Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Bewertung der Auswirkungen von Genexpressionsmanipulationen auf kortikale neuronale Architektur in vivo. Unser erster hauptentscheidender Vorteil dieses Verfahrens gegenüber solchen, die auf einer neutralen Elektroporation basieren, ist die feine Kontrolle der Genexpressionsniveaus. Insbesondere ermöglicht diese integrierte Pipeline die In-vivo-Bewertung von Defekten, die durch kleine Veränderungen der Genexpression bei der Kontrolle der neuronalen Zytoarchitektur erhöht werden.
Darüber hinaus ermöglicht die Paarstruktur des Transplantationstests eine enorme Reduzierung der Anzahl der Tiere, die notwendig ist, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen. Die Technik nutzt einen Vorläuferpool, der von transgenen Tau-EGFP-Embryonen stammt. Dieser Pool ist in zwei Unterpools unterteilt, die alternativ mit zwei lentiviralen Mischungen infiziert sind.
Um einen grünen Testpool und einen gelben Kontrollpool zu erhalten, der gemeinsam injiziert wird. Nach zwei Tagen In-vitro-Expansion werden die resultierenden Neurosphären getrennt, eins zu eins gemischt und mit einer Kapillare in den ventrikulären Raum der Maus injiziert. Zehn Tage später wird die Immunfluoreszenz an koronalen Abschnitten durchgeführt, um den Vergleich zwischen Test- und Kontrollneuronen zu ermöglichen.
Schließlich werden die immunbefleckten Abschnitte abgebildet und skelettiert, um die morphometrischen Parameter abschließend zu bewerten. Bereiten Sie vor der In-vivo-Transplantation den Vorläufer-Grünpool vor. E12.5-Embryonen, die von einer schwangeren Mutter geerntet wurden, die zuvor mit einem Tau EGFP-Gründer verpaart wurde, werden in einzelnen Brunnen einer Multi-Well-Platte in PBS-Lösung gesetzt.
Genotyp sie schnell durch Sichtprüfung unter einer Blaulichtlampe. Dissoziieren Sie die sezierten grünen Kortiken einzelnen Zellen. Setzen Sie Zellen in einem proliferativen Medium wieder aus, und unterteilen Sie sie in zwei gleich große Teilpools.
Infizieren Sie jeden Subpool mit einer speziellen lentiviralen Mischung. Jede Mischung enthält Red-Label-Virus oder Black-Control-Virus. Ebenso wie Viren für Tet-Off-gesteuerte Transgen- bzw. Kontrollexpression.
Jedes Lentivirus muss bei einer Vielzahl von Infektionen von 8 verabreicht werden. Die infizierten Zellen in proliferativem Medium mit 2 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin verschichten. Übertragen Sie Zellen in den Inkubator und lassen Sie sie für 2 Tage bei 37 Grad.
Nach 2 Tagen müssen die beiden Subpools als Suspensionen kleiner Neurosphären erscheinen. Homogen eszisch das rote fluoreszierende Protein ausdrücken, oder nicht. Nach der Entwicklung von Vorläufern, legen Sie ein Bewertungsarray für die Transplantation in P0 weißen Labor Welpen.
Verwenden Sie die Borosilikatglaskapillaren mit einem ewigen und inneren Durchmesser von 1,5 Millimetern bzw. 1,12 Millimetern. Ziehen Sie die Kapillare mit einem P1000-Abzieher. Geben Sie zunächst das Ziehprogramm ein.
Zweitens, legen Sie die Kapillare in die Halter und ziehen Sie sie fest. Drittens, starten Sie das Programm und nehmen Sie die beiden gezogenen Mikrokapillaren. Schneiden Sie die Kapillarspitze von Hand mit einem Skalpell unter das Stereomikroskop, um eine Spitze mit einem Außendurchmesser von 200-250 Mikrometern zu erhalten.
Schließlich die Kapillaren auf den Kunststoffträger in eine geschlossene Petrischale legen und unter die Haube geben. Disfizieren Sie optische Fasern und legen Sie sie unter die Haube. Mischen Sie die EGTA- und Fast Green-Master-Mischungen, um die Zell-Tracer-Lösung vorzubereiten, und legen Sie sie erneut unter die Haube.
Schneiden Sie kleine Stücke von Labor-Dichtungsfolie für Zellsuspension stonung. Und schließlich, bereiten Sie eine Lösung von 1 Milligramm pro Milliliter steriles Doxycyclin in einer 0,3 Milliliter Spritze entsorgt. Das Injektionsrohr wird aus zwei Latexröhren hergestellt.
Befestigen Sie ein hartes Kunststoff-Mundstück an einem Ende eines Latexrohrs. Befestigen Sie dann den Kapillarhalter an einem Ende des anderen Latexrohrs. Verbinden Sie die freien Enden der beiden Latexröhren aus einem 0,45 Mikrometer sterilen Filter als Barriere gegen Bedienerkeime.
Legen Sie die resultierende Aspiratorrohranordnung auf einen Kunststoffhalter, der unter der Haube aufbewahrt werden soll. Sammeln, testen und steuern Sie Neurosphären in separaten Röhren. Zentrifugen-Neurosphäresuspensionen und ersetzen den Überstand durch PBS.
Wiederholen Sie diese Sequenz zwei weitere Male. Zentrifugen-Neurosphärensuspensionen, ersetzen Sie den Überstand durch Trypsin-Lösung, und Pipette der Zellpellet rauf und runter, 4, 5 mal. Lassen Sie die Zellen für fünf Minuten im Inkubator, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Blockieren Sie Trypsin mit Trypsin-Inhibitor-Lösung. Zentrifugenzellen und setzen sie in einem frischen proliferativen Medium wieder aus. Zählen Sie die Zellen der beiden Pools und passen Sie ihre Konzentration auf 100.000 Zellen pro Mikroliter in proliferativem Medium an.
Anschließend werden Test- und Kontrollzellen 1:1 gemischt und die resultierende Mischung unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft. Schließlich legen Sie die Mischung auf Eis unter der Haube. Bereiten Sie den Käfig mit der Mutter und den Welpen auf einem Tisch weit weg vom chirurgischen Bedienerbereich vor.
Legen Sie einen Bergungskäfig auf einen Warenkorb. Legen Sie eine Mischung aus Sägemehl aus dem Käfig der Mutter auf den Boden, und legen Sie den Bergungskäfig unter eine Lampe. Beiseite, stellen Sie eine Eiskiste mit einer Aluminiumfolie für die Anästhesie der P0 Welpen bedeckt.
Kurz vor der Transplantation ein Volumen von 1 bis 10 Volumen zellierstattiger Lösung zu einem Volumen der Zellsuspension hinzufügen und drei Mikroliter der resultierenden Mischung auf einem Stück Labor-Dichtungsfolie erkennen. Legen Sie den Welpen für eine Minute auf die kühle Aluminiumfolie und überprüfen Sie, ob er vollständig beästhetisiert ist. In der Zwischenzeit die 3 Mikroliter Injektion in die Glaskapillare absaugen.
Wischen Sie den Kopf des anästhesierten Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol ab. Als nächstes, lokalisieren Sie es auf der optischen Faser, um die kortikalen Hemisphären klar zu identifizieren. Geben Sie die Kapillare in die Vorderseite und greifen Sie auf die ventrikuläre Kavität zu.
Achten Sie dabei darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Um Schäden an ganglionischer Eminenz zu vermeiden, drehen Sie die Nadel seitlich um dreißig Grad. Injizieren Sie die Zellen vorsichtig in den Hohlraum und überwachen Sie deren Diffusion mit Fast Green.
Warten Sie fünf bis zehn Sekunden. Entfernen Sie die Glasnadel, achten Sie darauf, die Zellsuspension nicht zu aspirieren, und entsorgen Sie sie in einem geeigneten Entsorgungsbehälter. Vor der Erholung des Welpen von der Anästhesie 150 Mikroliter Doxylösung intraperitoneal injizieren, um die transgene Expression nach der Transplantation noch ausschalten zu lassen.
Legen Sie die Welpen nach der Injektion sofort unter die Lampe, um sich zu erholen. Lassen Sie die Welpen dort für fünf bis zehn Minuten, und sobald sie vollständig wach sind, legen Sie sie in den Käfig mit der Mutter. Beobachten Sie die operierten Welpen für zwei bis drei Stunden, um sicherzustellen, dass die Mutter sie akzeptiert.
Den Käfig mit Trinkwasser, das 0,5mg/ml Doxycyclin und Saccharose enthält, zu versorgen, um die transgene Expression fern zu halten. Ersetzen Sie das Wasser enthaltendes Doxycyclin vier Tage nach der Transplantation durch doxyfreies Wasser. So wird das Transgen in postmitotischen Neuronen aktiviert.
Halten Sie Mäuse sechs Tage lang in einem doxyfreien Regime auf und einschläfern Sie sie bei P10. Fix Gehirne von eingeschläferten Welpen in 4%PFA, bei vier Grad, über Nacht. Entfernen Sie die PFA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30%Saccharose-Lösung.
Lassen Sie das Gehirn bei vier Grad, bis sie auf die Durchstechflasche unten sinken. Übertragen Sie die Gehirne in eine Einweg-Einbettform etwa die Hälfte mit Kryo-Inklusionsmedium gefüllt. Einfrieren Sie das mitgelieferte Gehirn bei 80 Grad.
Schneiden Sie 60 Mikrometer dicke koronale Abschnitte mit einem Kryostat. Prozessabschnitte für Anti-GFP, Anti-RFP-Immunfluoreszenz und gegenstain sie mit DAPI-Lösung. Stellen Sie die Arbeitsparameter des konfokalen Mikroskops entsprechend wie gezeigt ein.
Sammeln Sie Bilder von immunoassayed Scheiben, Auswahl GFP positive neuronreiche fotografische Felder blind von RFP-Signalverteilung. Exportieren Sie die Bilder als ND2-Dateien und generieren Sie maximale Z-Projektionen davon als TIFF-Dateien. Um eine nachfolgende Neuronen-Skelettierung blind des Zellgenotyps zu ermöglichen, verstecken Sie das rote Signal.
Fügen Sie dazu eine Anpassungsebene hinzu. Wählen Sie Ebenen, wählen Sie rot. Setzen Sie die Ausgabe auf Null.
Und speichern Sie die Datei als solche. Die Skelettierung wird anschließend von einem neuen Operator durchgeführt, der zuvor keinen Zugriff auf originale rote Dateien hatte. Öffnen Sie für jede ausgeblendete rote Datei die Datei, fügen Sie dem primären Bild eine Zeichnungsebene hinzu, und wählen Sie das Bleistiftwerkzeug aus.
Verfolgen Sie den Somer auf der Grundlage des GFP-Signals. Verfolgen Sie dann die Neuriten. Speichern Sie schließlich die Mutlilayer-Datei, einschließlich neuronaler Silhouetten.
Eine nachträgliche Analyse neuronaler Skelette kann von beiden Operatoren durchgeführt werden. Öffnen Sie jede mulitlayer-Datei, erstellen Sie neue leere 16-Bit-Graustufendateien mit schwarzem Hintergrund. Eins pro Neuron.
Kopieren und fügen Sie einzelne neuronale Silhouetten vom primären Bild bis hin zu den Graustufendateien ein. Kehren Sie zur Mehrschichtdatei zurück und schalten Sie die Einstellungsschicht aus, um neuronale Genotypen zu enthüllen. Speichern Sie die 16-Bit-Graustufendateien, und kommentieren Sie die entsprechenden Neuronen-Genotypen.
Importieren Sie Graustufenbilder in ImageJ nacheinander und analysieren Sie Skelette mit dem NeurphologyJ-Plugin. Sammeln Sie ausgewählte NeurophologieJ-Primärdaten, Gesamtfläche der Neuritenlänge, Befestigungspunkte und Endpunkte, in einer Kalkulationstabelle und verwenden Sie sie, um sekundäre morphometrische Parameter zu berechnen. Das von uns vorgeschlagene Engineering-Protokoll ermöglicht es, die überwiegende Mehrheit der untersuchten Neuronen mit den beabsichtigten Transgenen-Sets zu kotransduzieren.
Darüber hinaus ermöglicht es eine erhebliche Homogenität der transgenen Expressionsniveaus innerhalb der transduced Zellpopulation. Ein wesentliches Merkmal unseres Verfahrens ist die gekoppelte Konfiguration. Ein Test und ein Kontrollvorläuferpool werden separat entwickelt, 1:1 gemischt und schließlich mittransplantiert.
Dieser gepaarte Ansatz erleichtert die Erkennung von Ergebnisunterschieden, die speziell mit unterschiedlichen Genotypen in Verbindung stehen. In diesem Beispiel analysierten wir koronale Abschnitte transplantierter Welpen zehn Tage nach der interventrikulären Koinjektion von Foxg1-überexzierenden Neuronenvorläufern und Kontrollvorläufern. Bilder von Gruppen von Neuronen wurden mit konfokaler Mikroskopie erworben.
Z-Stack-Dateien wurden verwendet, um maximale Projektionen zu berechnen. Neuronale Silhouetten wurden manuell nachverfolgt. Hier stellen grüne und gelbe Silhouetten Foxg1-Über-Ausdrucks- bzw. Kontrollneuronen dar.
Schließlich wurden die primären Parameter, die durch die NeurphologyJ-Analyse ermittelt wurden, für die Berechnung der sekundären morphometrischen Indizes verwendet, wie dargestellt. Dies ist ein einfaches Protokoll, das es dem Forscher ermöglicht, die Auswirkungen zu bewerten, die die gemischte Expression eines bestimmten Gens auf die feine Kontrolle der Neuritenentwicklung in vivo ausüben kann. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind zwei.
Vorhandene Anzahl von Genen, die an neuronaler Morphogenese beteiligt sind, können in vivo funktionell charakterisiert werden, wenn die entsprechenden teratogenen Linien fehlen. Und für die Analyse werden weniger Tiere benötigt, um die signifikanten statistischen Ergebnisse zu erhalten.
