DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden unter Leitlinien von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Louisville gesetzt durchgeführt, um Bundesvorschriften einzuhalten. 1. Vorbereitung der Low Ca 2+ und 2 mM Ca 2+ Künstliche Liquor (aCSF) Perfusaten <ol><li> Bereiten 2x niedrigen Ca 2+ (0,1 mM) Auf C-Puffer, 2x Normal Ca 2+ (2 mM) Auf A-Puffer und 2x Auf B-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben. Die einzelnen Stammlösungen erlauben Modifikation der Ionengehalt (zB niedrig oder null Ca 2+) und kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden. </li><li> Für intra Perfusion beim Präparieren, 100 ml 2x niedrigen Ca 2+ Lizenz C und 100 ml 2x Lizenz B in eine Plastikflasche auf 1x niedrigen Ca 2+ aCSF machen. Mischen und über Nacht bei 4 ° C oder machen frisch. </li><li> Für Durchblutung der ex vivo Rückenmark während imaging, fügen Sie 500 ml 2x Normal Ca 2+ Lizenz A und 500 ml 2x Lizenz B in einen 1 l Glasflasche auf 1x aCSF erzeugen. Mischen und über Nacht bei Raumtemperatur lagern oder kreiere frisch. </li><li> Der pH-Wert von aCSF Puffer auf 7,4. Während die aCSF bei Raumtemperatur, legen Sie die niedrige Ca 2+ aCSF auf Eis und dann Luftblasen beide Puffer mit Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) 30 Minuten vor der während der Perfusion verwendet und kontinuierlich. </li></ol> 2. Herstellung von Ex Vivo Imaging Kammer <ol><li> Wickeln Sie ein Heizdecke (keine automatische Abschaltung) um den aCSF Flasche und stellen Sie Hitze zu niedrig / mittlere Einstellung. </li><li> Legen Sie eine dedizierte aCSF Perfusionsleitung in die Flasche zu einem Perfusionspumpe und Inline-Heizung, die durch einen bipolaren Temperaturregler und Feedback-Temperaturfühler, wie in 1A gezeigt, gesteuert wird. </li><li> Befestigen Sie einen Flachmikroskoptisch Einsatz (152 x 102 mm) mit dem 2-Photonen-Anregung / confocal Mikroskoptisch mit einem Überlaufbehälter ausgestattet. </li><li> Stellen Sie ein großes Open-Bad Perfusionskammer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) in den Überlaufbehälter zur Aufnahme und ermöglichen die kontinuierliche Zufuhr von frischer Sauerstoff angereicherte aCSF auf die Ex-vivo-Rückenmark (siehe Abbildung 1B nach einer geeigneten Ex- vivo-Bildgebung Kammer-Konstruktion). </li><li> Schließen Metall Ausgangs-Port des Inline-Heizung bis zur Ex-vivo-Imaging-Kammer mit geeigneten Schlauch. Legen Sie ein dünnes absorbierendes Kissen unter dem Ex-vivo-Imaging-Kammer, um die Temperatur der Puffer / Gewebe während der Bildgebung zu halten. </li><li> Beachten Sie die Ex-vivo-Imaging-Kammer, um den Boden des Überlaufbehälter / Bühneneinsatz mit abnehmbaren klebrig. Die Formbarkeit des klebrig ermöglicht je nach Bedarf, um sicherzustellen Lichtweg des Objektivs senkrecht zur Gewebeoberfläche der Kammer eingestellt werden. Verwenden Sie gegebenenfalls eine Bullseye Ebene, um die Kammer ein. </li><li> Sicher einDurchlauferhitzer Feedback-Temperaturfühler in der Nähe der Kammer Fluideinlass und einem Stahlstutzen Edelstahl mit einer Vakuumleitung an die Kammer Steckdose angeschlossen ist. Magnetband und geeignete Mikropipette Halter sind in dieser Hinsicht nützlich. Schalten Sie die Vakuumquelle. </li><li> Schalten Sie den Perfusionspumpe zu beginnen Füllung der Imaging-Kammer mit Sauerstoff angereichert aCSF. Stellen Sie die Perfusionspumpe 1,5-2 ml pro min. </li><li> Regeln Sie die Lautstärke des aCSF in der bildgebenden Kammer durch Anpassung der Unterdruckleitung. Es ist wichtig, dass es genug aCSF werden im Abbildungsraum, um das Segment des Rückenmarks zu decken und ausreichender Arbeitsabstand zwischen einer Wassertauchobjektiv und der Gewebeoberfläche. Myelin und Axone können in Mitleidenschaft gezogen werden, wenn die Gewebesegment nicht vollständig in frischem sauerstoffreichem aCSF taucht, die zu Experimentator bedingte Artefakte. </li><li> Stellen Sie die in-line-Heizung Temperaturregler, so dass Perfusat Temperatur in der Imaging-Kammer ist in der Nähe von Raumtemperatur. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissektion der erwachsenen Maus Halsmark <ol><li> Euthanize ein Erwachsener 6-10 Wochen alte thy1 -YFP transgene Maus (Einsatz geeigneter Stamm, fluoreszierende Protein-Expression in Dorsalwurzelganglionneuronen hat) durch Injektion einer Überdosis des Narkose Natriumpentobarbital (200 mg / kg) über intraperitoneale Injektion. </li><li> Einmal unter der richtigen Ebene der Anästhesie (zB keine Reaktion bis Fuß Prise und der Verlust der Blinkreflex), sorgfältig rasiert, die Haut über dem Rückenmark und Gehirn mit chirurgischen Schneidemaschinen. Reinigen Sie die Haut mit Betadin und 70% Ethanol-Pads. </li><li> Spray Brust / Bauchbereich mit 70% Ethanol und dann durchströmen das Thema transkardial Verwendung gekühlt, Carbogen-sprudelte niedrigen Ca 2+ aCSF. (Siehe Abbildung 1C für vorgeschlagen Präparation Labortisch aufgestellt). </li><li> Da die Leber verblasst, sichern Sie die Perfusion Nadel in das Herz mit einem kleinen Clip. Drehen Sie das Thema über die rasierte Rückenseite zugreifenGegenstand und wischen Sie die rasierte Fläche mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine dorsalen Hautschnitt entlang der Mittellinie ausgehend von der Nase bis zur Hüfte mit Dissektion Schere, um das Gehirn und der Wirbelsäule (2A) aus. Sichern Sie die Vorbereitung, indem Stifte an der Nase und Keule. </li><li> Verwendung eines Dissektionsmikroskop von diesem Punkt an, fest auf der dorsalen Oberfläche des Schädels auf dem Niveau der Riechkolben geschnitten. Das eine Ende der Scherenspitzen in den seitlichen Kanten des Einschnitts und entlang den Rändern der Schädeldecke beidseitig bis Cerebellum geschnitten. HINWEIS: Nicht ganz die Schädeldecke herauszuschneiden, wie es später benötigt wird, um die darüber liegende Gewebe aus dem Rückenmark in der gesamten Dissektion heben (siehe Abbildung 2B). </li><li> Heben Sie die Schädeldecke, um das Gehirn aus. Vorsichtig schneiden Sie die linken und rechten Rand des Inkabein (im Kleinhirn befindet) und ziehen Sie sie zurück nach kaudal um den Hirnstamm / Rückenmark freizulegen (2C </strong&gt;). </li><li> Verwenden Sie feinen Spitzen Schere in einem 45 ° Winkel zur Tischoberfläche gehalten und schneiden Sie den Wirbel bilateral nur schlechter als die hinteren Nervenwurzeln. HINWEIS: Kontakt mit den hellen weißen Hinterstränge vermeiden. Diese Fasern sind diejenigen, die abgebildet werden sollen (2D) und kann leicht beschädigt werden. </li><li> Heben Sie die Schädeldecke und Rückenfläche der Wirbelsäule mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig Ziehen des darüberliegenden Gewebe in einem Stück wie Schnitte gemacht werden, um das Rückenmark aus. Weiterhin Wirbel der oberen Brust Ebene geschnitten, um eine 1-2 cm Segment der Halsmark für die anschließende Bildgebung (2E) zu isolieren. </li><li> Mit einer Schere das Gewebe / Knochen parallel zur Wirbelsäule und klare Gewebe unter der Spalte abgeschnitten. Nehmen Sie diese Schnitte möglichst waagerecht. Es ist sehr wichtig, dass das Gewebe flach in der Kammer, so dass das Kabel Ebene für die Bildgebung. </li><li> Verwenden Sie einen # 11 Skalpell, um den Hirnstamm durchschneiden (VergangenheitKündigung der Fasciculus gracilis Fasern) und an der oberen Brustniveau, um das Segment Halsmark zu isolieren (siehe 2F). Mit einer Schere Gewebe / Knochen an eben diesen zwei Punkten schneiden. Die isolierte Gewebe sollte 2/3 der Wirbelsäule umfasst das Schwanzhirnstamm, Halsanschwellung und oberen Brustrückenmarks (2G) enthalten. </li><li> Legen Sie die isolierten Wirbelsäule in eine Petrischale von Carbogen blasigen, gekühlt niedrigen Ca 2+ aCSF. Wenn nötig, schneiden Sie die darunter liegende Gewebe der Wirbelsäule, bis es in die Schüssel wieder glatt ist. </li><li> Übertragen der isolierten Wirbelsäule zur ex vivo Abbildungskammer und allmählich das Perfusat Temperatur während 1 h erhöht, um 36 bis 37 ° C. Halten Sie diese Temperatur während der Bildgebung. </li></ol> 4. Vermittlung von Ex vivo Rückenmark in Imaging Chamber und Myelin Markierung mit Nile Red <ol><li> Die Wirbelsäule vorsichtig zu sichern in der i-maging Kammer mit einem geeigneten Beschlag Scheibe halten Sie mit einer vertikalen Grid-Plattform, bestehend aus feinen Fäden Lycra modifiziert (entfernen mittleren Fäden der Grid-Plattform, um Platz für das Rückenmark zu ermöglichen; siehe 3A). </li><li> Tauwetter ein Aliquot Nile Red (5 mM Stamm in DMSO und 0,22 um gefiltert, kann für 1 Monat bei 4 ° C oder 6 Monate bei -20 ° C im Dunkeln gelagert werden). Unmittelbar vor Zugabe Nilrot zur Abbildungskammer, reduzieren die Strömung der Perfusionspumpe und Einstellen der Vakuumleitung, um sicherzustellen, das Fluid in der Kammer umfasst immer das Rückenmark. </li><li> In 5-10 ul Nilrot Stammansatzes auf den Imaging-Kammer in der Nähe der Schwanz Ende der Schnur (3B). Verwenden Sie eine 1 ml Pipette vorsichtig mischen Nilrot in der gesamten Kammer. Lassen Nilrot in Kammer für 1-2 min zu bleiben, dann legen Sie Druckleitung zurück und stellen Perfusionspumpe auf 1,5-2 ml pro Minute kontinuierlich durchströmen das Rückenmark. </li><li> Den Mikroskoptisch vorsichtig anhebenund Ausrichten des Ziels mit der Mitte des Rückenmarksegment und medial über die dorsalen Säulen, bis die Wasserimmersionsobjektiv ist ungefähr 10 mm von der Oberfläche des aCSF in der Kammer. Verwenden Sie die Mikroskopobjektivrevolver Fokus Rad, um das Ziel langsam senken, bis sie ihn leicht berührt die Oberfläche des aCSF. Verwenden Sie ein epifluoreszenten Lichtquelle, um die Hinterstränge in das Sichtfeld (Abbildung 3C) zu konzentrieren. </li></ol> 5. Ex-vivo-Bildgebung der Maus Spinal Cord mit TPLSM und Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen (Liščí) HINWEIS: Die posteriore Vene ein nützlicher Marker, um das Gewebe wie die gracilis fasciculus Fasern zu zentrieren (stammen vom Zellkörper der dorsalen Wurzelganglien und steigen von T6 und unten entlang der Mittellinie des Rückenmarks) parallel zu dieser Blutgefäßes. Die dickeren YFP + Halsalgan Projektionen bieten auch ein nützlicher Marker wie die Fasern und abstiegs seitlich zur YFP + gracilis fasciculus Fasern, die im Durchmesser kleiner sind. <ol><li> Sobald das Rückenmarksgewebe wird entsprechend ausgerichtet, Schalter Laser-Scanning-Modus Basislinie Abbildung der aufsteigend Fasciculus gracilis markhaltigen Fasern durchzuführen. Um sowohl YFP und Nilrot erregt, mit einem Zwei-Photonen-Laser-Quelle auf 950 nm Wellenlänge (~ 17 mW, gemessen bei der Ausfahrt eines 25X, 1,1 NA-Objektiv) und geeignete dichroitische (DM) und Bandpassfiltern abgestimmt, um die Fluoreszenzemission zu isolieren der Fluorophore (wir verwenden 525/50 DM560, DM640 600/60 und 685/70, zu YFP und Nilrot in gelb-orange, rot und erweiterte Kanäle jeweils getrennt). <ol><li> Wenn mehr als 3% der Axone axonalen Sphäroiden während der Baseline-Bildgebung (30-60 min) zeigen, entsorgen Sie die Vorbereitung durch Experimentator bedingte Artefakte. </li></ol></li><li> Induzieren eine Liščí durch Vergrößerung des Sichtfelds zu 30.3X (einen Durchmesser Ablation ~ 20 &amp; mgr; m zu erzeugen). Stellen Sie den Laser bis 800 nm, und erhöhen Sie die Leistung des Lasers auf ~ 110 mW beidie Probe. Lassen Sie 5 komplette Sichtfeld Laserscans, um sicherzustellen, Fasern vollständig durchtrennt werden. </li><li> Bestätigen Liščí indem Lasereinstellungen auf Bildeinstellungen (950 nm, 17 mW bei der Probe, 2.08X) und scannen Sie das Gewebe, um die Ablation zu visualisieren. Überprüfen der Durchmesser der Ablation und die Primär ablatiert Axone vollständig durchtrennt (siehe Figur 3D). Verwenden Sie Zeitraffereinstellungen am Mikroskop in Kombination mit z-Capture, um die Dynamik der Axone und Myelin um Verletzungen bis zu 8-10 + h nach der Verletzung zu erfassen. HINWEIS: Wenn der Ablation ist unvollständig (dh unvollständige Durchtrennung von Fasern), entsorgen Sie die Vorbereitung, die Bestimmung von primären und sekundären Verletzungsmechanismen wird verwechselt werden. Außerdem isoliert Rückenmarksegmente kann bis zu 24 Stunden nach der Liščí mit nur leichten abgebildet werden bis mittel Liščí unabhängige Gewebeschäden. </li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Bildgebung des Rückenmarks myelinisierten Axone (dh Fasciculus gracilis), kombiniert mit einem Laser-induzierte Verletzung des Rückenmarks, die dynamische Fortschreiten der primären und sekundären myelinisierten axonale Degeneration im Laufe der Zeit zu studieren. Ex-vivo-Bildgebung der Oberfläche das Rückenmark überwindet viele der Komplikationen, die mit in-vivo-Abbildung zugeordnet, wie Bewegungsartefakte und das Potential der Experi...

Degeneration von Axonen ist eine prominente Ursache für Morbidität über mehrere neurologischen Erkrankungen einschließlich Neurotrauma, Schlaganfall, Autoimmunerkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen. Im Gegensatz zu dem peripheren Nervensystem (PNS), Zentralnervensystem (ZNS) Axone haben eine begrenzte Kapazität zu regenerieren, sobald aufgrund sowohl intrinsische als auch extrinsische Barrieren (dh inhibitorische Moleküle axonale Wachstum während der Narbenbildung während der Myelindegeneration produziert und freigesetzt) ​​1 verletzt -7. Obwohl einige dieser Hindernisse wurden intensiv erforscht, therapeutische Interventionen Ziel, ZNS-axonale Degeneration verhindern, fördern robuste axonale Regeneration und Wiederherstellung funktions verbindend, begrenzt bleiben. Axone einmal von ihren Soma getrennt durchlaufen eine stereotype Prozess der Degeneration wie Waller-Degeneration, die durch axonalen Schwellungen, Sphäroid Bildung und eventuelle Fragmentierung (in 8 mit Beiträgen) gekennzeichnet ist bekannt. InDagegen ist der proximale Stumpf, der in Kontinuität mit dem Soma eines durchtrennten peripheren Axonen bleibt, bildet eine Schwellung an seinem Ende, Matrizen zurück zur nächsten Knoten Ranvier, und kann dann zu initiieren Wachstumskegel Aufstellung für nachfolgende axonale Regeneration eine wichtige Voraussetzung erforderlichen 9-11. Im Gegensatz dazu sind die proximalen Enden von axonalen vielen zentralen Axone bilden charakteristische &quot;endbulbs&quot; oder Einfahren Glühbirnen, nicht zu Wachstumskegeln bilden, und statt zurückzuziehen von der Verletzungsstelle, wo sie für die Monate nach der Verletzung 12-15 bleiben. Neben der primären axonalen Schädigung, können zusätzliche axonalen Schäden / Verluste auch Axone, die im Wesentlichen aus der anfänglichen Verletzung verschont auftreten. Diese verzögerte axonalen Verlust zunächst verschont Axone wird als Sekundär axonale Degeneration bezeichnet. Diese inhärente Reaktion von ZNS Axone Schädigung macht funktionale axonale Regeneration noch schwieriger Ziel im Gehirn und Rückenmark zu erreichen. Obwohl hallmarks der axonalen Schädigung (zB Sphäroidbildung, Rückzug Glühbirnen) wurden auch von post-mortem Gewebe und experimentellen Modellen der axonale Degeneration gekennzeichnet hat Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser dynamischen Prozesse sind beschränkt. Die meisten dieser Studien angeführten statischen Endpunkt Beobachtungen, die von Natur gescheitert einzelne axonalen Antworten über die Zeit zu erfassen. Obwohl exogen applizierten axonalen Tracern nützlich gewesen zu axonalen Antworten von statischen Abschnitten und während der Live-Bildgebung zu klären, hat die Verfügbarkeit von genetisch kodierten axonalen Marker stark verbessert unsere Fähigkeit, Axone in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. In der Tat, eine wegweisende Bericht Kerschensteiner und Kollegen zunächst vorgesehen unmittelbarer Nachweis der axonalen Degeneration und Regeneration in vivo mit Thy1 -GFP-S Mäuse, die das grün fluoreszierende Protein in Teilmengen von Neuronen, die ihre Projektionen in die Hinterstränge des Rücken senden kodierenKabel 16. Live-Imaging-Ansätze mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) und genetische fluoreszierende Protein Markierung von Zellen von Interesse nach wie vor direkte Beweise und mechanistischen Einblick in viele verschiedene dynamische Prozesse wie axonale Degeneration, Ca 2+ Signal, axonale Regeneration, Astrozyten Physiologie liefern, Mikroglia Physiologie und Reaktion auf eine Verletzung 17-25. Im Gegensatz zu den Axonen ist sehr wenig von Myelin Reaktionen auf Verletzungen in Echtzeit bekannt. Myelin ist ein wesentlicher Bestandteil der weißen Substanz produziert und von Oligodendrozyten im ZNS und Schwann-Zellen in der PNS erhalten. Myelin isoliert 99% der Oberfläche von Axonen und dadurch eine hochohmige, kapazitätsarme Schutzabdeckung, die eine schnelle und effiziente saltatory Impulsausbreitung, die kürzlich von Buttermore et al. 26 überprüft unterstützt. Um die Dynamik von Myelin, um Verletzungen verwenden wir die solvatochromen, lipophile erfassenFluoreszenzfarbstoff Nile Red 27. Solvatochromen Eigenschaften dieses Vitalfärbung erlauben Spektralverschiebungen seines Emissionsspektrums, das von der physikalisch-chemischen Umgebung 28,29 ist. Diese Eigenschaften sind nützlich, um Einblick in die Mechanismen der axomyelinic Verletzungen zu gewinnen und können mit entsprechend ausgewählten dichroitische und Emissionsfilter sichtbar gemacht oder gelöst mit spektralen Mikroskopie 27 werden. Zum Beispiel ist Nilrot Emissionsspektrum blau-verschoben in weniger polare lipidreichen Umgebungen, wie sie in Adipozyten und normale CNS Myelin (Spitzenemission ~ 580-590 nm) 27 gefunden. Im Gegensatz dazu Emissionsspektrum Spitzen dieser Vitalfarbstoff ist bei ~ 625 nm in endbulbs wie Axone gebildet ziehen axonalen Sterben 27. Obwohl die genauen Mechanismen dieser spektralen Verschiebungen speziell in endbulbs gegenüber normalen Myelin unklar bleiben, können solche spektralen Veränderungen zugrunde liegenden Veränderungen der Proteinakkumulation oder Desorganisation, die zu enthüllenExposition von hydrophoben Bindungsstellen 27. Während in-vivo-Bildgebung ist die entscheidende Messgröße für die Beobachtung des Rückenmarks axonalen Verletzungen Dynamik in ihrer natürlichen Umgebung, es ist technisch anspruchsvoll und erfordert erhebliche chirurgischem Know-how und oft wiederholen Operationen, um die dorsalen Säule, die experimentellen Artefakten führen kann ausgesetzt werden (zB Entzündungen und Narben Bildung). Außerdem ist teure Ausrüstung oft notwendig, um Suspendierung und Positionierung von einem intakten Tier unter der Mikroskopobjektivlinse ermöglicht. Die Tiere müssen sorgfältig überwacht werden, als auch, um sicherzustellen, bleiben sie warm, um sicherzustellen, Flüssigkeiten wieder aufgefüllt werden, und um sicherzustellen, gibt es keine Anzeichen von Hypoxie aufgrund längerer betäubt Imaging-Sitzungen. Letzteres ist äußerst wichtig, da Axone und Myelin unbedingt benötigen konstante Durchblutung und eine angemessene Sauerstoffgehalt lebensfähig zu bleiben. Dies ist jedoch oft nicht gemeldet oder in den meisten in-vivo-Studien zu überwachenDatum. Zusätzlich Bewegungsartefakte durch Herzfrequenz und Atmung (Isofluran erwachsenen Maus: ~ 300-450 Schläge pro Minute (BPM) ist optimal, um 97 bis 98% Sauerstoffsättigung (wie normal ~ 632 BPM) und pflegen ~ 55-65 Atemzüge pro min (normal ist ~ 163 Atemzüge pro min), beziehungsweise)) 30 während der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make begegnet differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie Herausforderung als auch die schnellsten Laserscans unvermeidlich unterliegen diese Bewegung Artefakte. Fortschritte in der ultraschnellen Resonanzscanner in Verbindung mit einem implantierbaren starren Wirbel gerahmte Fenster können Abbildung der Maus Rückenmark bei wachen Tieren zu ermöglichen, aber schnellere Scanzeiten zwangsläufig das Signal-Rausch-Verhältnis Bild erniedrigender Qualität. Weitere Verbesserungen in der Rückenmarksbildgebenden Verfahren, wie sie derzeit für die Bildgebung des Gehirns verwendet werden, können viele dieser Hindernisse zu überwinden und potenziellen verwechselt von ina eingeführt begrenzendequate Gewebedurchblutung, zB 31-33. Vieles, was über der weißen Substanz Physiologie und Mechanismen der weißen Substanz Verletzungen bekannt wurde nach den in vitro oder ex vivo Zubereitungen der weißen Substanz von Sehnerv, der peripheren Nerven und Bänder des Rückenmarks weißen Substanz 34 bis 41 bestimmt. Diese Präparate weiterhin unser Wissen über weißen Substanz Verletzungsmechanismen zu fördern, da sie ermöglichen eine kontrollierte Veränderungen der Umweltfaktoren, kontrollierte Anwendung von Arzneimitteln und Reagenzien, Funktionsprüfungen mit der Elektrophysiologie und die direkte Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen der Axone und Myelin in lebendem Gewebe. Doch einige frühere Ansätze zur Axone Rückenmark dorsalen Säule Streifen oder ventralen weißen Substanz Streifen beobachten unweigerlich verletzen Oberfläche Axone während der Entfernungsstufe, die die Reaktion von eng gegen Axone beeinflussen können. Um auf die experimentelle Manipulationen oben zu nutzen und vermeiden Schäden an der very Fasern untersucht, verwenden wir eine ex vivo Halsmark-Modell, da es einen direkten Kontakt der Dorsalseite des Kabels verhindert. Somit ist die Architektur der Pia und neben oberflächlichen dorsalen Säule Axone tragfähige und gelassen bleiben, während der Isolierung. Hier beschreiben wir eine relativ einfache Methode, die direkte Visualisierung von zentraler markhaltigen Axonen, da sie dynamisch mit einer Brenn Verletzungen in Echtzeit bis zu 8 reagieren können - 10+ Stunden nach der Verletzung. Die laserinduzierte Verletzung des Rückenmarks (Liščí) Modell erlaubt die Unterscheidung zwischen primären und sekundären axonalen Verletzungsmechanismen als primäre Läsion (Ablationsstelle) bleibt räumlich über die Zeit eingeschränkt. Die Open-Bad Abbildungskammer ist zugänglich für eine therapeutische Intervention, Reagenz Lieferung und Umwelt Manipulationen. Vermeintliche axomyelinic Schutzmittel lassen sich schnell in Echtzeit durch direkte Beobachtungen gegenüber langwierigen und kostenintensiven Experimenten mit Gewebeprozess bewertet werdening, Schneiden, Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse und daher eine nützliche Ersatzmodell zu akuten Reaktionen und Schutz Manipulationen vor der Prüfung die experimentellen Agenten mit lebenden Tieren zu bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Verletzte CNS Axone nicht zu regenerieren und oft zurückziehen von der Verletzungsstelle. Axone aus der anfänglichen Verletzung verschont später sekundärmetallurgisch axonale Degeneration. Mangel an Wachstumskegel Bildung, Regeneration, und der Verlust von weiteren markhaltigen Axonen Projektionen im Rückenmark stark einschränkt neurologische Erholung nach einer Verletzung. Um zu beurteilen, wie zentral myelinisierten Axone im Rückenmark, um Verletzungen zu reagieren, haben wir eine ex vivo lebenden Rückenmark-Modell unter Verwendung von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Axonen und eine Brenn und hoch reproduzierbare Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen zum Ausdruck bringen, um das Schicksal zu dokumentieren Axone und Myelin (lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nile Red) im Laufe der Zeit mit Zweiphotonenanregung Zeitraffer-Mikroskopie. Dynamische Prozesse wie akute axonale Verletzung, axonale Retraktion und Myelin-Degeneration sind am besten in Echtzeit untersucht. Doch die Nichtschwerpunkt Natur Prellung basierte Verletzungen und Bewegungsartefakte auftretenwährend der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Mikroskopie Herausforderung. Der Ex-vivo-Rückenmark-Modell hier beschriebenen imitiert verschiedene Aspekte der klinisch relevanten Prellung / Kompression induzierte axonalen Pathologie einschließlich axonalen Schwellungen, Sphäroidbildung, axonalen Durchtrennung und peri-axonalen Schwellungen ein nützliches Modell, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu studieren. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind ausgezeichnet räumlich-zeitliche Auflösung, die Differenzierung zwischen Primär- Beleidigung, die direkt verletzt Axonen und sekundären Verletzungsmechanismen ermöglicht; kontrollierte Infusion von Reagenzien direkt auf den Perfusat Bade das Kabel; präzise Änderungen der Umgebungsmilieu (zB Calcium, Natriumionen, bekannt Beitrag axonale Verletzung, aber praktisch unmöglich, in vivo zu manipulieren); und Maus-Modelle bieten auch einen Vorteil, da sie die Möglichkeit bieten, zu visualisieren und zumanipulieren genetisch identifizierten Zellpopulationen und subzellulärer Strukturen. Hier beschreiben wir, wie die Isolierung und das lebendige Bild Rückenmark von Mäusen, um die Dynamik der akuten axonalen Verletzungen zu erfassen.

Einzelheiten einer geeigneten Labor einrichten musste isolieren, halten die Lebensfähigkeit und die Bild ex vivo Rückenmark ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Mikroskop muss mit einem abstimmbaren gepulsten Femtosekundenlaser, entsprechende dicroics und Emissionsfiltern und einem wasser ausgestattet werden Eintauchen Objektivlinse mit einer hohen numerischen Apertur (≥1.0). Die Lebensfähigkeit des Rückenmarks während der Präparation zu gewährleisten, sollte das Verfahren in Gegenwart ...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Aufrufe.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Serie: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Forschung

Neurowissenschaften

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Activity-based Training auf einem Laufband mit Rückenmark verletzt Wistar-Ratten

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...