Die Isolierung humaner primärer Klappendothel- und interstitieller Zellen ist entscheidend für das Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus der Pathogenese der kalzifischen Aortenklappenerkrankung. Wenn die Klappe aus dem nativen Gewebe herausgeschnitten wird, sinkt die Zelllebensfähigkeit. Wir haben also eine Methode identifiziert, die die Zelllebensfähigkeit verlängert.
Nach Erhalt der extrahierten Klappengewebeproben extrahieren Sie die Aortenwurzel und tauchen das Gewebe in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen mit steriler Spüllösung. Nach einer 10-minütigen Inkubation in einem Eiskübel auf einer Wippe die Röhrchen mit 70% Ethanol besprühen. In einer sterilen Gewebekulturhaube das Gewebe in eine Petrischale geben und zwei Klappenflügel herausschneiden.
Geben Sie ein Blättchen in eine kryogene Durchstechflasche und frieren Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff für minus 80 Grad Celsius ein. Um das Gewebe für die Färbung des Kalziumgehalts zu fixieren, schneiden Sie das zweite Blättchen von Knötchen zu Scharnier in zwei Hälften und legen Sie beide Gewebestücke in eine Kassette, die in 4% Paraformaldehyd getaucht ist. Stellen Sie dann das gesamte Setup für mindestens zwei, aber nicht länger als vier Stunden bei Raumtemperatur auf die Wippe.
Um die interstitiellen Zellen der Ventile zu isolieren, geben Sie die Packungsbeilage in ein neues 50-Milliliter-konisches Röhrchen, das eiskaltes PBS enthält, und legen Sie das Rohr für zwei Minuten bei Raumtemperatur auf eine Wippe. Nach dem Mischen wird das Gewebe in eine 60-Millimeter-Schale mit fünf bis sieben Milliliter kalter Kollagenaselösung überführt. Mit einer Pinzette beide Seiten des Blättchens drei- bis viermal in die Lösung tauchen, bevor das Gewebe im Zellkulturinkubator für fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius mit leichtem Schaukeln des Gewebes drei- bis viermal alle zwei Minuten inkubiert wird.
Am Ende der Inkubation werden zwei Milliliter Lösung aus der Schale in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Legen Sie eine Pinzette an den Knoten der Packungsbeilage und streichen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen das Gewebe von der Pinzette zum Scharnier, während Sie den Tupfer entlang der Blätte drehen. Spülen Sie nach dem Wischen den Tupfer in der Tube mit Kollagenaselösung ab und tupfen Sie die andere Seite des Gewebes ab, wie gerade gezeigt.
Wiederholen Sie nach dem Spülen den Tupfer auf beiden Seiten des Gewebes und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette und Kollagenaselösung, um alle entfernten Zellen von beiden Seiten der Blattoberfläche in die Schale zu spülen. Nach dem Spülen die gesamte Lösung aus der Schale in das Röhrchen mit den Zellen aus dem Tupfer geben und das verbleibende Klappengewebe in ein neues 15-Milliliter-Konikusröhrchen mit sieben Milliliter steriler Kollagenaselösung geben. Pelletieren Sie die isolierten Klappendothelzellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Zellpellet in drei Milliliter vaskulärem Endothelzellwachstumsmedium.
Nach einer zweiten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Wachstumsmedium zum Zählen und säen Sie die Zellen bei einer Konzentration von 5 x 10 bis fünf Zellen pro Quadratzentimeter in kollagenbeschichteten Sechs-Well-Platten, wobei das Medium alle drei bis vier Tage aufgefrischt wird. Wenn die Klappendothelzellpflaster mehr als 80% der Platte bedecken, teilen Sie die Zellen in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsrate mit einer Konzentration von 1,3 x 10 bis vier Zellen pro Quadratzentimeter. Sobald die Zellen expandiert wurden, bestätigen Sie ihren Klappendothelzellphänotyp durch Immunfluoreszenzfärbung für Klappenendothelzellmarker von Interesse.
Um die interstitiellen Zellen der Klappe zu isolieren, legen Sie das Röhrchen mit dem Tupfer zum Blättchengewebe für 12 bis 18 Stunden mit leicht geöffneter Kappe in den Zellkulturinkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine serologische Pipette, um das Gewebe vorsichtig zu dissoziieren, um die Freisetzung der interstitiellen Zellen der Klappe sicherzustellen, und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen. Fügen Sie sieben Milliliter Ventil-interstitielles Zellmedium in das Röhrchen hinzu und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem Klappen-interstitiellem Zellwachstumsmedium zum Zählen und säen Sie die Zellen bei einer Konzentration von 1,3 x 10 der vierten Zellen pro Quadratzentimeter in einer mit einer Gewebekultur behandelten Schale mit einem Durchmesser von 60 Millimetern. Nach ein bis zwei Tagen die Kulturen zweimal mit PBS waschen und den Zellen frisches Medium hinzufügen. Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 90% erreichen, waschen Sie die Kulturen zweimal mit DPBS und behandeln Sie die Zellen mit zwei bis drei Milliliter vorgewärmtem Dissoziationsreagenz für zwei bis drei Minuten bei 37 Grad Celsius.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, geben Sie die Zellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in drei bis vier Milliliter vorgewärmtem interstitiellen Ventilzellwachstumsmedium zum Zählen. Dann säen Sie die Zellen in einem Verhältnis von ein bis zwei zur ursprünglichen Kulturdichte und beurteilen Sie den Phänotyp des interstitiellen Zellwachstums der Klappe durch Immunfluoreszenzfärbung, wie gezeigt. Kalkhaltige Aortenklappenerkrankungsgewebeproben zeigen eine veränderte Morphologie mit schweren Verkalkungsknötchen im Vergleich zu kontrollunverkalkten Gewebeproben.
Wenn die Verkalkung durch Von-Kossa-Färbung beurteilt wird, wird ein dunkelbrauner oder schwarzer Niederschlag im erkrankten Blättchengewebe beobachtet. Die Kühllagerlösung stabilisiert die herausgeschnittenen Klappengewebezellen erheblich, wobei für beide Arten von wiedergewonnenen Zellen bis zu 61 Stunden nach der Ventilextraktion eine Lebensfähigkeit von etwa 40% beobachtet wird. Die morphologische Analyse der Klappendothelzellen zeigt, dass gepackte kopfsteinpflasterartige Wachstumskontaktzellen gehemmt sind, während die interstitiellen Zellen der Klappe eine spindelförmige Morphologie ähnlich der für Myofibroblasten aufweisen.
Die Immunfärbung bestätigt, dass die Mehrheit der expandierten Klappendothel- und Klappeninterstitialzellen die erwarteten gewebespezifischen Marker exprimiert. Denken Sie daran, dass ein sanftes, aber festes Abstrichen des Blättchens entscheidend für die Freisetzung der Endothelzellschicht ist und dass die nächtliche Inkubation mit Kollagenase für die Freisetzung der interstitiellen Zellpopulation aus dem Inneren des dichten Gewebes erforderlich ist. Sobald die Zelllinien etabliert sind, können sie für mechanische Studien in Bezug auf die spezifische Pathogenese von Aortenklappenerkrankungen, einschließlich Krankheitsbeginn, -progression und -behandlung, verwendet werden.
