Der axonale Transport ist entscheidend für die neuronale Gesundheit und Lebensfähigkeit. Unser Protokoll beschreibt eine elegante Methode zur Überwachung und Analyse des axonalen Transports. Und kann für verschiedene neuronale Krankheitsmodelle angepasst werden.
Der Einsatz mikrofluidischer Kammern ermöglicht eine präzise räumliche zeitliche Kontrolle, die für das Studium der Axonalbiologie von entscheidender Bedeutung ist. Axonale Transportanomalien sind mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS involviert. Die mikrofluidische Plattform ermöglicht das Studium grundlegender Mechanismen sowie das Testen von Therapien zur Reparatur axonaler Transportfehler.
Die mikrofluidische Kammerplattform kann leicht an verschiedene Aspekte der axonalen Forschung angepasst werden, einschließlich axonalem Wachstum und Degeneration verschiedener neuronaler Subtypen. Diese Methode ist komplex und wird in der Regel praxisaufbereitet. Die visuelle Demonstration wird die Zugänglichkeit dieses Verfahrens für jeden Wissenschaftler verbessern, der an der Untersuchung des axonalen Transports interessiert ist.
Beginnen Sie mit dem Gießen von PDMS in Primärformen. Verwenden Sie Druckluft, um Schmutz von der Wafer-Plattform zu entfernen, um sicherzustellen, dass die Wafer glatt und klar aussehen, bevor Sie fortfahren. Als nächstes füllen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff und bereiten Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 23-Spur-Nadel vor.
In eine chemische Rauchhaube geben Sie die Wafermitbleche in einen verschließbaren Behälter und füllen Sie die Spritze mit zwei Milliliterflüssigstickstoff pro Wafer, der Platte enthält. Öffnen Sie eine Chlorotrimethylsilanflasche. Pierce die Gummikappe mit der Spritze und injizieren Sie den Stickstoff in die Flasche.
Ohne die Nadel herauszuziehen, drehen Sie die Flasche auf den Kopf und ziehen Sie zwei Milliliter Chlorotrimethylsilan für jeden Wafer, der Platte enthält. Das Chlortrimethylsilan im Behälter verteilen, jedoch nicht direkt auf dem Wafer, der die Platte enthält. Schließen Sie den Container.
Und inkubieren Sie es für fünf Minuten pro Wafer. Als nächstes wiegen 47,05 Gramm PDMS-Basis in einem 50-Milliliter-Rohr, und fügen Sie PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 16 zu 1 Basis zu Härtungsmittel für insgesamt 50 Gramm. Mischen Sie das PDMS für 10 Minuten auf einem Low-Speed-Rotator, dann gießen Sie es in jeden Wafer mit Platte auf die gewünschte Höhe.
Legen Sie die Platten für zwei Stunden in einen Vakuumaustrocknungsor. Die Luft im PDMS eingeschlossen wird, und bilden eine klare einheitliche Form. Danach die Teller im Ofen für drei Stunden oder über Nacht bei 70 Grad Celsius bebrüten.
So erstellen Sie die mikrofluidische Kammer oder MFC. Schneiden und entfernen Sie die PDMS-Formen von der Platte mit einem Skalpell, um sicherzustellen, dass die Formen nicht zu zwingen, weil sie zerbrechlich sind. Folgen Sie den Anweisungen im Textmanuskript, um die Kammern je nach Versuchsaufbau zu stanzen und zu schneiden.
Für die Rückenmarks-Explantationskultur zwei Sieben-Millimeter-Bohrungen in die distale Seite eines großen MFC schlagen, um sicherzustellen, dass sie sich mit den Kanalkanten überlappen. Auf der proximalen Seite einen Sieben-Millimeter-Gut in die Mitte des Kanals mit minimaler Überlappung stanzen, so dass genügend Platz für die Explants bleibt. Stanzen Sie zwei zusätzliche ein Millimeter Löcher in die beiden Kanten des proximalen Kanals.
Und schneiden Sie das PDMS in Einzelkammern. Drehen Sie dann den MFC nach oben und schnitzen Sie mit einer 20-Meter-Nadel an drei kleinen Explant-Höhlen auf dem gestanzten Sieben-Millimeter-Brunnen. Für die dissoziierte motorische Neuronenkultur vier Sechs-Millimeter-Bohrungen in die Ränder der beiden Kanäle eines kleinen MFC schlagen und das PDMS in Einzelkammern schneiden.
Um den MFC zu sterilisieren, verteilen Sie 50 Zentimeter lange Klebebandbänder auf der Bank. Drücken Sie dann beide Gesichter der Kammer auf das Band und ziehen Sie es zurück. Legen Sie die sauberen Kammern in eine neue Platte und inkubieren Sie sie in analytischer Qualität, von 70% Ethanol für 10 Minuten auf einem Orbital-Shaker.
Das Ethanol entsorgen und die Kammern in einer Gewebekulturhaube oder im Ofen bei 70 Grad Celsius trocknen. Legen Sie dann die Kammer in der Mitte eines Gewebekultur Grade Glasboden graben, und wenden Sie geringfügige Kraft auf die Kanten, um das PDMS an den Tellerboden zu binden. Inkubieren Sie das Gericht für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius.
Drücken Sie dann auf die Kammern, um die Haftung zu stärken. Inkubieren Sie die Schale unter UV für 10 Minuten, dann gehen Sie mit der Codierung der MFC. Fügen Sie 1,5 Nanogramm pro Milliliter PLO in beide Fächer.
Stellen Sie sicher, dass die PLO durch die Kanäle läuft. Durch Pipettieren der Beschichtungsmedien direkt im Kanaleingang. Untersuchen Sie die MFC unter einem Lichtmikroskop, um nach Blasen zu suchen.
Wenn Luftblasen die Mikrorillen blockieren, legen Sie den MFC für zwei Minuten in einen Vakuumaustrocknungsgeräte. Entfernen Sie überschüssige Luft aus den MFC-Kanälen. Dann inkubieren Sie es über Nacht mit PLO.
Ersetzen Sie die PLO durch Laminin und inkubieren Sie den MFC für eine zusätzliche Nacht. Waschen Sie das Laminin vor der Beschichtung mit dem Kulturmedium. Sezieren Sie eine schwangere ICR E12.5-Maus und trennen Sie die Embryonen vom Fruchtwassersack.
Den Embryo in HBSS-Silikonschale geben. Entfernen Sie den Kopf und Schwanz und kippen Sie es auf seinen Bauch. Abziehen Sie die oberflächliche Haut vorsichtig von den Embryonen zurück und entblößen Sie das Rückenmark.
Trennen Sie das Rückenmark vom Körper von Kopf zu Schwanz, mit sanfter Pinzette. Entfernen Sie die Meningen, entfernen Sie dann die Dorsalhörner und schneiden Sie das Rückenmark in einen Millimeter dicken Querprofilen. Entsorgen Sie das gesamte Medium aus dem proximalen Fach des MFC.
Nehmen Sie eine einzelne Rückenmarksexplantation mit einer Pipette in einem Gesamtvolumen von vier Mikrolitern auf. Und injizieren Sie es so nah wie möglich an die Höhle. Zeichnen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem proximalen Brunnen über die seitlichen Auslässe.
Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zwei weitere Male, und stellen Sie sicher, dass die Explants in den proximalen Kanal eingebettet sind. Langsam 150 Mikroliter SCEX-Medium zum proximalen Brunnen hinzufügen. Einen Tag nach der Beschichtung.
Das SCEX-Medium im proximalen Fach ersetzt und das distale Fach mit einem reichhaltigen SCEX-Medium ergänzt. Aufrechterhaltung eines Volumengradienten von mindestens 15 Mikroliter pro Brunnen zwischen den distalen und proximalen Brunnen. Nach vier bis sechs Tagen sollten die Axone in das distale Fach gelangen und für die axonale Transport-Bildgebung bereit sein.
Um die Mitochondrien und sauren Fächer zu kennzeichnen, bereiten Sie frisches SCEX-Medium mit 100 Nanomolar MitoTracker Deep Red FM und 100 Nanomolar LysoTracker Red vor. Und fügen Sie es zu den mikrofluidischen Kammern hinzu. Inkubieren Sie sie für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Dann dreimal mit warmem SCEX-Medium waschen. Fahren Sie mit der Live-Bildgebung des axonalen Transports fort. Erfassen einer 100-Zeitraffer-Bildserie in drei Sekundenintervallen.
Mit insgesamt fünf Minuten pro Film. Nach sieben Tagen in mikrofluidischen Kammern. Maus embryonale HB9 GFP Rückenmarksexplanten.
Wir sind mit MitoTracker Deep Red und LysoTracker Red Farbstoffen gefärbt. Zur Kennzeichnung der Mitochondrien und sauren Fächer. Axone in den distalen Rillen wurden abgebildet und Kymographenanalyse wurde verwendet, um die allgemeine Bewegungsverteilung zu bestimmen.
Dies offenbarte eine Verzerrung in der rückwärtsgerichteten Richtung nur in sauren Stadtteilen, aber nicht im mitochondrialen Transport. Die Partikeldichte wurde ebenfalls quantifiziert, was eine höhere Anzahl von mitochondrialen Partikeln im Vergleich zu sauren Kompartimenten in den HB9 GFP Rückenmarks-Explantaxonen aufwies. Als nächstes wurde eine Einzelpartikeltransportanalyse mit halbautomatischer Software und anschließendem inhouse-Code durchgeführt.
Diese Analyse ergab, dass saure Komponenten und Mitochondrien ähnliche Partikelgeschwindigkeiten aufweisen. Aber nur saure Fächer zeigen eine Neigung zur retrograden Bewegung. Die Isolierung des embryonalen Rückenmarks kann zunächst schwierig sein.
Üben Sie dieses Verfahren mehrmals, um sicherzustellen, dass das richtige embryonale Alter und die entsprechenden Sezierwerkzeuge verwendet werden. Der Einsatz von mikrofluidischen Kammern verändert die Art und Weise, wie wir axonale Biologie studieren. Es ermöglicht uns, lokalisierte axonale Prozesse zu visualisieren, von denen wir einmal vermuten, dass sie nur im Zellkörper auftreten.
