der Gitter und der Netzvorbereitungen die empfohlenen Protokolle, um die Gitter hydrophil zu machen. Um die Gitter richtig zu handhaben, verwenden Sie eine saubere, trockene Klemmpinzette, um die hydrophilen Gitter am Außenring aufzunehmen. Schieben Sie die Kunststoffklemme, um das Gitter zu sichern, und klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, um sicherzustellen, dass das Gitter richtig eingespannt ist.
Tragen Sie drei Mikroliter Probe auf die Vorderseite des Gitters auf, das in der Klemmpinzette gehalten wird. Befestigen Sie die Pinzette fest am manuellen Taucharm, indem Sie das Klebeband um die Pinzettenbasis wickeln. Die Probe ist nun bereit, gelöscht und eingefroren getaucht zu werden.
Halten Sie jedes Ende eines sauberen Streifens Löschpapier zwischen Zeigefinger und Daumen. Legen Sie Ihre Hände auf den Rand des stürzenden Dewar, um eine stabile Position einzunehmen. Das Löschpapier sollte etwa einen Zentimeter von der Oberfläche des Gitters entfernt sein.
Biegen Sie das Löschpapier, bis die Mitte das Raster berührt. Es ist wichtig, dass das Löschpapier parallel zur Gitteroberfläche ist, um einen gleichmäßigen Kontakt zu ermöglichen und Gitterschäden zu vermeiden. Wenn sich die mobile Flüssigkeitsfront nicht mehr ausbreitet, beginnen Sie mit dem Zählen.
Das Gitter für fünf Sekunden abtupfen. Schnippen Sie mit den Fingern auseinander, belasten Sie das Löschpapier und entfernen Sie es schnell von der Oberfläche des Gitters. Drücken Sie gleichzeitig das Fußpedal, um den manuellen Taucharm loszulassen, und tauchen Sie die Pinzette, die das Gitter hält, in das flüssige Ethan ein.
Halten Sie das frisch gefrorene Gitter im flüssigen Ethan und lösen Sie die Pinzette vorsichtig vom manuellen Taucharm. Klemmen Sie die Pinzette vorsichtig ab, damit das Gitter abnehmbar ist. Bewegen Sie das Gitter in das Flüssigstickstoffreservoir unterhalb des Messingethangefäßes mit einer schnellen Bewegung vom Ethan zum flüssigen Stickstoff.
Platzieren Sie das Raster im Rasterfeld. Repräsentative Ergebnisse. Aus diesem Video sollten Forscher in der Lage sein, CryoEM-Gitter wie dieses mit vielen Quadraten, die dünne Schichten aus Glaskörpereis enthalten, für hochauflösende Bildgebung vorzubereiten.
Die Probenkonzentration und die Blotting-Zeit können angepasst werden, um die Partikeldichte zu optimieren. Hier demonstrieren wir den vollständigen Workflow für das Einfrieren von CryoEM-Proben mit der Blot- und Plunge-Methode. Verwenden Sie eine saubere Klemmpinzette, um ein frisches Gitter aufzunehmen und das Gitter an Ort und Stelle zu sichern.
Tragen Sie drei Mikroliter Probe auf die hydrophile Seite des Gitters auf und befestigen Sie die Pinzette am manuellen Taucharm, indem Sie das Klebeband um den Pinzettengriff wickeln. Positionieren Sie das Löschpapier parallel zur Rasteroberfläche und biegen Sie das Löschpapier vorsichtig in Richtung des Rasters, um das Blotting einzuleiten. Bewegen Sie nach der gewünschten Zeit das Löschpapier in einer Schnappbewegung von der Gitteroberfläche weg, während Sie das Fußpedal drücken, um den Taucharm freizugeben, und das Gitter in das flüssige Ethan eintauchen.
Ziehen Sie das Klebeband vorsichtig um die Pinzette und den manuellen Taucharm ab. Übertragen Sie mit einer schnellen Bewegung das Gitter schnell aus dem Ethangefäß in das Flüssigstickstoffreservoir. Legen Sie das Gitter in die Gitterspeicherbox und wickeln Sie die Pinzette zum Trocknen in ein Kim Wipe.
