Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung von Neurosphären aus gemischten primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen zu demonstrieren, die aus Dem E14-E16 Sprague Dawley Rattenembryon isoliert sind, um eine robuste und kostengünstige Plattform für die Untersuchung der Wirkung verschiedener neurotherapeutischer Leads zu bieten. Wie Sie wissen, ist dieses Gehirn ein komplexes Netzwerk von Neuronen mit einer großen Anzahl von unterstützenden Zellen verbunden. Um die Gehirnfunktion zu verstehen, wird oft der größte Teil der Forschung aus In-vitro-Experimenten neu initiiert, die kommerziell erhältliche neuronale Linien abgeleitete Zelllinien beinhalten.
Diese Zelllinien sind jedoch transformierte Zelllinien, die unter genottypischen und phäotypischen Variationen leiden. Um dieses Problem anzugehen, ist die primäre Neuronenkultur der geeignete Ansatz. Hier haben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Kultur primärer Neuronen illustriert und eine robuste Screening-Plattform für verschiedene neuronale Therapeutika aufgebaut.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass wir nur durch modulationsierende Zellbeschichtungsdichten zwei kontrastierende Neuronenkulturplattformen präsentieren können, bei denen niedrige Dichte zu einer längeren primären Neuronenkultur führt und hohe Dichte spontane Neurosphären erzeugt. Nehmen Sie zwei 24-Well-Platten. Eine für hochdichte, eine für die Beschichtung mit geringer Dichte.
12 mm sterile Glasabdeckungen in die 24-Well-Platten geben. Gießen Sie 300 Mikroliter PDL-Lösung in jede der Brunnen so, dass sie die Oberfläche des gesamten Deckslip vollständig abdeckt. Bereiten Sie die PDL-Lösung in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser vor.
Wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolien, um eine Trocknung zu verhindern, und bewahren Sie sie über Nacht im CO2-Inkubator auf. Am nächsten Tag, bevor Sie die PDL-Lösung beschichten. Zwei- bis dreimal richtig mit sterilem Wasser waschen.
Fügen Sie dann Beschichtungsmedien hinzu, und geben Sie die Platten bis zur Beschichtung an den Inkubator zurück. Opfern Sie eine E14-E16 getimte schwangere Sprague-Dawley Ratte, machen Sie einen V-förmigen Schnitt im Bauchbereich mit sterilen Zangen und einem Paar stumpfe Stirnschere. Entfernen Sie alle Föten und legen Sie sie vorsichtig auf die Petriplatte mit kalter HBSS-Lösung.
Nehmen Sie die Embryonen aus den embryonalen Säcken und waschen Sie sie sorgfältig in einer separaten Petrischale in frischen, kalten HBSS. Enthaupten Sie den Kopf mit Hilfe einer sterilen Schere. Die Köpfe in die sterilen 90 mm Petriplatten mit kaltem HBSS übertragen.
Halten Sie unter dem Stereomikroskop den Kopf aus dem Schnauchbereich mit den sterilen gezackten Zangen und nehmen Sie das Gehirn heraus, indem Sie die Haut und den Schädel öffnen. Entfernen Sie alle Meningen aus den Hemisphären und dem Mittelhirn, indem Sie den Hirnstamm halten. Entfernen Sie vorsichtig die intakten Hemisphären, die Pilzkappen ähneln, die den Hippocampus und den Kortex enthalten.
Sammeln Sie die Hemisphären, die Kortex und intakten Hippocampus enthalten, in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 10 ml Dissoziationsmedien enthält. Lassen Sie die gesammelten Gewebe sich absetzen, und saugen Sie das Dissoziationsmedium an, so dass fünf bis zehn Prozent des Mediums darin bleiben. Fügen Sie noch mal 10 ml frisches Dissoziationsmedium hinzu, und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
Fügen Sie 4,5 ml Dissoziationsmedium und 0,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Halten Sie es im Inkubator bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten für die Verdauung zu fortfahren. Das Medium ansaugen und mit 10 ml Dissoziationsmedium und Beschichtungsmedium nacheinander waschen.
Setzen Sie sie in 2,5 ml Beschichtungsmedium aus. Halten Sie eine 90 mm sterile Schale über die umgekehrte Abdeckung der Schale und gießen Sie sie in die Basis der 90 mm sterilen Schale. Tittieren Sie das verdaute Gewebe in der Eckbasis der Schale, mit 1000 Mikroliter Pipettenspitze, um das geringste Volumen zu besetzen.
Passieren Sie die erhaltene Zellsuspension durch das 70 Mikrometer zellgleiche Sieb, mit Ausnahme von Gewebestücken. Bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen mithilfe des Trypan-Blaufarbstoffausschlusses, und zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie die Anzahl der Zellen, die in einer Weise erhalten wurden, um 1,5 in 10 auf die Leistung von 5 Zellen pro ml für die Beschichtung mit hoher Dichte und 20 000 Zellen pro ml für die Beschichtung mit geringer Dichte in zwei getrennten Rohren mit 30 ml Beschichtungsmedium zu verschichten.
Aspirieren Sie das zuvor hinzugefügte Beschichtungsmedium und Platte 500 Mikroliter der Zellen in Beschichtungsmedium in jedem Brunnen dispergiert. Danach kehren Sie die Platten für vier Stunden zum Inkubator zurück. Untersuchen Sie die Zellen vier Stunden nach der Beschichtung unter dem Mikroskop auf Die Haftung.
Nach vier Stunden Beschichtung, sowohl in hohen als auch in niedrigen Dichte Platten, zeigen die Neuronen eine gute Haftung an den Platten. Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter frisches Pflegemedium, und inkubieren Sie es in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Wir müssen diese Neuronen mit hoher und niedriger Dichte bevölkern.
Während die niedrigdichten plattierten Neuronen für längere Kulturen verwendet werden können, bis zu 30 Tage, indem das Pflegemedium zweimal pro Woche gewechselt wird, beginnen die hochdichten plattierten Neuronen spontan Neurosphären zu erzeugen, die einen Tag nach dem Erhalt in ultra-niedriger Anbauplatte kamen. Nach 24 Stunden Beschichtung werden sowohl hoch- als auch wenig dichte plattierte Neuronen beobachtet, um eine gesunde Morphologie zu zeigen. Hier wird ein Phasenkontrastbild der plattierten Neuronen mit geringer Dichte dargestellt, das etwa sieben Tage lang kultiviert wurde.
Die Neuronen zeigen eine gesunde Morphologie und können mit einem kräftigeren Routing und Verbindungen bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden. Das Balkendiagramm zeigt hier rund 90 Prozent Lebensfähigkeit der niederdichten transplantierten Neuronen auch nach 30 Tagen Kultur, wie der MTT-Assay bestimmt. Die primären Neuronen hier wurden durch Immunfärbung mit Tuj 1, einem Marker von differenzierten Neuronen, und Tau, einem Marker neuronaler Axone, charakterisiert.
Die Reinheit der Neuronen wird durch das Fehlen von Färbung in nicht-neuronalen Markern GFAP für Astrozyten und O4 für Oligodendrozyten bestätigt. In allen Charakterisierungsstudien wurden Kerne mit Hoechst 33258 befleckt. Hier wurden die samenarmen Zellen mit dem astrozytischen Marker GFAP und dem neuronalen Marker Tuj 1 befleckt, um die Reinheit der Kultur bis zu sieben Tage zu überprüfen.
Es wird beobachtet, dass dieses Protokoll das bevorzugte Wachstum von Neuronen gegenüber Astrozyten unterstützt, wie durch die quantitative Analyse angegeben. Nuclei wurden mit Hoechst 33258 befleckt. In ähnlicher Weise wurden in den hochdichten Samenzellen die Astrozyten mit GFAP und Neuronen von Tuj 1 gefärbt.
Hier werden in der quantitativen Analyse rund 17 Prozent Der Astrozyten beobachtet, verglichen mit 83 Prozent Neuronen. Die Kerne sind mit Hoechst 33258 befleckt. Nach sieben Tagen werden spontan mehrere Neurosphären in den hochdichten Neuronen beobachtet.
Etwa acht- bis zehnter Tag der Kultur, in den hochdichten, verdichteten Neuronen, beginnen die Neurosphären große Projektionen und Brücken zu bilden, die aus radialen glialartigen Erweiterungen bestehen. Die schwarzen Pfeile zeigen die Brücke zwischen zwei neu gebildeten Neurosphären an. Seit 15 Tagen werden an den Neurosphären Lebend- und Totzellen-Assay durchgeführt.
In der dichten Calcein AM Färbung, mit absolut keine Propidium iodid Färbung, zeigt fast 100 Prozent Lebensfähigkeit der Neurosphären in der Kultur. Das Liniendiagramm zeigt hier eine Ausdehnung der Größe der Neurosphären mit dem Durchgang der Anzahl der Tage an. Dieses übermäßig gefärbte Bild der Neurosphäre zeigt eine reiche Population von neuronalen Vorläuferzellen durch erhöhte Expression der NPC-Marker Nestin und Tuj 1.
Die Neurosphären hier zeigen hohe Mengen an Astrozyten, die durch die starke Expression von GFAP gekennzeichnet sind, begleitet von einer noch höheren Expression des neuronalen Markers Tuj 1. Die Kerne sind mit Hoechst 33258 befleckt. Daher denke ich, dass unser Protokoll ziemlich spannend und interessant ist, wenn man bedenkt, dass wir aus einer einzigen Strategie zwei Plattformen bekommen können: eine 2-D und eine 3D.
Und dies wird eine großartige Plattform für das Screening verschiedener neurotherapeutischer Spuren sein. Also ich denke, es ist wirklich wirklich nützlich für alle Neurowissenschaftler. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Neurosphären, für die wir uns entscheiden, extrem reich an neuronalen Vorläuferzellen sind, den NPCs.
Und sie können verwendet werden, um sie in Neuronen und nicht-neuronale Linien zu unterscheiden. Also, ich habe das Gefühl, wenn, wirklich, Menschen diese Technik meistern können, indem sie Hilfe aus diesem Video nehmen, wird es wirklich wirklich nützlich für alle sein. Vielen Dank.
