The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

HINWEIS: Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Iowa zugelassen. 1. Langfristige Bezeichnung Mäuse Mit Tätowieren den Fußballen <ol><li> Immobilisieren eine Pfote mit der Pfote Pads (Fußsohle) mit Blick auf den Experimentator. Halten Sie die Pfote mit dem Daumen und dem Zeigefinger. Achten Sie darauf, die Pfote zu kneifen. HINWEIS: Stabil Immobilisierung ist darauf zu achten, dass die Tattoo-Pigment in die Dermis der Pfote Pads platziert und damit dauerhaft 7. </li><li> Wischen Sie die Pfotenpolster mit 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm oder Tupfer. </li><li> Bewerben Hautöl zu einem Wattestäbchen, und drücken Sie vorsichtig die Spitze gegen die Oberfläche der Pfote Pad mehrmals. Verwenden Sie nur eine kleine Menge von Hautöl; wenn sie in großen Mengen, es wird die Tätowierpigment vom Erreichen der Haut zu verhindern. </li><li> Tauchen Sie die Spitzen der Tattoo-Nadeln in der Tätowierfarbe gerade vorzum Tätowieren. Verwenden Sie saubere, keimfreie und scharfe Tätowiernadeln, um die Schmerzen und die Möglichkeit einer Infektion zu verringern, und auch um die Tätowierung Effizienz zu steigern. </li><li> Während die Pfotenpolster Oberfläche mit der Haut Öl bedeckt ist, drücken Sie die Tattoo-Nadelspitzen vertikal und leicht auf der Haut in der Mitte der Pfote Pad, und spritzen die Tinte mehrere Male. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Informationen über elektrische Tätowierung-System. </li><li> Spray 70% Ethanol auf einem Gaze-Schwamm, drücken Sie sie vorsichtig gegen die Pfote zu zusätzlichen Tätowierungspigmente auf der Hautoberfläche zu entfernen, und überprüfen Sie die Qualität der Tätowierung. Prüfen, ob die Mitte des Pfotenpolster hat einen dunklen, runden Fleck, die von der normalen Pigmentierung der Haut unterscheidet. Wenn das Tattoo nicht dunkel oder groß genug für die einfache Anzeige, wiederholen Sie die vorherigen Schritte Tätowieren. </li></ol> 2. Genotypisierung Neugeborene Mäuse mit einem schnellen PCR Genotypisierung Kit <ol><li> Desinfizieren des distalen Endes eines Maus Schwanz mit 70% Ethanol, schneiden 5 mm oder weniger der Schwanzkippen und sie auf einem Rohr aus einem 8er Streifen des Typs, für die PCR verwendet. Verwenden Sie eine unbenutzte Rasierklinge für jeden Welpen um eine Kreuzkontamination zwischen Proben zu vermeiden. Alternativ dazu können eine Schere, aber in diesem Fall sorgfältig durch das verbleibende Gewebe an die Klingen unter Verwendung von 70% Ethanol. Prüfen Sie, ob Blutungen. Wenn die Blutung auf, Druck auf die ausgeschnittenen Bereich des Schwanzes mit einem Gaze-Schwamm, bis Blutung aufgehört hat. </li><li> Fügen Sie 200 ul der DNA-Extraktionslösung zu jedem PCR-Röhrchen mit einer Probe. Siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für seine Zusammensetzung und Informationen über das Set. </li><li> Das Röhrchen Streifen in einen PCR-Thermocycler und Beginn der DNA-Extraktion, mit dem folgenden Programm: 1 Zyklus bei 55 ° C für 10 min, 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 Minuten, und Halten bei 4 ° C. Anmerkung: Dies ist das gleiche PCR-Thermocycler, die später für die PCR verwendet. </li><li> Nachdem die DNA-Extraktion beendet ist, entfernen Sie das Rohr Streifen aus dem Thermocycler einnd invertieren 5mal. </li><li> Überweisung 4 ul der Lösung (DNA-Extrakt) jeder Probe auf einer unbenutzten Röhre eines 8-Röhrenstreifen und mischen mit: 10 ul 2X PCR Ready Mix II, 2 ul vorne und Reverse-Primer gemischt (bei empfohlen 0,5 uM, siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Sequenzen) und 4 ul Nuklease-freies H 2 O, für jede Probe. Spin kurz (zB 3 sec) mit einer Tischzentrifuge. Halten Sie das Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten außer bei der Handhabung. </li><li> Führen Temperaturwechsel. Sehen Tabelle der Materialien / Ausrüstung für die thermische Programm. </li><li> Detektieren die amplifizierte DNA-Produkte. Laden die gesamte Reaktionslösung aus der PCR (20 &amp; mgr; l), die direkt in ein Bohrloch eines Agarosegels. Laden Sie die Molekulargewichtsmarker in eine separate gut. Anwenden eines elektrischen Feldes. </li><li> Erwerben Fluoreszenzbilder der Banden unter UV-Licht. </li></ol> 3. Primär Kultur der Maus Gehirn Neurons auf Gliazellen Feeder Layer- HINWEIS: Die Vorgehensweisen zum Gehirn Dissektion und Dissoziation Zelle (3,1) sind, die für alle nachfolgenden Verfahren. Die Verfahren für die Maus Gliakulturen (3.2), Ratte Gliakulturen (3.3) und eine Maus neuronalen Kulturen (3.4) werden separat danach beschrieben. <ol><li> Gehirn Dissection and Cellular Dissocaiation <ol><li> Opfere eine Maus oder Ratte Welpen durch Enthauptung, schnell zu entfernen, das Gehirn, und legen Sie sie in Hanks-Lösung (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung) + 20% fötalem Rinderserum (FBS) in einem 35-mm-Schale (auf Eis gehalten). </li><li> Schneiden Sie das Gehirn durch die Mittellinie in zwei Hemisphären. Entfernen der Region von Interesse (zB Großhirnrinde, Striatum und Hippocampus) von jeder Hemisphäre des Gehirns. Entfernen Sie die Hirnhaut und großen Blutgefäßen von der Oberfläche. Schneiden Sie die Hirnregion, in 4-10 dünne Scheiben mit einem Skalpell. </li><li> Spülen Sie die Hirnschnitten in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen, einmal Witzh Hanks-Lösung + 20% FBS, dann 3-mal mit der Hanks-Lösung (dh ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Zu spülen, fügen Sie 5-10 ml Lösung, lassen Sie den Hirnschnitten am Boden des Röhrchens zu regeln, saugen die Lösung von oben, und fügen Sie eine frische Lösung. Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der Lösung. </li><li> Filter 2 ml der Trypsin-haltigen Aufschlußlösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in die Röhrchen mit den Gehirnschnitten. Lassen Sie die Trypsinierung fahren Sie für 13 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Neutralisieren die Trypsinlösung zuerst durch Absaugen meiste davon und dann durch Zugabe von 7-10 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C). </li><li> Spülen der Gehirnscheiben, zweimal mit Hanks-Lösung + 20% FBS, und dann dreimal mit der Hanks-Lösung (ohne Serum) (alle bei 4 ° C). Beenden Sie den Spülvorgang durch Absaugen der solutIonen. </li><li> Filter 2 ml der Dissoziationslösung (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung) unter Verwendung einer 3 ml Spritze und einer 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, und geben das Filtrat direkt in der Röhre mit den Gehirnschnitten. </li><li> Mechanisch distanzieren die Zellen durch leichtes Verreiben 10-20 mal, bis sichtbare Gewebestücke verschwinden. Verwenden Sie ein Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette und vermeiden Sie Luftblasen beim Zerreiben. </li><li> Warten Sie 3 min für Kleinteile, sich niederzulassen. </li><li> Übertragen der Mehrzahl der Lösung (~ 1,5 ml, so dass einige Lösung an der Unterseite) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, das 3 ml Hanks-Lösung + 20% FBS-Lösung (4 ° C) enthält, wobei die baumwollsteckt, Feuer- polierten Pasteurpipette. Die gesamte Lösung nicht übertragen, da die Aufnahme eines Sediment am Boden führt typischerweise zu einer Verschlechterung der Kultur. </li><li> Zentrifuge für 13 Minuten bei ~ 185 g (~ 1100 rpm) bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand vorsichtig,1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium (37 ° C) zu dem Pellet und resuspendieren durch vorsichtiges Pipettieren mehrmals mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. HINWEIS: Drei verschiedene Arten von Plattenmedien sind für verschiedene Kultur zwecke Plattierungsmedium-1 für Maus Gliazellen Plattierungsmedium-2 für Maus-Neuronen und Plattierungsmedium-3 Rattenneuronen und Gliazellen (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzungen) . </li><li> Nehmen Sie 10 ul der Zellsuspension, mischen Sie es mit 10 ul 0,4% Trypanblau-Lösung, und messen die Dichte der lebenden Zellen, entweder mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers. </li></ol></li><li> Maus Gliakulturen <ol><li> Waschen Sie die Deckgläser, zur Schaffung gesunder Kulturen von Mauszellen. <ol><li> Tauchen Deckgläser (rund, Durchmesser 12 mm) in 70% iger Salpetersäure in einer Glaspetrischale. Vor Licht mit Aluminiumfolie, und legen Sie sie auf einem Rundschüttler O / N. </li><li> Spülen Sie die Glas coverslips in der Petrischale mindestens dreimal mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie sie in destilliertem Wasser. Die Schale auf einem Orbitalschüttler O / N. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser auf einem Whatman 150 mm Filterpapier in der biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Autoklavieren Sie die Deckgläser. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in 24-Well-Kulturschale. </li></ol></li><li> Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2. </li><li> Erhalten die Gehirnzellen der Maus Welpen gemäß Schritt 3.1. HINWEIS: Die Verwendung der Großhirnrinde ist typisch für die Vorbereitung der Maus Glia-Feeder-Schicht. Aber auch andere Gehirnregionen, wie Hippocampus und Striatum, wird nach dem Einstellen der Zelldichte aufgrund von unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten. </li><li> Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-1 an die Zellsuspension (ca. 1 ml). Zum Vorwärmen Kulturmedien, legen Sie die Lösung in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, umermöglichen, dass die Temperatur und der pH-Wert zu stabilisieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein unbeschichtetes T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank. </li><li> An 1 Tag in vitro (DIV), spülen Sie die kultivierten Zellen in der T25-Flasche zweimal mit Plattierungsmedium-1 (4 ° C). Stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator. Führen Spülen durch Ansaugen des Mediums in den Kolben vollständig mit einer Pasteur-Pipette, indem ~ 5 ml frisches Medium und leichtes Kippen der Kolben mehrmals in einer Wirbelbewegung. </li><li> Bei 6-9 DIV, (dh einen Tag vor der Trypsinisierung und Plattieren auf Deckgläsern in Schritten 3.2.8-3.2.13), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials mit extrazellulären Matrixproteinen (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung für Kommentare das Beschichtungsmaterial) auf die Deckgläser in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank. </li><li> Bei 7-10 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent (räumlich kontinuierlich), trypsinieren ihnen. <ol><li> Die Flasche einmal spülen, durch Ansaugen die gesamte Lösung im Kolben und Hinzufügen von ~ 13 ml Hanks-Lösung (4 ° C) vorsichtig den Kolben kippen mehrmals in einer Wirbelbewegung, und saugen Sie die Lösung vollständig. </li><li> In 40 ul DNase-Lösung (Endkonzentration 750 Einheiten / ml) bis 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die heiße Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter, und fügen Sie das Filtrat direkt zu den Zellen in der Flasche. </li><li> Lassen Sie die Trypsinisierung gehen für 13 min bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Neutralisierung der Trypsinlösung durch Zugabe von 2 ml 100% FBS (4 ° C) in den Kolben. </li><li> Übertragen Sie die Zellen mit Trypsin in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit einem 5- bis 10-ml-Pipette ~ 4 ml Hanks-Lösung + 20% FBS (4 ° C), Zentrifuge bei ~ 185 g und 4 ° C für 13 min , und saugen Sie den Überstand. </li></ol></li><li> Das Pellet in 1 ml vorge warmed Plattierungsmedium-1. </li><li> Messung der Dichte der Zellen entsprechend Schritt 3.1.13. </li><li> Absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern, und Platten ~ 50 &amp; mgr; l der resuspendierten Gliazellen auf Deckgläsern. HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator. </li><li> 20-60 Minuten später, 1 ml vorgewärmtes Plattierungsmedium-1 in jede Vertiefung, und die Schale wieder in den Inkubator. Anmerkung: Während das Plattenmedium zugegeben wird, wird es hilfreich sein, eine andere Pipette zu verwenden, um nach unten drücken, der den Umfang des Deckplättchens (wo es keine plattierten Zellen), so daß das Deckglas nicht in dem Medium schwimmt. </li><li> Bei 1 DIV der Glia-Feeder-Schicht (dh auf dem Deckglas), ersetzen Sie das Medium mit 1 ml vorgewärmten Plattierungsmedium-1, durch Ansaugen die gesamte Lösung in einem gut und dann mit frischem Medium zu füllen. </li><li> Bei 2-3 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die celLS 80-100% konfluent, fügen mitotischen Inhibitor (10 &amp; mgr; l einer Mischung aus 5-Fluor-2&#39;-deoxyuridin + Uridin; Endkonzentrationen von 81,2 und 204,8 &amp; mgr; M) in jede Vertiefung, um die DNA-Replikation und somit zu hemmen drücken Glia-Zellen-Proliferation. </li><li> 7-9 DIV, wenn die Zellen 90-100% konfluent (1-2 h vor dem Plattieren Neuronen auf der glial feeder layer) Ersetzen des Kulturmediums mit vorgewärmter Plattierungsmedium-2 (37 ° C). HINWEIS: Die Neuronen werden am selben Tag plattiert werden, unter Anwendung von Schritt 3.4. </li></ol></li><li> Rat Gliakulturen <ol><li> Coat eine T25 Kulturflasche mit dem gleichen Beschichtungsmaterial. Hinweis: Dies ist für die spätere Entfernung der nicht-adhärenten Zellen in Schritt 3.3.5 notwendig. <ol><li> 2,0 ml des Beschichtungsmaterials in den Kolben, und setzen Sie den Kolben in der Kulturbrutschrank. </li><li> Nach 2-3 Stunden, saugen Sie den Beschichtungsmaterial vollständig, so dass der Boden der Flasche trocken wird. </li></ol></li><li> Besorgen Sie sich die Zellenaus den jungen Ratten, gemäß dem Schritt 3.1. HINWEIS: Die Region CA3-CA1 des Hippocampus wird zur Herstellung der Ratten glial Nährschicht verwendet. Aber auch andere Gehirnregionen, wie dem cerebralen Cortex und Striatum wird bereinigt um Unterschiede in der Zelldichte aufgrund der unterschiedlichen Anzahlen und Ausbeuten von Zellen aus verschiedenen Regionen arbeiten. </li><li> Hinzufügen ~ 4 ml vorgewärmtem Plattierungsmedium-3 zu der Zellsuspension (ca. 1 ml). </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in die beschichteten T25 Kulturflasche, mit dem Baumwoll gesteckt, feuerpolierten Pasteur-Pipette. Der Kolben wird in der Kulturbrutschrank (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C). </li><li> Bei 2-3 DIV, wenn die Zellen 20-40% konfluent waren, entfernen nicht adhärenten oder schwach haftenden Zellen, durch Schließen des Deckels dicht unter Schütteln heftig ~ 10 mal, Absaugen der Lösung und Zugabe von 4-5 ml des Überzuges Medium-3 (bei 4 ° C). Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Untersuchen Sie die kultivierten Zellen über die gesamte Kolbenboden (zBVerwendung von Phasenkontrastmikroskop) zu bestätigen, dass die, die neuronale (dh solche, bei denen der äußere Rand des Zellenkörpers wird phasen hell dargestellt) vollständig entfernt werden. Wiederholen den Vorgang so oft wie nötig, um diese Zellen zu entfernen, und anschließend wurde der Kolben zurück in den Inkubator. HINWEIS: Die Festigkeit und die Gesamtzahl der &quot;Shakes&quot; erforderlich ist, kann zwischen den einzelnen Experimentatoren abweichen. Das Wichtigste ist, nicht auf die Gesamtzahl der Shakes auf eine festgelegte Anzahl zu halten, aber um zu bestätigen, dass die Neuronen-ähnliche Zellen eliminiert werden. </li><li> Bei 6-8 DIV, wenn Zellen sind 90-100% konfluent, Durchgang die Gliazellen durch Trypsinierung sie wie in Schritt 3.2.8. </li><li> Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), 10 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), übertragen die trypsiniert Zellen einem unbeschichteten T75-Kolben und Kultur sie Inkubator. HINWEIS: Ratte Gliazellen zweimal passagiert werden; im Gegensatz die Maus Gliazellen are agiert nur einmal, weil sie ungesund nach mehreren Durchgängen werden. Ratten-Gliazellen in T75-Flaschen, die nicht mit irgendeinem Überzugsmaterial überzogen werden passagiert werden. Die Beschichtung ermöglicht Ratte Gliazellen, zu schnell zu wachsen und liefern viele Geißelzellen (vermeintlichen Ependymzellen), die später die neuronale Kulturbedingungen verschlechtern wird. </li><li> Bei 17 bis 19 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 11 Tage nach der Passage und einen Tag vor Trypsinierung und Ausplattieren auf Deckgläser durch Schritte 3.3.9-3.3.14), legen Sie 100 ul des Beschichtungsmaterials auf ungewaschenen Deckgläser ( rund, Durchmesser 12 mm) in der Kulturschale und legen Sie die Kulturschale in der Kulturbrutschrank. HINWEIS: Bei Ratten Gliakulturen eine Differenz nicht in den Kulturergebnisse mit oder ohne Waschen der Deck bemerkt. </li><li> Bei 18-20 DIV glialer Kultur in einem Kolben (dh 12 Tage nach Passagieren), bereiten Sie die Glia-Feeder-Schicht durch Trypsinisierung der kultivierten Zellen, nach step 3.2.8. </li><li> Während der Zentrifugation absaugen Beschichtungsmaterial vollständig von den Deckgläsern. </li><li> Nach der Zentrifugation das Pellet in 1 ml Plattierungsmedium-3 (4 ° C), und Messen der Zelldichte, gemäß Schritt 3.1.13. </li><li> Stellen Sie den glial Dichte bis 10 4 lebenden Zellen / ml, und die Platte 100 ul des glialen Zellsuspension auf die beschichteten Glasplättchen. HINWEIS: Diese Zellen werden die Glia-Feeder-Schicht herzustellen. </li><li> Legen Sie die Kulturschale mit Deckgläsern in den Inkubator für 20-60 min. </li><li> 1 ml der Plattierungsmedium-3 (4 ° C) in jede Vertiefung und die Schale wieder in den Inkubator. </li><li> Bei 3-4 DIV der Glia-Feeder-Schicht, wenn die Zellen auf dem Deckglas sind 40-80% konfluent, 1 ml der vorgewärmten Nährmedium (siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung), die Cytosin-β-D-arabinofuranosid enthält ( AraC Endkonzentration von 4 &amp; mgr; M) bis glial-Zellproliferation anzuhalten. Platte Neurons 7-9 DIV der glial-Feeder-Schicht, wenn die Zellen 60-80% konfluent waren, unter Anwendung von Schritt 3.4. </li></ol></li><li> Maus Neuronale Kulturen <ol><li> Label und Genotyp neugeborenen Mäusen nach Schritt 1 und 2. </li><li> Verwenden Sie die Maus Welpen für Schritt 3.1. </li><li> Einstellung der Intensität des Lebendzellsuspension auf ~ 2,0 × 10 5 Zellen / ml mit vorgewärmten Plattierungsmedium-2 für die Beschichtung auf der Maus Gliazellen oder Verwendung Plattierungsmedium-3 für die Plattierung auf Ratten-Gliazellen. </li><li> Platte die Zellen auf der Glia-Feeder-Schicht, indem Sie vorsichtig Zugabe der Zellsuspension in das Kulturmedium von jedem gut. Hinweis: Das Volumen der Zellsuspension zugegeben werden durch die Zielzahl der Zellen in einer Kulturvertiefung bestimmt werden. Zum Beispiel Platte ~ 60 ul Zellsuspension zu 12.000 Zellen / Vertiefung zu erzielen. </li><li> Beachten Sie, dass keine Lösung Änderungen sind erforderlich, nachdem die Neuronen überzogen. Seien Sie vorsichtig, um die Verdampfung der Lösung aus den Vertiefungen vermeiden, im Laufe der Kultur, durch Befeuchten des Inneren of der Kulturbrutschrank. </li></ol></li></ol>

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Die hier vorgestellte Protokoll enthält Verfahren für die Tätowierung zur Kennzeichnung / Identifizierung Mäusen, zur Genotypisierung Mäuse aus Schwanzspitzen und zur Kultivierung von Maus Gehirnneuronen bei geringer Dichte. In einer Runde von Experimenten mit 6-8 Welpen, diese Verfahren benötigen in der Regel ~ 0,5 Stunden, ca. 4 h und ca. 2 h zugeführt, an insgesamt 6-7 Stunden. Dies macht es praktisch für eine einzige Versuchsleiter, alle aus der Zeit der Jungtiere &quot;die Geburtsstunde der Beschichtung von...

Nagetiermodellen von genetischen Krankheiten als nützlich bei der Schaffung der physiologischen Funktionen von normalen Proteinen und Nukleinsäuren sowie die pathophysiologischen Folgen von Defekten in diesen erwiesen. Beispiele umfassen Mäuse für Proteine ​​in zelluläre Schlüsselfunktionen beteiligt defizient sowie Mausmodelle von Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit. Allerdings können bestimmte genetische Manipulationen an neonatale Letalität kurz oder ein paar Tage nach der Geburt führen. In diesen Fällen sind die primären Zellkulturen ein wichtiges Werkzeug, da lebende Zellen können aus den embryonalen oder neonatalen Welpen vor dem Tod erhalten werden, können sie für wenigstens einige Wochen in vitro gehalten werden, und während dieser Zeit frühe neuronale Entwicklung kann gefolgt werden biochemische, morphologische und funktionelle Experimente. Für die Primärkulturen, kann es vorteilhaft sein, die Nervenzellen bei niedriger Dichte Platte; dies macht es möglich, die einzelnen Zellkörper, Dendriten, Axonen und Nervenwellen termi visualisierennale mit hoher räumlicher Auflösung. Jedoch das Überleben und die Differenzierung von Neuronen bei niedriger Dichte erfordert typischerweise, dass sie auf einer glialen Feeder-Schicht plattiert sind, co-kultiviert mit Glia-Zellen in Abwesenheit von physikalischen Kontakt mit ihnen oder in einem Medium kultiviert, durch Glia 1 konditioniert. Die Einrichtung von niedriger Dichte neuronalen Kulturen auf Gliazellen Feeder-Schichten kann abhängig von schnellen und zuverlässigen Genotypisierung voraus sein - innerhalb von ein paar Stunden im Gegensatz zu ein paar Tagen. Geschwindigkeit ist besonders wichtig, wenn das neuronale Genotyp muss derjenigen einer glialen Nährschicht vorher vorbereitet angepaßt werden. Als ein praktisches Beispiel kann es notwendig sein, zu entscheiden, welche backs dem Genotyp in Erzeugen Kulturen zu verwenden, um die Effizienz eines Experiments zu optimieren. Hier zeigen wir die Arbeitsprotokoll, das für die schnelle, vereinfachte und zuverlässige Maus Genotypisierung in früheren Publikationen 2-6 verwendet wurde. Mäuseschwänzen undein im Handel erhältlicher Kit verwendet. Dieses Protokoll umfasst einstufigen Extraktion von Nukleinsäuren aus dem Gewebe und erfordert weder eine Nukleinsäure-Reinigungsschritt noch der Einsatz eines Aufhebungspuffer (&quot;Stop-Lösung&quot;). Die Zuverlässigkeit dieser Genotypisierungsverfahrens wird erreicht, indem die Ergebnisse einer Reihe von Tests, wenn Unterschiede in Bezug auf die Ausgangsmenge der Proben, dem Alter der Tiere und die Länge der PCR-Produkte eingebracht dargestellt. Dieses Kit bietet die Vorteile der automatischen Extraktion und Zuverlässigkeit. Aus Gründen der als umfassende, ist die Verwendung von Tätowieren für langfristige Identifikations der genotypisiert Mäusen demonstriert. Tätowieren wird durch Anlegen Tätowierfarbe in die Dermis der Haut (unter der Epidermis) erreicht 7. Es wird ein Verfahren für die Tätowierung Fußballen von Neugeborenen oder 1 Tag alten Mäusen beschrieben, obwohl Tätowierungen kann auch auf andere Teile des Körpers, wie zum Beispiel Schwänze und Zehen angewendet werden, und animals aller Altersgruppen. Darüber hinaus werden Verfahren für die Beschichtung und das Kultivieren der Maus-Neuronen bei einer niedrigen Dichte nachgewiesen werden, basierend auf einer optimierten Herstellung von verschiedenen Arten von glial-Feeder-Schichten 2,8. Wir verwenden einen genetischen Mausmodell des geerbten neurologische Erkrankung DYT1 Dystonie - eine autosomal-dominante Bewegungsstörung durch eine Mutation im Gen verursacht TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. Das codierte Protein, Torsina, gehört zu den &quot;ATPasen mit verschiedenen Zellaktivitäten verbunden&quot; (AAA +) Proteinfamilie, deren Mitglieder in der Regel durchführen Chaperon-ähnliche Funktionen, Unterstützung bei: Proteinentfaltung, Protein-Komplex Demontage, Membrantransport und Vesikelfusion 10-13. Die Mutation führt zu einer in-frame-Deletion eines Codons, das für Glutaminsäure, und kann eine Manifestation der &quot;early-onset generali isoliert Dystonie &#39;14,15 führen. Jedoch ist die Pfadophysiological Mechanismen für diese Erkrankung verantwortlich bleiben weitgehend unverstanden. In einer Knock-in-Maus-Modell ist der mutierte Allel Tor1a tm2Wtd, im folgenden als Tor1a AE erwähnt. Heterozygote AE-Torsina knock-in Mäuse sind lebensfähig und genetisch imitieren menschlichen Patienten mit DYT1 Dystonie, während homozygote Knock-in Mäusen nach der Geburt sterben, 16,17, mit der Latenzzeit zu postnatalen Tod von genetischen Hintergrund 18 betroffen. Der frühe Tod von homozygoten Knockout-Mäusen erforderlich, daß sowohl die Genotypisierung von Tieren und die Einrichtung von neuronalen Kulturen schnell abgeschlossen. Als weiteres Beispiel für die Genotypisierung Tfap2a (Transkriptionsfaktor AP-2α, Aktivieren Enhancer bindendes Protein 2α) verwendet. Das durch dieses Gen kodierte Protein ist in der Regulierung mehrerer zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Differenzierung, Überleben und Apoptose 19 wichtig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENTS - tattooing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Cleanser</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NMCR3</td>
			<td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Machine Drying Agent</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NDAR4</td>
			<td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Tattoo Black Pigment</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NBP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep Applicator</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSPA1</td>
			<td>Q-tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Prep solution</td>
			<td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td>
			<td>NSP01</td>
			<td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &#8211; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &#8211; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - genotyping</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X PCR Ready Mix II</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution A</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Lysis Solution B</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>G2001-100</td>
			<td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &#181;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &#181;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH 3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td>
			<td>rpi</td>
			<td>A20090-500&#160;</td>
			<td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &#181;g/ml gel volume).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7637-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG104-96RS&#160;</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2020-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &#181;l</td>
			<td>Dot Scientific Inc</td>
			<td>UG2812-RS</td>
			<td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1001</td>
			<td>We use either of these three molecular weight markers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td>
			<td>EZ BioResearch LLC</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10488-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, Ultraflux Individual&#160;</td>
			<td>rpi</td>
			<td>145660</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>rpi</td>
			<td>T60040-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tor1a gene in &#916;E-torsinA knock-in mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#39; (forward) and 5&#39;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#39; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&#181;l (~0.16 &#181;M) (reference 2).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#39; (forward), 5&#39;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#39; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#39; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#39;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#39; (forward), 5&#39;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#39; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &#181;M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503-100MG</td>
			<td>See comments section of uridine for more information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess (cell number counter) chamber slides</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>C10312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6645-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>15230-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527-200KU</td>
			<td>Stock solution is prepared at 1500 units/20 &#956;l = 75000 units/ml in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10569-010, 500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &#181;m Pore Size</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&#8211;0.12 mm, No. 0</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>633017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX-I</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387-10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, &#8805;99.5% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-100 ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4&#8226;(7H2O), BioUltra, &#8805;99.5% (Fluka)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20&#176;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4&#176;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>bdh 3044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NS (Neuronal Supplement) 21&#160;</td>
			<td>prepared in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Source: reference 69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 5 &#190;&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td>Use this cotton-plugged 5 &#190;&#8221; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipets, 9&#8221;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &#8805;99.0%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 2 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 5 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 10 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 25 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet, 50 ml&#160;</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480878-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4&#8226;(7H2O)), &#8805;99.99%, Aldrich</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431478-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, SigmaUltra, &#8805;99.5% (GC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, sterile, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 ml</td>
			<td>BD falcon</td>
			<td>309585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain, 0.4%</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, type XI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&#160;</td>
			<td>GIBCO-Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003-5G</td>
			<td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS - immunocytochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

Hochauflösende Analyse der Morphologie und Funktion von Säuger-Neuronen erfordert oft die Genotypisierung von Einzeltieren, gefolgt von der Analyse der Primärkulturen von Neuronen. Wir beschreiben eine Reihe von Verfahren für: Etikettieren neugeborenen Mäusen die genotypisiert werden, schnelle Genotypisierung und die Einrichtung mit niedriger Dichte Kulturen von Nervenzellen im Gehirn von diesen Mäusen. Einzelne Mäuse werden von Tätowierungen, die für langfristigen Identifikations dauerhaft in das Erwachsenenalter ermöglicht markiert. Genotypisierung von dem beschriebenen Protokoll ist schnell und effizient und ermöglicht eine automatisierte Extraktion von Nukleinsäure mit guter Zuverlässigkeit. Dies ist unter Umständen, wenn genügend Zeit für herkömmliche Genotypisierung nicht verfügbar ist, beispielsweise nützlich, in Mäusen, die aus Neugeborenen-Letalität leiden. Primären neuronalen Kulturen werden bei niedriger Dichte, die Abbildungsexperimente mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht erzeugt. Diese Kulturverfahren erfordert die Herstellung von glial-Feeder-Schichten vor dem neuronalen Plattierung. Die protocol ist in seiner Gesamtheit an einem Mausmodell für die Bewegungsstörung DYT1 Dystonie (&amp; Dgr; E-Torsina Knock-in-Mäusen) aufgebracht und Neuronenkulturen werden von Hippocampus, Kortex und Striatum dieser Mäuse hergestellt. Dieses Protokoll kann auf Mäuse mit anderen genetischen Mutationen, um andere Tierarten angewendet werden, wie gut. Ferner können einzelne Komponenten des Protokolls isoliert Teilprojekte verwendet werden. Dabei dient dieses Protokoll haben breite Anwendungen, nicht nur in den Neurowissenschaften, aber auch in anderen Bereichen der biologischen und medizinischen Wissenschaften.

Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, sind repräsentative Ergebnisse für die Markierung von Mäusen durch Tätowierungen, zuverlässig Genotypisierung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und mit primären neuronalen Kulturen glial-Feeder-Schichten gezeigt. Tätowierung Neugeborene Welpen wurden auf den Fußballen mit einem Tätowierung-System (&quot;Newborn&quot; in Abbildung 1) gekennzeichnet. Die ...

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Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern.

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Aufrufe.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Wir beschreiben Verfahren für die Kennzeichnung und Genotypisierung neugeborenen Mäusen und Erzeugung primären neuronalen Kulturen von ihnen. Die Genotypisierung ist schnell, effizient und zuverlässig und ermöglicht die automatisierte Nukleinsäureextraktion. Dies ist besonders nützlich für neonatal letale Mäusen und Kulturen, die vor Abschluss der Genotypisierung erfordern. 

Serie: Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Konstruktion und Montage eines Ultra-light Motorisierte Microdrive für chronische Neural Recordings in Kleintiere

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...