Diese Forschung wird durch die NSF CAREER-Preis, der Hartwell-Stiftung und der American Heart Association (# 0830384N) unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Autoclave in einem überdachten Sterilisierkassettensystem die folgenden Punkte: <ol><li> Serrated Gewebe Zange - Für den Umgang mit der Broschüre Gewebe </li><li> Tissue Schere (8 cm) - Zum Beschneiden Merkblatt Gewebe und Höcker </li><li> Wattestäbchen - Zur Isolierung der Endothelschicht aus der Broschüre oder Höcker </li></ol></li><li> Machen Sie sterile Kollagenase-Lösung <ol><li> Add 4,0 g pulverisierte DMEM auf 250 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 1,11 Gramm Natriumbicarbonat. </li><li> Add (600 U / mL) 180.000 Einheiten Kollagenase. </li><li> Add 1% (3 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 270 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (30 ml) steriler Rinderfötenserum. </li></ol></li><li> Machen Sie sterile Endothelzellen Medium <ol><li> Add 6,7 Gramm Pulver DMEM auf 400 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 1,85 Gramm Natriumbicarbonat. </li><li> Add (50 U / mL) 25.000 Einheiten Heparin. </li><li> Add 1% (5 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 450 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (50 ml) steriler Rinderfötenserum. </li></ol></li><li> Machen Sie sterile interstitielle Zellmedium <ol><li> Add 13,37 g pulverisierter DMEM auf 800 mL von 18 MOhm Wasser. </li><li> Add 3,7 g Natriumbicarbonat. </li><li> Add 1% (10 ml) Penicillin / Streptomycin. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 7,2. </li><li> Bringen Sie die Lösung bis zu 900 mL. </li><li> Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter. </li><li> Fügen Sie 10% (100 ml) steriler Rinderserum. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von Herzklappenflügel <ol><li> Excise der Aortenwurzel sofort und aseptisch aus dem Herzen nach der Tötung. </li><li> Spülen Sie die Aortenwurzel von Blut mit kaltem sterilem DPBS. Es ist zwingend notwendig, um alle Blutbestandteile so schnell wie möglich zu entfernen, um VEC Tod und bakterielle Kontamination zu begrenzen. Antibiotika und Antimykotika sind zu diesem Zeitpunkt nicht empfohlen, da sie potentiell schädlich für die VEC sind. </li><li> Isolieren Klappensegel (3 pro Ventil) direkt von der Wurzel und in eine sterile 15 ml konische Röhrchen mit 12 ml kaltem DPBS gefüllt. Schütteln Sie mehrmals, um Schutt und wieder mit frischer DPBS entfernen. </li><li> Transport ins Labor auf Eis. </li><li> Bei der Ankunft im Labor, den Behälter mit dem Gewebe unter der sterile Haube. </li></ol> 3. Isolierung von Endothel <ol><li> Füllen Sie eine sterile 35mm Teller mit 3 ml kalte Collagenase-Lösung pro Ventil (3 Broschüren). </li><li> Legen Sie alle drei Segel aus dem 15-ml-Tube in die Schale mit der Collagenase-Lösung gefüllt. </li><li> Inkubieren des Gewebes für 5-10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Endothel durch Drehen einer trockenen sterilen Tupfer auf die Oberfläche des Blattes. Die Drehrichtung und Höhe der Scher-Anwendung ist entscheidend für die Reinheit Ihrer Probe. Die Rotation der Tupfer sollte in die entgegengesetzte Richtung in eine lineare Bewegung der Hand eine kontrollierte Scher werden. Diese Schere ist das, was hebt die Endothelzellen aus dem Gewebe. Der Betrag der Kraft angewendet werden sollte genug, um den Widerstand des Gewebes fühlen, aber nicht durchdringen die Basalmembran. </li><li> Gelegentlich dab den Tupfer in der Collagenase-Lösung zu verdrängen Zellen von der Spitze Fasern. Nach Abtupfen abgeschlossen ist, sollte die Textur der Endothelschicht fühlen etwas glatter als zuvor. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension / Kollagenase und Übertragung auf einen neuen sterilen 15 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 rpm für 5 Minuten auf Pellet keine isolierten Zellen und saugen Überstand. Wenn isolieren interstitiellen Zellen sowie, führen das Protokoll, während diese Zellen werden zentrifugiert werden. </li><li> Add 3 mL der endothelialen Schweine Medium, um die 15 ml Röhrchen, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Medien. Diese zweite Zentrifugation hilft Filter einige der unerwünschten Materialien wie Spitze Fasern. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml Endothelzellen vom Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem vorbeschichteten T-25 Kolben mit Kollagen (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 2-3 Tage vor dem Ändern der endothelialen Medium. Dies hilft den Zellen wieder und teilen seit der Trennung Prozess ist ziemlich hart und die Zelle liefern kann niedrig sein. Es ist wichtig, um den Durchgang Zellen in der Nähe Zusammenfluss da der Kontakt Hemmung Zelltransformation führen könnte. </li></ol> 4. Vorbereitung von 60 mm Kulturschale für Side Specific Isolation <ol><li> Linie die 60 mm Petrischalen aus Glas mit Alu-Folie (2 Glasschalen pro leaflet). Die Aluminiumfolie hilft, das Paraffin zu entfernen, so dass das Glas-Petrischale für andere Isolierungen können wiederverwendet werden. </li><li> Legen Paraffin Perlen innerhalb der Gerichte, etwa zur Hälfte gefüllt, und ein Cover für Autoklavieren. </li><li> Nach dem Autoklavieren ist vollständig und Paraffin geschmolzen ist, bewegen Sie die Schüssel Ensemble zu einem kühlen ebene Fläche. Wie das Paraffin kühlt, wird es hart, und erstellen Sie eine Schicht, die Nadelstiche unterstützen wird. </li><li> Nach 30 Minuten kann die sterilisiert Gericht dann als Isolation Kammer verwendet werden, um den Prospekt Gewebe zu fixieren. </li></ol> 5. Isolierung von Side Specific Endothelschicht <ol><li> Entfernen Sie die Blätter aus dem 15mL Rohre und am vorbereitet 60mm Kulturschale für Seite spezifische Isolierung. </li><li> Bearbeiten Sie die Packungsbeilage, so dass die ventricularis Seite nach unten auf das Paraffin Oberfläche Verlassen des fibrosa Seite ausgesetzt. Pin den Rändern des Blattes auf die endotheliale Schicht freizulegen. </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen kalten Kollagenase auf jeder (nach oben gerichteten) Endotheloberfläche und inkubieren das Gewebe für 5-10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Wie zuvor entfernen Sie vorsichtig das Endothel durch Drehen einer trockenen sterilen Tupfer auf die Oberfläche des Blattes. Die Drehrichtung und Höhe der Scher-Anwendung ist entscheidend für die Reinheit Ihrer Probe. Die Rotation der Tupfer sollte in die entgegengesetzte Richtung in eine lineare Bewegung der Hand eine kontrollierte Scher werden. Diese Schere ist das, was hebt die Endothelzellen aus dem Gewebe und sonst nichts. Der Betrag der Kraft angewendet werden sollte genug, um den Widerstand des Gewebes fühlen, aber nicht in das Gewebe eindringen. </li><li> Gelegentlich dab den Tupfer in der Collagenase-Lösung zu verdrängen Zellen von der Spitze Fasern. Nach Abtupfen abgeschlossen ist, sollte die Textur der Endothelschicht fühlen etwas glatter als zuvor. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension / Kollagenase und Übertragung auf einen neuen sterilen 15 ml Tube. Geben Seite Spezifität auf dem Etikett (Flugblätter aus dem gleichen Ventil kann zusammengefasst werden müssen). </li><li> Übertragen Sie die Flugblätter an eine neue Kulturschale, so dass die ventricularis Seite jetzt ausgesetzt ist, und wiederholen Sie die Schritte (5,3-5,6). </li><li> Sobald alle Zellsuspension / Kollagenase gesammelt, zentrifugieren bei 1000 rpm für 5 Minuten auf Pellet keine isolierten Zellen und saugen Überstand. Wenn isolieren interstitiellen Zellen sowie, führen das Protokoll, während diese Zellen werden zentrifugiert werden. </li><li> Add 3 mL der endothelialen Schweine Medium, um die Rohre, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Medien. Diese zweite Zentrifugation hilft Filter einige der unerwünschten Materialien wie Spitze Fasern. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml Endothelzellen vom Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem vorbeschichteten T-25 Kolben mit Collage (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 2-3 Tage vor dem Ändern der endothelialen Medium. Dies hilft den Zellen wieder und teilen seit der Trennung Prozess ist ziemlich hart. Wenn Sie die Ausbeute sehr gering zu sein Hinweis, in Erwägung ziehen, auf einen kleineren Kolben oder Well-Platte seit Zell-Zell-Adhäsion fördert das Zellwachstum. Denken Sie daran, um den Durchgang in der Nähe Zusammenfluss da der Kontakt Hemmung Zelltransformation führen könnte. </li></ol> 6. Isolation der interstitiellen Zellen <ol><li> Füllen Sie eine sterile 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml Kollagenase-Lösung pro Ventil (3 Broschüren). </li><li> Nach Abtupfen die Flugblätter von Endothelzellen sollten sofort in den entsprechenden 15mL Rohr mit der Collagenase-Lösung. </li><li> Inkubieren für ca. 12 bis 18 Stunden (leicht bewegen, wenn gewünscht). </li><li> Mix der abgebauten Gewebe vorsichtig mit einer serologischen Pipette bis Zellsuspension / Kollagenase wird homogenisiert. Diese Homogenisierung hilft brechen das Gewebe und lassen Sie die interstitiellen Zellen. </li><li> Centrifuge der verdauten Gewebe 5 Minuten bei 1000 rpm und saugen Sie den Überstand. </li><li> Add 5 mL interstitielle Schweine Medium, um die 15 ml Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge ein zweites Mal, und saugen Überstand. </li><li> Re-suspend der zentrifugierten Endothelzellen in 5 ml interstitiellen Schwein mittel-und Platte die Zellen in einem T-75-Kolben (Einsatz 1 Flasche pro Zentrifugenröhrchen). </li><li> Lassen Sie die Zellen wachsen mindestens 1-2 Tage vor dem Ändern der interstitiellen Zellmedium. Es wird viel mehr Gewebereste, als mit den Endothelzellen, aber das ist zu erwarten. Die Zellen sollten auch zur Konfluenz schneller als die Endothelzellen, weil der Zelle Ertrag und ihrer Natur wachsen. </li></ol> 7. Vertreter Images <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Morphologie der isolierten Zellen auf 2-3 Tage nach der Trennung. (A) VEC weisen eine typische endotheliale Morphologie und Cluster bilden, um Wachstum zu fördern. (B) VIC Morphologie ähnelt Myofibroblasten, die im Allgemeinen spindelförmig und gleichmäßig über den Kolben zu verbreiten. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Morphologie der isolierten Zellen bei Konfluenz. (A) VEC weisen eine typische endotheliale Morphologie, die im Allgemeinen mit Kopfsteinpflaster und Wachstum Kontakt gehemmt. (B) VIC Morphologie ähnelt Myofibroblasten, die im Allgemeinen spindelförmig und nicht Wachstum Kontakt gehemmt. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Die Funktion Eigenschaften der isolierten Zellen 6. (A) VEC sind mit hoher acetylierte LDL-Aufnahme (rot) verbunden. (B) VIC sind mit niedrigem acetyliertes LDL-Aufnahme verbunden sind. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Cellular Marker isoliert Zellen 6. (A) VEC-Phänotyp ist eine positive Färbung für Von-Willebrand-Faktor (grün), blau (Kernen) beigetragen. (B) VIC Phänotyp ist, negative Färbung für Von-Willebrand-Faktor beigetragen. <img src="/files/ftp_upload/2158/2158fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Cellular Marker der isolierten Zellen. (A) VEC-Phänotyp ist, negative Färbung für alpha SMA (grün), blau (Kernen) beigetragen. (B) VIC Phänotyp ist eine positive Färbung für alpha SMA beigetragen. <table border="1"><tbody><tr><td> Dissoziation Agenten </td><td> Dissoziation Technik </td><td> Zell-Sammlung </td><td> Zellmenge </td><td> Zelle Reinheit </td><td> Kontamination </td></tr><tr><td> EDTA (3mm) ohne CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. vor CaCl 2-Zugabe </td><td> 20, 60, 120 min. vor Abholung </td><td> - </td><td> + / - </td><td> + + + </td></tr><tr><td> EDTA (6mm), ohne CaCl 2 </td><td> 5, 20, 60 min. vor CaCl 2-Zugabe </td><td> 20, 60, 120 min. vor Abholung </td><td> + / - </td><td> + </td><td> + + + </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA (0,5 g / L) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> + </td><td> + </td><td> + + </td></tr><tr><td> Collagenase II (300 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> -, +, + + </td><td> -, + +, + </td><td> + </td></tr><tr><td> Collagenase II (600 U / mL) </td><td> 5, 10, 15 min. vor Deaktivierung </td><td> Medium gesammelt sofort </td><td> + + + + + + </td><td> + +, + +, - </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Ergebnisse der vorläufigen valvular Endothelzellen isoliert Protokolle.

<ol>
	<li>Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+truncus+arteriosus+of+the+chick+embryo+heart:+the+formation+and+migration+of+mesenchymal+tissue.">Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue.</a> Am J Anat. 154, 545-556 (1979).</li><li>Johnson, C. M., Fass, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+A+relative+deficiency+of+fibronectin+synthesis+in+vitro.">Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro.</a> Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).</li><li>Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calf+cardiac+valvular+endothelial+cells+in+culture:+production+of+glycosaminoglycans,+prostacyclin+and+fibronectin.">Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).</li><li>Cheunyg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).</li><li>Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro.">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).</li><li>Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+heterogeneity+of+endothelial+phenotypes+correlates+with+side-specific+vulnerability+to+calcification+in+normal+porcine+aortic+valves.">Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves.</a> Circ Res. 96, 792-799 (2005).</li><li>Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Profiles+of+Valvular+and+Vascular+Endothelial+Cells+Reveal+Phenotypic+Differences:+Influence+of+Shear+Stress.">Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).</li><li>Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pulmonary+Valve+Progenitor+Cells+Exhibit+Endothelial/Mesenchymal+Plasticity+in+Response+to+Vascular+Endothelial+Growth+Factor-A+and+Transforming+Growth+Factor-&#946;2.">Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-&#946;2.</a> Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Shi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+endothelial+progenitor+cells+are+derived+from+monocyte/macrophages+and+secrete+angiogenic+growth+factors.">Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.</a> Circulation. 107, 1164-1169 (2003).</li></ol>

Ein Verständnis der Herzklappen Biologie hat durch technische Schwierigkeiten Isolierung und Kultivierung reine Populationen valvular Endothelzellen beeinträchtigt wurde. Typische Isolierung Techniken beinhalten enzymatische Verdauung der zugrunde liegenden basalen Matrix oder chemische Spaltung von Endothelzellen Klebeverbindungen 2,3. Vorläufige Isolation Experimente wurden qualitativ durch unterschiedliche Dissoziation Agenten und Inkubationszeiten untersucht. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, ...

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		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s Modified Eagle Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>50-103-PB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>26140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H4784-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical</td>
<td>LS004176</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21300-058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Tail Collagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Critical Swabs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89031-270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>55761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 Flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>353136</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 Well Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>353047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 mm Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>25384-092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60x15 Glass Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>89000-310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraffin Embedding Wax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19304-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Precision Glide Needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>305165</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1L Nalgene Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>73520-986</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11023-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FSC Tweezers #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11295-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of valvular endothelial cells

Herzklappen sind allein verantwortlich für unidirektionale Blutfluss durch das Herz-Kreislauf-System. Diese dünne, faserige Gewebe zu erheblichen mechanischen Belastungen, wie sie öffnen und schließen mehrere Milliarden Mal im Lauf ihres Lebens ausgesetzt. Die unglaubliche Ausdauer dieser Gewebe ist aufgrund der ansässigen valvular Endothelzellen (VEC) und interstitiellen Zellen (VIC), die ständig repariert und neu zu gestalten als Reaktion auf lokale mechanische und biologische Signale. Erst vor kurzem haben wir begonnen, das einzigartige Verhalten dieser Zellen, für die in vitro Experimente eine wichtige Rolle gespielt hat, zu verstehen. Besonders herausfordernd ist die Isolierung und Kultivierung von VEC. Besondere Sorgfalt verwendet ab dem Zeitpunkt der Gewebe vom Host bis zur endgültigen Beschichtung entfernt werden. Hier präsentieren wir Protokolle zur direkten Isolierung, Seite spezifische Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reinen Populationen von VEC. Wir verwenden enzymatische Verdauung durch eine sanfte Tupfer Schabetechnik nur oberflächlichen Zellen verdrängen gefolgt. Diese Zellen werden dann in ein Röhrchen gesammelt und zentrifugiert zu einem Pellet. Das Pellet wird dann resuspendiert und in Kulturflaschen vorbeschichtet mit Kollagen I-Matrix. VEC-Phänotyp wird durch den Kontakt bestätigt gehemmt Wachstum und die Expression von endothelialen spezifische Marker wie PECAM1 (CD31), Von-Willebrand-Faktor (vWF) und negative Expression von alpha-smooth muscle actin (α-SMA). Die funktionellen Eigenschaften von VEC sind mit hoher acetylierte LDL assoziiert. Im Gegensatz zu vaskulären Endothelzellen, haben VEC die einzigartige Fähigkeit, sich in Mesenchym, was normalerweise während der Embryonalentwicklung Ventil Formation 1 zu transformieren. Dies kann auch während der deutlich längeren Beitrag konfluent in vitro-Kultur auftreten, so ist darauf zu, um den Durchgang an oder nahe Einmündung erfolgen. Nach VEC Isolation, können reine Populationen von VIC dann leicht erworben werden.

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Isolation of Valvular Endothelial Cells

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.2K Aufrufe.  Cornell University. Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Serie: Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...