Wir möchten Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit für ihre technische Unterstützung danken. Die Studie wird von NIH (PN2 EY016525) und durch die Finanzierung von Down-Syndrom-Forschung und Behandlung-Stiftung und der Larry L. Hillblom Stiftung.

Chirurgische und Tierverfahren werden streng nach dem NIH-Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Alle Experimente, die die Verwendung der Tiere werden von UCSD Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Plasmid Klonierung, Expression und Reinigung von Mono-biotinyliert BDNF (mBtBDNF) HINWEIS: Konstruieren Sie vor-und proBDNFavi BirA cDNA in pcDNA3.1-Vektor und coexprimieren in HEK293FT Zellen 10. Reinigen mBtBDNF mit Ni-NTA-Kügelchen nach bisher veröffentlichten Verfahren zur Herstellung von reifen und biologisch aktive monobiotinylierte Nervenwachstumsfaktor (mBtNGF) 10. 2. Herstellung von Mikrofluidik-Chambers Mikrofluidik-Neuronenkultur-Vorrichtung ermöglicht es, fluidisch zu isolieren Axone von Neuron Zellkörper. Montieren Kammern mit frisch beschichtete Deckgläser Recht vor jeder Sektion. Mikrofluidischen Kammern verwendetin diesem Protokoll sind kommerziell erhältlich (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle). Handwäsche und wiederverwendet werden kommerziell erworben Kammern bis zu 5-6x. <ol><li> Handwäsche mikrofluidischen Kammern in 1% Alconox. Dreimal mit Milli-Q-Wasser spülen für 30 Minuten jeweils. Handwaschkammern wieder in 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie Kammern auf Parafilm in der Sterilbank trocknen. Strahlen und sterilisieren Sie beide Seiten der Kammern für 20 min unter UV. Speicher sterilisiert Kammern in einer sterilen 15-cm-Schale mit Parafilm verschlossen und bei Raumtemperatur. </li><li> Platz 24 x 40 mm Nr 1 Deckgläser in einem Glasbehälter. Weichen Sie die Deckgläser in 35% Salzsäure über Nacht auf einem Rotator. Am folgenden Tag, spülen Sie die Deckgläser dreimal für jeweils 30 Minuten mit Wasser. </li><li> Sterilisieren Sie die Deckgläser eine nach der anderen durch Eintauchen jedes Deckglas in 100% Ethanol und flammenden über einem Bunsenbrenner. Trocken lagern Deckgläser in einer sterilen Petrischale und halten Sie sie bei Raumtemperatur bis zur Beschichtung. </li><li> Legen out die Deckgläser in einer 15 cm Kulturschale. Mantel jedes Deckglas mit 0,7 ml 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) und Inkubation in der Haube bei Raumtemperatur. </li><li> Nach 1 Stunde, spülen Sie die Deckgläser dreimal mit sterilem Wasser. Trockendeckgläser mit Vakuum und findet jedes Deckglas in eine 6 cm Kulturschale. </li><li> Um die mikrofluidische Kammer montieren, platzieren Sie die Kammer mit Mikrorille Seite an der Unterseite auf die PLL beschichtete Deckglas mit Vorsicht die Mikrorillen nicht zu berühren. Sanft in die Kammer gedrückt, mit einer Pipettenspitze, um sicherzustellen, wurde die Kammer dicht verschlossen. </li></ol> 3. Dissection neuronaler Kultur und Platte auf Chambers <ol><li> Legen Sie zwei E17-E18 Rattenhippokampi (ein Gehirn) in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Puffer Dissektion (HBSS, kein Kalzium, kein Magnesium seziert, mit 1% Penicillin / Streptomycin und 10 mM HEPES. Spülen die Gewebe 3x mit 5 ml Dissektion Puffer jeder Zeit. Entfernen Sie die Dissektion Puffer so viel wie möglich und fügen Sie 900 ml frisches dissection Puffer. </li><li> , Um das Gewebe zu verdauen, 100 l 10x Trypsin (2,5%) in die Dissektion Puffer 1x Arbeitskonzentration zu machen. Legen Sie die konische Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Nach 10 min wurde der Verdau wird mit 100 ul 10 mg / ml DNase I bis zu einer Endkonzentration ca. 1 mg / ml. </li><li> Mit Hilfe eines feuerpolierten Pasteur Glaspipette, sanft verreiben das Gewebe durch Auf-und Abpipettieren 5-10x. Gleich nach Verreiben, löschen den Trypsin mit 2 ml Agarmedium (Neurobasal mit 10% FBS, 2 mM Glutamax, 2% B27). </li><li> Verlassen Sie die Probe in der Haube für 5 min auf alle Ablagerungen der Gewebe ermöglichen, auf den Boden niederzulassen. 2 ml Überstand vorsichtig entfernen in eine saubere sterilen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Das Pellet in 50 ul Plattierungsmedien </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Zählkammer. Last 15-20 ul Zellsuspension (~ 40.000 Zellen) in einem Abteil des mikrofluidischen Kammer. Legen Sie die Kammerin den Inkubator für 10 Minuten, damit sich die Zellen an den Deck befestigen. Nach 10 Minuten, fügen Sie mehr Plattenmedien zu füllen beide Fächer der Kammer. </li><li> Am zweiten Tag der Präparation vollständig die Plattenmedien mit wartungs Medien ersetzen (Neurobasal mit 2 mM Glutamax, 2% B27) sowohl in der Zellkörper und das Axon Fach. Axone von den Neuronen im Hippocampus zu starten, um die Mikrorillen in Tag 3 überqueren und erreichen das Axon Raum zwischen Tag 5-7. Während dieser Zeit ersetzen die Hälfte der Kulturmedien mit frischem Erhaltungsmedium alle 24 ~ 48 Stunden. </li></ol> 4. axonalen Transport von QD-BDNF <ol><li> Vor der Live-Imaging von QD-BDNF axonalen Transport, Abbau von BDNF sowohl die Zellkörper und Axon Fächer des mikrofluidischen Kammer gründlich beide Fächer mit BDNF-frei, Serum kostenlos Neurobasal Medien alle 30 Minuten für 2 Stunden. </li><li> Während BDNF Erschöpfung, bereiten Sie die QD-Konjugate BDNF. Mischungs 50 nM biotinyliertem mono-BDNF-Dimer mit 50 nM QD655-Streptavidin-Konjugate in Neurobasalmedium Medien und Inkubation auf Eis für 60 min. </li><li> Entfernen Medien im Axon Fach und 300 ul QD-BDNF mit einer Endkonzentration von 0,25 nM für 4 h bei 37 ° C aufweist. Um die Streu von QD-BDNF in den Zellkörper Raum zu minimieren, ist es sehr wichtig, um ein höheres Niveau der Medien in der Zellkörperraum immer halten als im Axon Fach. Abwaschen ungebundenen QD-BDNF nach Inkubation vor Live-Bildgebung. </li><li> Führen Sie die Live-Darstellung von QD-BDNF Transport mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Öl Objektiv ausgestattet. Aufwärmen des Umfangs und der Klimakammer befestigt sein, um eine konstante Temperatur (37 ° C) und CO 2 (5%). Verwenden Sie einen Satz von Texas rot Anregung / Emission, um den Würfel QD655 Signal sichtbar zu machen. </li><li> Erwerben und zu erfassen Zeitraffer-Bilder innerhalb der Mitte Axone mit der Geschwindigkeit von 1 Bild / s für insgesamt 2 min mit einer CCD-Kamera. Verwendung Mikrorillen ohne Axone that keine QD und somit kein Signal als Kontrolle für die Infiltration. </li><li> Analysieren BDNF Transport mit jedem Bildanalyse-Software oder NIH ImageJ. </li></ol>

<ol>
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C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. 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J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Studie wurde die Entwicklung einer neuen Technik berichten wir produzieren biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Durch Konjugieren des Proteins Quantenpunkt Streptavidin, und unter Verwendung eines Mikrofluidkammer ermöglicht das Verfahren eine bis axonalen Transport von BDNF in primären Neuronen mit Einzelmolekülempfindlichkeit, in Echtzeit und mit räumlichen und zeitlichen Auflösung zu erfassen. Die hier verwende...

Neuronen sind stark polarisiert Zellen, deren lange und oft sehr ausgearbeiteten Prozesse sind von grundlegender Bedeutung für den Aufbau und die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion neuronaler Schaltkreise. Das Axon spielt eine wichtige Rolle bei der Durchführung Ladungen zu und von Synapsen. Proteine ​​und Organellen in der Zelle synthetisiert Soma müssen durch Axone transportiert werden, um die präsynaptischen Terminal zu erreichen, um neuronale Funktion unterstützen. Entsprechend empfangenen Signale an distalen Axone müssen transduziert werden und zu der Soma. Diese Verfahren sind für das neuronale Überleben, Differenzierung und Wartung. Dadurch axonalen Transport in manchen Neuronen müssen über Entfernungen mehr als 1000-mal der Durchmesser des Zellkörpers durchgeführt werden, ist die Möglichkeit, ohne weiteres vorstellbar, dass auch kleine Mängel konnten deutlich beeinflussen und neuronalen Schaltungsfunktion. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ein Mitglied der Neurotrophin-Familie von Wachstumsfaktoren in mA vorliegtny Hirnregionen, einschließlich Hippocampus, Großhirnrinde und des basalen Vorderhirns. BDNF spielt eine entscheidende Rolle bei der Wahrnehmung und Gedächtnis-Bildung durch Unterstützung des Überlebens, der Differenzierung und der Funktion von Nervenzellen, die in der kognitiven Schaltungen teilzunehmen. BDNF an seinen Rezeptor bindet, der Tyrosinkinase TrkB am Axonendigung wo es aktiviert TrkB-vermittelte Signalwege, einschließlich der Mitogen-aktivierte Proteinkinase / extrazelluläre Signal-regulierte Proteinkinase (MAPK / ERK), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) und Phospholipase C-gamma (PLC &amp; ggr). Die Proteine, die in diesen Signalwegen beteiligt sind, auf endozytischen vesikulären Strukturen verpackt, um das BDNF / TrkB Signal Endosomen 1-6, die dann retrograd in die neuronalen Soma transportiert zu bilden. Mikrofluidische Kulturkammer ist eine sehr nützliche Plattform für die Untersuchung der Biologie axonalen unter normalen Bedingungen als auch bei der Einstellung von Verletzungen und Krankheits 7,8. Durch die Isolierung Axoneaus den Zellkörpern, hat das Gerät darf man speziell in Transport Axone 8-10 studieren. Die PDMS basiert mikrofluidische Plattformen mit 450 um Mikronut Barrieren in dieser Studie verwendet wurden kommerziell erworben (siehe Materialien Tabelle). BDNF Transport zu untersuchen, entwickelten wir eine neuartige Technologie, um monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF) zu erzeugen. Wir nutzten die Biotin-Akzeptor-Peptid, AP (auch als AviTag bekannt). Es ist ein 15-Aminosäuresequenz, die einen Lysinrest, der spezifisch an Biotin durch den Escherichia coli-Enzym-Biotin-Ligase BirA ligiert werden kann, enthält. Fusionierten wir die AviTag an den C-Terminus der Maus pre-proBDNF cDNA durch PCR (Abbildung 1a). Das Konstrukt wurde in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA3.1 myc-His-Vektor kloniert. Wir geklont auch die bakterielle DNA in die BirA pcDNA3.1 myc-Vektor sein. Die beiden Plasmide wurden transient in HEK293FT Zellen co-transfiziert, um beide Proteine ​​exprimieren. BirA katalysiert die Ligation von Biotin spezifisch an das Lysin liegen im AviTag am C-Terminus von BDNF in einem Verhältnis 1: 1 bis monobiotinylierte BDNF-Monomers. Biotinylierte, reifen BDNF mit einer Molekularmasse von ~ 18 kDa wurde gewonnen und aus den Medien unter Verwendung von Ni-Harz (1C) gereinigt. Die Biotinylierung von BDNF war vollständig, wie durch die Unfähigkeit beurteilt unmodifizierten BDNF durch Immunoblotting (Figur 1D) zu erfassen. Streptavidin konjugierten Quantenpunkte, QD 655, wurden verwendet, um zu kennzeichnen, um mBtBDNF QD-BDNF zu machen. Die Anwesenheit des AviTag nicht mit der Aktivität von BDNF stören die mBtBDNF konnte phosphorylierten TrkB (1E) zu aktivieren und stimulieren das Neuritenwachstum (1F), um das Ausmaß des rekombinanten menschlichen BDNF (rhBDNF). Immunfärbung gezeigt, dass QD-BDNF kolokalisiert mit TrkB in Hippocampus-Axone, die anzeigt, dass QD-BDNF bioaktiv (1G). Um die BDNF Transport zu untersuchen, wurde QD-BDNF zu distalen Axon Fach hinzugefügtMikrofluidik-Kulturen mit Rattenhippocampusneuronen E18 (2A). QD-BDNF retrograden Transport in Axonen wurde von Echtzeit-Live-Bildgebung des roten Fluoreszenzmarkierung (Trag Videos S1, S2) erfasst. Durch die Analyse der erzeugten kymograph, QD-BDNF beobachtet wurde retrograd mit einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s (3A) transportiert werden. GFP oder mCherry-markierten BDNF wurden zur axonalen Bewegung von BDNF zu verfolgen. Die Hauptnachteile sind, dass sie nicht hell genug für Einzelmolekülstudien. Auch die Gegenwart von sowohl anterograden und retrograden BDNF Bewegungen macht es schwierig, zu beurteilen, ob die retrograd transportiert BDNF war in einem Neurotrophin / Rezeptor-Komplex. In diesem Video zeigen wir die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. Die ultrabrightness und ausgezeichnete Photoquantenpunkte makes es möglich, langfristige Verfolgung von BDNF Transport durchzuführen. Diese Techniken können genutzt werden, um Studien der axonalen Funktion in AD, HD, und andere neurodegenerative Erkrankungen zu verbessern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:261px;">Name</td>
			<td style="width:205px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platinum pfx DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11708021</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EcoRI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0274</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BamHI&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>FD0054</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293FT cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R70007</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM-high glucose media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">d-biotin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TurboFect&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>R0531</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6279</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA resins</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">protease inhibitors cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S8820</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silver staining kit&#160;</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant BDNF</td>
			<td>Genentech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microfluidic chambers</td>
			<td>Xona</td>
			<td>SND450</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24x40 mm No. 1 glass coverslips&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-060</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">poly-L-Lysine&#160;</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3438-100-01</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27&#160;&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QD655-streptavidin conjugates</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;Q10121MP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Avi tag antibody</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00674</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">streptavidin-agarose beads&#160;</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>&#160;SA100-04</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6399</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HRP-streptavidin&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-pTrkB antibody</td>
			<td colspan="2">a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-TrkB antibody</td>
			<td>BD Science</td>
			<td>610101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Facetten neuronale Überleben, Differenzierung und Funktion. Strukturelle und funktionelle Defizite der Axone werden zunehmend als eine frühe Funktion von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit (HD) angesehen. Noch unklar ist der Mechanismus (en), durch die axonale Verletzung induziert wird. Wir berichteten über die Entwicklung einer neuen Technik zur Herstellung von biologisch aktiven, monobiotinylierte BDNF (mBtBDNF), die verwendet werden können, um den axonalen Transport von BDNF verfolgen. Quantenpunkt-markierten BDNF (QD-BDNF) wurde durch Konjugation Quantenpunkt 655 bis mBtBDNF produziert. Eine mikrofluidische Vorrichtung wurde verwendet, um die Axone von Neuronen Zellkörper zu isolieren. Zugabe von QD-BDNF auf die axonalen Fach erlaubt die Live-Darstellung von BDNF Transport in Axonen. Wir zeigten, dass QD-BDNF retrograd bewegt wesentlichen ausschließlich mit wenigen Pausen, bei einer Bewegungsgeschwindigkeit von 1,06 um / s herzustellen. Dieses System kann verwendet werden, um mich zu untersuchennismen der axonalen Funktion gestört in AD oder HD, wie auch andere degenerative Erkrankungen.

Herstellung und Reinigung von biologisch aktiven Mono-biotinylierten BDNF Der Expressionsvektor der BDNF mit einer AviTag Sequenz (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fusioniert wurde nach einem früher veröffentlichten Protokoll 10 erstellt. Die Molekularmasse des vollständigen Fusionsprotein wurde vorhergesagt ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) monobiotinyliertes reifen BDNF mit einer vorhergesagten Molekü...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Aufrufe.  University of California, San Diego.  Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen. 

Serie: Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a connection between amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and impairments in the nucleocytoplasmic pathway. ALS is a neurodegenerative disease affecting the motor neurons and resulting in paralysis and ultimately in death, within 2-5 years on average. Most cases of ALS are sporadic, lacking any apparent genetic linkage, but 10% are inherited in a dominant manner. Recently, hexanucleotide repeat expansions (HREs) in the chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) gene were identified as a genetic cause of ALS and frontotemporal dementia (FTD). Importantly, different groups have recently proposed that these mutants affect nucleocytoplasmic transport. These studies have mostly shown the final outcome and manifestations caused by HREs on nucleocytoplasmic transport, but they do not demonstrate nuclear transport dysfunction in real time. As a result, only severe nucleocytoplasmic transport deficiency can be determined, mostly due to high overexpression or exogenous protein insertion. 
This protocol describes a new and very sensitive assay to evaluate and quantify nucleocytoplasmic transport dysfunction in real time. The rate of import of a NLS-NES-GFP protein (shuttle-GFP) can be quantified in real time using fluorescent microscopy. This is performed by using an exportin inhibitor, thus allowing the shuttle GFP only to enter the nucleus. To validate the assay, the C9orf72 HRE translated dipeptide repeats, poly(GR) and poly(PR), which have been previously shown to disrupt nucleocytoplasmic transport, were used. Using the described assay, a 50% decrease in the nuclear import rate was observed compared to the control. Using this system, minute changes in nucleocytoplasmic transport can be examined and the ability of different factors to rescue (even partially) a nucleocytoplasmic transport defect can be determined.

This protocol describes a method to sensitively measure the nucleocytoplasmic transport rate within motor neuron-like NSC-34 cells by quantifying the real-time change in the nuclear import of a NLS-NES-GFP protein.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

Echtzeit-fMRT-Kartierung des Gehirns bei Tieren

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the cytoplasm or the release of intracellular Ca2+ stores. Pirt-GCaMP3-based Ca2+ imaging of primary sensory neurons of the dorsal root ganglion (DRG) in mice offers the advantage of simultaneous measurement of a large number of cells. Up to 1,800 neurons can be monitored, allowing neuronal networks and somatosensory processes to be studied as an ensemble in their normal physiological context at a populational level in vivo. The large number of neurons monitored allows the detection of activity patterns that would be challenging to detect using other methods. Stimuli can be applied to the mouse hindpaw, allowing the direct effects of stimuli on the DRG neuron ensemble to be studied. The number of neurons producing Ca2+ transients as well as the amplitude of Ca2+ transients indicates sensitivity to specific sensory modalities. The diameter of neurons provides evidence of activated fiber types (non-noxious mechano vs. noxious pain fibers, A&#946;, A&#948;, and C fibers). Neurons expressing specific receptors can be genetically labeled with td-Tomato and specific Cre recombinases together with Pirt-GCaMP. Therefore, Pirt-GCaMP3 Ca2+ imaging of DRG provides a powerful tool and model for the analysis of specific sensory modalities and neuron subtypes acting as an ensemble at the populational level to study pain, itch, touch, and other somatosensory signals.

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia

This protocol describes the surgical exposure of the dorsal root ganglion (DRG) followed by GCaMP3 (genetically-encoded Ca2+ indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ imaging of the neuronal ensembles using Pirt-GCaMP3 mice while applying a variety of stimuli to the ipsilateral hind paw.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Ca2+ imaging can be used as a proxy for cellular activity, including action potentials and various signaling mechanisms involving Ca2+ entry into the ...