Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien G0400268 und MR / K018396 / 1 von der Medical Research Council unterstützt und durch Aktions Medizinische Forschung. Weitere Unterstützung wurde von der National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedizinische Forschungszentrum zur Verfügung gestellt.

Alle Tierversuche in dieser Studie durchgeführt entsprach nationalen und europäischen Gesetzgebung und wurden von der Ethikkommission der UCL School of Pharmacy und dem britischen Home Office (HO) genehmigt. Alle Tier Arbeit wurde unter HO-Projekt durchgeführt Lizenzen PPL 80/2243 und PPL 70/7773. 1. Ratte Vorbereitung <ol><li> Führen Sie alle in vivo Experimente mit keimfreien Wistar neugeborenen Ratten. </li><li> Bewahren Sie alle Ratten Würfe (12 Neugeborenen pro Volk) in Einzelkäfigen mit ihren stillende Mütter (9-11 Wochen alte Weibchen), unter optimalen Bedingungen (19-21 ° C, 45 - 55% Luftfeuchtigkeit, 15 bis 20 Luftwechsel / h und 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus). </li></ol> 2. Bakterienzellpräparation <ol><li> Shop E. coli K1 Bestände in 20% (v / v) Glycerin bei -80 ° C. Für jedes Experiment Platte heraus stock Bakterien auf Mueller-Hinton (MH) Agarplatten, und bei 37 ° CO / N. </li><li> Am Tag vor Fütterung, inocuspäten 10 ml MH-Brühe mit einem einzigen E. coli K1 Kolonie und Kultur O / N bei 37 ° C, 200 Upm. Als Kontrolle für mittlere Verunreinigungen, bereiten 10 ml unbeimpften MH-Brühe und bei 37 ° C bei 200 Upm. </li><li> Transfer 100 ul O / N Bakteriensuspension in 9,9 ml MH-Brühe (1: 100 v / v), und bei 37 ° C, 200 rpm, bis zur mittleren exponentiellen Phase erreicht ist, entsprechend einer optischen Dichte von 0,6 bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) gemessen. </li></ol> 3. Fütterung von neugeborenen Ratten mit E. coli K1 <ol><li> Halten Sie das Tier vertikal in einer Hand aus dem Genick, so dass der Mund zu öffnen. Langsam legen Sie die sterile Pipettenspitze in den Mund des Tieres und Pipette 20 ul des Inokulums (~ 37 ° C) in den Mund des Tieres über einen 30 sec Zeitraum. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter sofort nach der Fütterung. </li><li> Überprüfen Sie, dass 4 - 8 x 10 6 Bakterien wurden gefüttert to jeder Welpe durch serielle Verdünnung des Inokulums in PBS und Spek auf MH-Agar-Platten. </li></ol> 4. Bewertung der Kolonisation durch E. coli K1 <ol><li> Halten Sie das Tier mit einer Hand aus dem Genick. Befeuchten Sie ein steriles Wattestäbchen in sterilem PBS, und dann sanft Tupfer Perianalbereich. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter unmittelbar nach Abtupfen. </li><li> Legen Sie die Tupferspitze in ein Röhrchen mit 300 ul sterilem PBS und Lagerung auf Eis. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten. </li><li> Bestimmen tragfähige E. coli K1 durch Bakteriophagen Empfindlichkeitsprüfung. Wählen Sie ein Einzelkolonie mit einer sterilen mikrobiologischen Schleife, eingetaucht in 200 ul sterilem PBS, dann unterliegen Wirbelmischung. </li><li> Mit einem sterilen mikrobiologischen Schleife, Subkultur auf MH-Agar in einer geraden Linie. Damit die Platte für 30 Sekunden zu trocknen, und dann Pipette 10 ul bacteriophage K1E (10 9 Plaque bildenden Einheiten / ml (PFU / ml)) auf die Mitte der Linie. Die Platte O / N bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, untersuchen Sie die Platte für Bakteriophagen-vermittelte Lyse. </li></ol> 5. Bewertung der Schwere der Erkrankung <ol><li> Beurteilen Sie den Schweregrad der Erkrankung der einzelnen Tiere 4-5 mal täglich mit der Sieben-Punkte-Bewertungssystem in der Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Wenn ein Tier Partituren ≥3 von 7 sofort keulen das Tier so lange leiden muss. Nehmen Sie das Tier wie tot. </li></ol> 6. Euthanasie von neugeborenen Ratten und Blutentnahme <ol><li> Halten Sie das Tier in der einen Hand, Aussetzen der Kopf und Hals. Desinfizieren Sie den Hals des Tieres durch Abwischen mit einem Alkoholtupfer. Desinfizieren Sie eine große Schere mit 70% Ethanol, vor dem Spülen in sterilem PBS, um Spuren Ethanol zu entfernen. </li><li> Halten Sie das Tier direkt über einer Petrischale. Enthaupten Neugeborenen mit scharfen surgical Schere, um sicherzustellen, dass das Blut tropft in der Petrischale. Kontakt mit dem Kopf, um eine Verunreinigung des Blutes mit Hautflora zu verhindern vermeiden. </li><li> Sofort sammeln das Blut mit einem sterilen Pipette zugeben und mischen mit Heparin-Natriumsalz in einer Konzentration von 20 bis 50 Einheiten / ml in einer 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger E. coli K1 durch Testen der Empfindlichkeit von lebensfähigen Bakterien, Bakteriophagen K1E. </li></ol> 7. Dissection <ol><li> Nach Enthauptung des neugeborenen Ratten, verwenden aseptischen Bedingungen verbrauch und sammeln Geweben von Interesse. Waschen Sie alle Instrumente (in Abbildung 1 dargestellt) in 70% Ethanol und sterilem PBS. </li><li> Reinigen Sie die Dissektion Bord und benetzen die Leib vollständig mit 70% Ethanol. Positionieren Sie den Leichnam auf seinem Rücken und zu beheben, um die Dissektion Bord durch (i) Pinning die linke Hinterbein zuDie Betriebstabelle mit einer sterilen Nadel, (ii) Strecken der Leiche und Pinning die rechte Vorderbein auf dem Operationstisch, (iii) die Pinning rechten Hinterbein und das linke Vorderbein auf dem Operationstisch. </li><li> Ziehen Sie die Haut an der linken Seite des Unterleibs mit einer Pinzette, dann entlang der linken Seite der Leiche aus dem Unterbauch bis zum Brustbein mit kleinen Dissektion Schere geschnitten. </li><li> Verlängern Sie die Exzision über dem Brustbein, und dann auf der rechten Seite der Leiche vom Brustbein zu den Unterleib mit einer Pinzette und kleine Dissektion Schere, um sicherzustellen, dass keine der zugrunde liegenden Strukturen sind beschädigt. </li><li> Schließlich ziehen Sie vorsichtig nach unten die Hautlappen vom Brustbein zu den Unterbauch mit Iris gekrümmten Dissektion Pinzette auf das Bauchfell aus. </li><li> Heben vorsichtig das Bauchfell mit einer Pinzette und schneiden vertikal um die inneren Organe freizulegen, um sicherzustellen, dass keiner der Basiswerte Organe werden geschädigt. </li></ol> 8. SammelnGI-Trakt <ol><li> Identifizieren Sie den Magen, Dünndarm, Blinddarm, Dickdarm und mesenterialen lymphatischen Systems. </li><li> Entfernen Sie den Magen durch leichtes Durchtrennung an beiden Seiten und anschließend in einem Bijou mit 1,6 ml steriler PBS mit einer sterilen Pinzette. </li><li> Transekt den Doppelpunkt am Rektum. Ziehen Sie das gesamte Darmmasse von der Leiche mit Dissektion Pinzette und in einer sterilen Petrischale. Sicherzustellen, dass dies leicht getan, damit der Darmstruktur und mesenterialen Lymphknoten Strukturen nicht trennen. </li></ol> 9. Trennung des GI-Trakts und der mesenterialen Lymphsystem (Abbildung 2) <ol><li> Gießen Sie 30 ml steriler PBS in der Petrischale, die Gewährleistung der GI-Trakt vollständig eingetaucht ist. </li><li> Identifizieren Sie die zentrale Masse des mesenterialen lymphatischen Systems, und eine Prise mit feinen Sezierung Pinzette. Identifizieren Sie die meisten proximalen Teil des Dünndarms, und kneifen mit feinen Sezierung Pinzette. </li><li> Ziehen Sie langsam die Central Masse mesenterica Lymphsystem und dem distalen Dünndarm, in entgegengesetzte Richtungen, bis die beiden Gewebe sind vollständig voneinander getrennt. Führen Sie diesen Vorgang mit Sorgfalt, um sicherzustellen, dass der Dünndarm sind nicht gestreckt, da dies verhindert, dass reproduzierbare Sammlung von proximalen, mittleren und distalen Regionen. Platzieren Sie den mesenterialen Lymphsystem in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 10. Schnitte des GI-Trakts <ol><li> Schneiden den GI-Trakt in den Blinddarm, den Dünndarm aus dem Dickdarm zu trennen. </li><li> Platzieren Sie den Doppelpunkt in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li><li> Sammeln repräsentative Gewebe von proximalen, mittleren und distalen Bereiche des Dünndarms. Richten Sie den Dünndarm aus dem Mittelpunkt. </li><li> Dann, (i) Sammeln der letzten 2 cm des Gewebes vor dem Blinddarm zum distalen Dünndarm, (ii) Sammeln des Gewebes 5-7 cm über dem mittleren Punkt zum proximalen Dünndarm und(Iii) Sammeln des Gewebes von 3 - 5 cm unterhalb des Mittelpunkts zur Mitte des Dünndarms. </li></ol> 11. Das Sammeln der Leber <ol><li> Identifizieren der drei Keulen der Rattenleber nach dem Entfernen des Magens. </li><li> Ziehen Lappen weg von der Bauchhöhle mit feinen Sezierung Pinzette. </li><li> Entfernen Sie die Leber durch Schneiden keine Befestigung Bänder mit einer feinen Schere. Zeigen Leber in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 12. Das Sammeln der Milz <ol><li> Identifizieren Sie die Milz. </li><li> Ziehen Milz vom Magen und verwenden feinen Schere, um die gastro Bänder geschnitten. </li><li> Zeigen Milz in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 13. Das Sammeln der Nieren <ol><li> Identifizieren die Nieren, die an der Rückseite der Bauchhöhle nach der Entfernung des Magen-Darm-Trakt und anderen Organen sichtbar wird. </li><li> Cut Harnleiter und alle Befestigungsbänder usingen feinen Sezierung Schere und Nieren zu entfernen mit feinen Pinzetten. Entfernen Nebennieren und jede Fettmaterial (falls noch angebracht) mit feinen Pinzetten und Dissektion Schere. </li><li> Legen Sie beide Nieren in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis. </li></ol> 14. Das Sammeln der Hirn <ol><li> Nach Enthauptung, halten Sie den Kopf in einer aufrechten Position mit einer gebogenen Pinzette. Pinch Haut auf dem Kopf in Längsrichtung mit einem anderen Satz von gebogenen Pinzette und einen Einschnitt mit feinen Sezierung Schere. Schneiden verbleibende Haut nahe Hals, nochmals in Längsrichtung mit feinen Sezierung Schere. </li><li> Ziehen Sie die Haut in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzette auf beiden Seiten, um den Schädel zu offenbaren und zu entfernen Hautlappen mit feinen Sezierung Schere. Zeigen feinen Sezierung Schere in Rückenöffnung und einen Einschnitt entlang der Schädel in Richtung der Tribüne. </li><li> Ziehen Sie die beiden Teile der Schädel in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzetten. Schnitt auf Schädelsegmente zu entfernen. </li><li&gt; Gehirn entfernen mit breiten Zangen, mit einem nach oben schaufeln Bewegung aus dem Rücken Öffnung gegenüber der Tribüne. Waschen Sie das Gehirn in PBS ausklopfen, um Blut aus Enthauptung Verfahren zu entfernen. </li></ol> 15. Gewebeverarbeitung und Homogenisierung <ol><li> Für Experimente erfordern Lebensfähigkeit zählt oder DNA-Extraktion, Ort Geweben in Röhrchen mit sterilem PBS. Die Zahl der lebensfähigen Bakterien sofort feststellen, durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten, oder bei -20 ° C mit 20% Glycerin für kurzfristige. Zur DNA-Extraktion, speichern Gewebe bei -20 ° C. </li><li> Für Experimente RNA-Extraktion, Ort Geweben in geeignete Volumina RNAlater Lösung (10 ul pro 1 mg Gewebe) erfordern, dann sofort bei -20 ° C für kurzfristige oder bei -80 ° C Langzeitlagerung. </li><li> Für Experimente Bildgebung bedürftigen Ort Gewebe in 10 ml Methacarn-Lösung (60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Essigsäure), dann speichern Sie eint RT (20 - 25 ° C) für bis zu 3 Wochen. </li><li> Berechnen Gewebegewicht durch Vergleich des Gewichts der Rohre vor und nach Zugabe von Geweben. Homogenisieren Gewebe mit einem Homogenisator. Einmal in 70% Ethanol und wasche zweimal den Homogenisator in sterile PBS dazwischen Homogenisierung jeder Probe. HINWEIS: Methacarn Fixierung ist wünschenswert für die Fixierung von Darmproben, um Mucin bedingte Schleimhautverteidigungsstrukturen zu bewahren; Formalin-Fixierung kann zur systemischen Geweben verwendet werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die hier beschriebene Tiermodell baut auf früheren Arbeiten, die auf die hervorstechenden Merkmale von natürlich vorkommenden Infektionen beim Menschen reproduzieren sollen. Neugeborenen Ratten wurden zunächst eingesetzt, um das Kinder Meningitis aufgrund H. studieren influenzae Typ b als die Art erfüllt die wichtigsten Kriterien für ein robustes Modell der Infektion. Somit sollte der Eintrittspforte des betreffenden Krankheitserregers der des natürlichen menschlichen Infektion reflektieren und reproduzierbar führen zu ähnlichen Pathologie von ausreichender Dauer, um für eine therapeutische Intervention zu ermöglichen. Die Techniken verwendet werden, nicht die Anwendbarkeit des Verfahrens begrenzt und sollte nicht auf den Krankheitsverlauf 20 bei. Das Modell von H. influenzae Meningitis bei Säugling Ratten durch Moxon und Kollegen entwickelten entspricht diesen Kriterien 20; die natürliche Infektion tritt nach der Kolonisierung der Schleimhäute der oberen Atemwege und dieses wichtige Merkmal wurde in Rattenjungen durch nicht-Trauma replizierttic Instillation der Bakterien auf die Membranen der Nasengänge. Wichtig ist, dass die altersabhängige Natur der Infektion im Modell nachgebildet. Die gleiche Gruppe waren auch die ersten, um eine nicht-invasive Modell von E. entwickeln coli K1 NBM in der neonatalen Ratten-22. Pathogen-freie Sprague-Dawley-Jungtiere wurden durch Zuführen 10. AUGUST - 10. Oktober Bakterien durch eine Magensonde oral kolonisiert; Das Inokulum wurde daher erheblich höher als die von uns eingesetzten. Besiedlung mit den drei K1-Stämmen untersucht, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) und LH (O75: K1: H3), trat bei einem relativ hohen Anteil (48-74%) des K1-gefütterten Tieren, aber Fälle von Bakteriämie, Meningitis und Mortalität waren variabel und deutlich niedriger als Raten von Kolonisation. Die klonale Natur E. coli K1 experimentelle Infektion wurde später 23 hergestellt, und es ist nun ersichtlich, dass nur O18: K1 und, in geringerem Maße, O7: K1 sind Serotypen Lagekonsequent verursachen systemische Infektion. Aus diesem Grund wird dieser Untersuchungen der Pathogenese neuropathogenic E. K1-Stamm A192PP: coli K1 wurden auf die Verwendung der Virulenz verstärkte O18 basiert. Ein Vergleich des E. coli K1 Zuführung von neugeborenen Ratten durch eine Magensonde, wie Glode und Kollegen 22 und einer Tröpfchenzufuhrverfahren der Todesfälle mit der früheren Methode, nahezu sicher auf Schäden verwendet werden, wie durch Achtman Gruppe 23 verwendet ergab eine übermäßige Anzahl an Oberflächen von mukosalen Magensonde. Da die Sätze der Kolonisierung sind vergleichbar mit diesen zwei Verfahren ist es empfehlenswert, die weniger invasive Verfahren zum Zuführen der Bakterien mit einer Pipette mit einer sterilen Spitze zu verwenden, wie in dieser Mitteilung beschriebenen. E. coli-Stamm A192PP in unseren Studien verwendete O18: K1. Es ist ein virulenter Derivat der klinischen Stamm E. coli A192, die ursprünglich von einem Patienten mit Septikämie 27 gewonnen wurde </sup&gt;. Die erhöhte Virulenz des Stammes wurde durch serielle Passage durch neugeborenen Ratten 26 erhalten. Der Stamm löst eine altersabhängige Krankheitsschwere, mit 100% Bakteriämie und Mortalität bei bis 2 Tage alten Tieren 28 verabreicht. Im Gegensatz dazu gibt 9 Tage alten Tieren vollständig resistent gegen Krankheiten. K1-spezifische lytische Bakteriophagen verwendet, um E. differenzieren coli K1 aus anderen E. coli-Stämme 29. In dieser Studie sollte die Anfälligkeit der lebensfähigen Bakterien Bakteriophagen K1E um (i) verwendet werden überprüfen die Reinheit des E. coli K1 Suspensionen hergestellt, die den Tieren zugeführt werden, und (ii) unterscheiden, um E. coli K1 aus anderen Coliformen, um die Lebensfähigkeit in perianalen Tupfer, Blut- und Gewebeproben zu berechnen. Wenn die Kolonie E. coli K1, werden sie anfällig für Bakteriophagen K1E Lyse sein und Bakterienwachstum wird an der Stelle des Bakteriophagen Impfung verhindert werden. Wenn die Kolonie nicht E. coli K1, wird be beständig KIE Bakteriophagen Lyse, und es sollte ein Bereich des Bakterienwachstums an der Stelle der Inokulation Bakteriophagen sein. Es sollte bedacht werden, dass Tiermodelle können alle Funktionen des natürlich vorkommenden Krankheit nicht reflektieren. Das aktuelle Modell kann modifiziert werden, um die Virulenz Merkmale anderer als E. neuropathogenic Bakterien untersuchen coli A192PP und Variationen in der Größe der Kolonisierung Inokulum untergebracht werden können. Zukünftige Anwendungen der Technik könnten die Bewertung von dringend benötigten Medikamenten, um den Zustand zu behandeln und um Details der Wirtsantwort auf Kolonisation und Gewebeinvasion aufzudecken. Die hier beschriebene Methode ist einfach, aber effektiv. Einzel Würfe von 10-12 Welpen wurden als Test- oder Kontrollgruppen eingesetzt und dies innerhalb-Wurf Ansatz gewährleistet ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und statistische Gültigkeit. Es ist zwingend notwendig, dass die Welpen in ihre natürliche Mütter so schnell wie möglich nach jeder procedur zurücke und Würfe sollten daher nicht enthalten Tiere unterziehen verschiedene Interventionen. Es ist wichtig, dass die Fed Inokulum erwärmt sonst die Welpen werden die angebotenen Kultur abzulehnen. Die Welpen entwickeln sich schnell eine komplexe Mikrobiota und innerhalb von zwei Tagen nach der Geburt der GI-Trakt ist mit einer breiten Palette von Bakterien aus der als der am häufigsten vorkommenden Mikroben in der Säuglings- und Erwachsenen gut etablierten Stämme besiedelt. Pups, die nicht E. zugeführt haben coli A192PP nicht E. tragen coli K1 im GI-Trakt 17 und damit Bestimmung der Raten der Besiedlung ist relativ einfach. Jedoch basierte die neuS qPCR Verfahren zum Nachweis von E. kolonisierenden coli K1 ist viel empfindlicher, dass die traditionellen Kulturverfahren und wird dringend empfohlen 17.

Systemischen bakteriellen Infektionen sind eine große Bedrohung für das Wohlergehen und das Überleben des Neugeborenen; Frühgeborene sind besonders gefährdet. Neonatalen bakteriellen Meningitis (NBM), häufig mit bakterieller Sepsis, weiterhin eine signifikante Quelle von Mortalität und Morbidität in den ersten Lebenswochen und das Problem wird durch die ständige Weiterentwicklung der Beständigkeit gegen Frontantibakterielle Medikamente 1,2 verstärkt. Ein Fall von NBM ist ein medizinischer Notfall, der eine hohe medizinische, soziale und wirtschaftliche Belastung 3 trägt; Folglich besteht ein dringender Bedarf für neue Therapeutika und insbesondere neuartige prophylaktische Strategien, um die Last der Infektion. Einige Features von NBM sind ungewöhnlich: in der entwickelten Welt, sind Escherichia coli und Streptokokken der Gruppe B für die große Mehrzahl der Fälle und der Fähigkeit dieser Stämme zu NBM entlocken verantwortlich ist fast immer mit der Gegenwart eines Schutz Polysaccharid ca zugeordnetpsule dass der Erreger ermöglicht, Immunerkennung entziehen Prozesse 4. Ein sehr hoher Anteil (80 - 85%) der neuroinvasive E. coli exprimieren das K1-Kapsel 5,6, eine α-2,8-verknüpfte Poly-Sialinsäure-Polymer, das strukturell identisch mit Modulatoren der neuronalen Plastizität 7 Host ist. Die Bewertung neuer Therapeutika und Prophylaxe für NBM und zugehörige Bakteriämie und Sepsis würde klar von einer robusten Tiermodell der Infektion, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit im menschlichen Neugeborenen nachahmt, insbesondere die starke Altersabhängigkeit und dem natürlichen Weg der Infektion profitieren . Eine breite Palette von Modellen für Gram-positive und Gram-negative bakterielle Meningitis stehen 8,9 und diese haben unser Wissen über Pathogenese, Pathophysiologie und Behandlungsmöglichkeiten in dieser Infektionen erheblich erweitert. So experimentellen Infektionen bei Ratten, Mäuse, Kaninchen und Affen wurden verwendet, um Meningitis sowohl in der n studiereneonate und die Erwachsenen. Allerdings sind viele dieser Modelle verwenden direkte intracisternal oder subkutane Injektion von Bakterien für die Initiation der Infektion, eine künstliche Pathogenese durch Umgehen natürlichen Prozesse der Verbreitung von der Stelle der Kolonisation. In einigen Fällen sind diese Methoden der Inokulation führte zu signifikanten Veränderungen in der Pathologie; beispielsweise subkutaner Verabreichung von E. coli K1-Stämme hob die Altersabhängigkeit mit der natürlichen Infektion assoziiert, Herstellung Bakteriämie und Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) in beiden Neugeborenen und Erwachsenen 10. Prädisposition für E. coli NBM hängt entscheidend vertikale Übertragung des Erregers von der Mutter auf das Kind bei oder kurz nach der Geburt 11. Maternale E. coli K1 Bakterien besiedeln den Neugeborenen gastrointestinale (GI-Trakt) 11-13, die steril bei der Geburt ist, aber schnell erwirbt einen komplexen Mikrobiota 14. In kolonisierten Neugeborenen, E. coliK1 Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf vor Eintritt in das CNS durch die Blut-Hirn- oder Blut-Liquor-Schranken 9,15 translozieren. Das Design der robusten Modelle der experimentellen Infektion sollte diese Details zu berücksichtigen. Obwohl Mäuse wurden weit verbreitet für die Untersuchung von einigen Formen der bakteriellen Meningitis 8 verwendet werden, sind sie für die Untersuchung der neonatalen Infektionen geeignet, sie werden durch eine systemische Infektion überwältigt und nicht die starken Altersabhängigkeitscharakteristik des menschlichen Säuglingen 16 zeigen. Ferner α-Defensine, Schlüssel Peptide der GI-Trakt Schutz gegen systemische Invasion durch E. coli K1 17 sind stark in Paneth-Zellen und Neutrophile in Menschen und Ratten, aber nicht in Mäusen 18 ausgedrückt. Es ist ein bemerkenswertes Maß an Überschneidungen, Redundanz und Heterogenität in der Maus Defensin und verwandte cryptidin Gene nicht in anderen eine gefundenimals 19. Die neugeborenen Ratten wurde ursprünglich von Moxon 20 verwendet und Mitarbeiter, um die Pathogenese der Haemophilus influenzae Meningitis folgenden intranasale Impfung zu untersuchen, die Replikation der natürlichen Standort der Kolonisation dieser neonatalen Krankheitserreger im menschlichen, und anschließend für altersabhängige E. angepasst coli K1 Bakteriämie und Meningitis. Bortolussi et al. 21 Arbeitnehmer intraperitoneale Injektion des bakteriellen Inokulums auf eine Infektion auszulösen, aber der Schlüsselstudie von Glode und Mitarbeiter 22 verwendete orale Magen Fütterung, um die natürlichen Infektionsweg nach GI Kolonisierung parallel. Da die Magensonde kann Schleimhautoberflächen beschädigen, wurde das Verfahren verfeinert werden, um Zufuhr des Inokulums in den Neugeborenen 23 umfassen. Hier wird das Verfahren zum Gastrointestinaltrakt Kolonisierung und Verfahren zum Verfolgen der Infektion in anfälligen jungen Ratten beschrieben; zusätzlich werden therapeutische und präventive Anwendungen des Modells diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Wirtstier und bakterielle Erreger ist nur dann sinnvoll, wenn die Infektionsmodell verwendet repliziert die wesentlichen Merkmale des natürlichen Infektion. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Festlegung und Bewertung der systemischen Infektion aufgrund neuropathogenic Escherichia coli K1 in der neonatalen Ratten. Colonization des Gastrointestinaltraktes eine Verbreitung des Erregers entlang der gut-Lymph-Blut-Hirn-Verlauf der Infektion und das Modell zeigt starke Altersabhängigkeit. Ein Stamm von E. coli O18: K1 mit erhöhter Virulenz für den neugeborenen Ratten produziert außergewöhnlich hohen Raten der Kolonisation, Translokation in den Blutabteil und Invasion der Hirnhäute folgenden, durch das Adergeflecht. Wie in dem menschlichen Wirt, wird das Eindringen des zentralen Nervensystems durch lokale Entzündung und einer fest Letalausgang begleitet. Das Modell ist aus bewährten Werkzeug für Studien des Mechanismusder Pathogenese, für die Bewertung der therapeutischen Interventionen und für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz.

Die E. coli K1 hier beschriebenen systemischen Infektion Modell gibt viele der Funktionen des natürlichen Infektion beim Menschen. Die Bakterien werden eingenommen, besiedeln den GI-Trakt, translozieren in den Blutraum über die mesenterialen Lymphknoten vor der Gründung organspezifische Erkrankung zugeordnet Entzündung des Gehirns 24. Wichtig ist, zeigt das Modell starke Altersabhängigkeit; wie in Figur 3 gezeigt, sind zwei Tage alten (P2) Rattenjungen sehr anfällig für invasive Krankheit, sondern über einen Zeitraum von sieben Tagen werden die Tiere zunehmend resistent gegen eine Infektion, aber nicht Wege Kolonisierung 17 GI. Nach dem Transport von dem Ort der GI Kolonisierung an den Blutabteil, die Bakterien in Blutproben durch Fluoreszenzmikroskopie (4) vor Eintritt in das ZNS vorwiegend im Plexus choroideus 25 visualisiert werden. Bei einigen Tieren gibt es umfangreiche Invasion anderer wichtiger Organe wieLunge, Milz und Niere 25. Bakterienzahlen im Gewebe im wesentlichen zwischen den einzelnen Welpen 25, jedoch variieren, wenn die Keimbelastung ist entweder vorhanden oder nicht vorhanden ist, gibt es eine hohe Reproduzierbarkeit bei der Organ Invasion erzielt. Mit einem Wurf von 12 Welpen als Einzeltest Kohorte, Stromrechnungen mit G * Power Software ermittelt, dass dieses Stichprobengröße entspricht einer 98,6% Wahrscheinlichkeit, ein Effekt auf das Überleben mit sechs Tieren aus der Kohorte und&gt; 99% Wahrscheinlichkeit, wenn alle zwölf berücksichtigt. Das Modell ist deshalb geeignet zur Beurteilung von neuen Substanzen, die speziell für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Neugeborenen zugeschnitten und wurde in dem Verfahren verwendet worden, um das therapeutische Potential der Kapsel Depolymerase EndoE die selektiv entfernt die K1-Kapsel von der Bakterienoberfläche 24-26 zu bewerten. Es kann auch verwendet werden, um Host-Bakterien-Interaktionen zu untersuchen, dass die Auswirkungen auf die pat werdenhogenesis von E. coli neuropathogens; In diesem Zusammenhang ist es für die Untersuchung verwendet wurden E. coli A192PP Kolonisierung und Verbreitung. Es hat sich gezeigt, dass E. coli A192PP Zellen bestehen im GI-Trakt von P2, P5 und P9 Welpen in großer Zahl; zeitliche Aspekte der Besiedlung in diesen drei Gruppen sehr ähnlich waren (Figur 5) und spiegelt die Fähigkeit der Bakterien zu replizieren und zu halten Bevölkerungsdichte im Darm. Die Virulenz des klinischen Isolat A192 wurde durch serielle Passage in neugeborenen Ratten, um wenig oder keine Redundanz der Tiernutzung sicherzustellen verbessert. E. coli besiedelt A192 P2 neonatalen Ratten mit 100% Effizienz, ausgelöst Bakteriämie bei 35% der Tiere und produzierte eine letale Wirkung in 25% 27. Die agiert derivative A192PP kolonisiert den GI-Trakt produziert Bakteriämie und verursacht Letalität in allen P2 Welpen. Somit kann das Modell verwendet, um die Virulenz zu untersuchen different K1-Stämme in Bezug auf ihre Fähigkeit, das ZNS und andere Organsysteme von der Website der Kolonisation einzudringen. In diesem Zusammenhang Pluschke und Mitarbeiter 23 verwendet einen neugeborenen Ratten Infektionsmodell, um die Kapazität 95 zu bestimmen E. coli K1-Stämme menschlichen Ursprungs zu Bakteriämie nach Darmbesiedlung zu verursachen; sie beobachtet große Unterschiede in der Effizienz der beiden Kolonisierung und invasive Fähigkeit, auf denen die klonalen Natur E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Materialien für die Gewebesammlung: (A) Waage, (B) vorgewogen Röhrchen notwendigen Medien, (C) OP-Tisch, Lineal und Nadeln zu fassen das Tier, (D) 70% (v / v) Ethanol und PBS zu sterilisieren die Gewebesammelgeräte, <sTrong&gt; (E) Gewebesammel Kit mit einem großen Schere für Enthauptung und Schere und Pinzette und Klingen verschiedener Größe und Formen, (F) Eis, um das Gewebe zu erhalten, (G) 70% (v / v) Ethanol zum Sterilisieren dem Operationstisch und umgibt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figur 2. Trennung des GI-Trakts und der mesenterischen Lymphsystems. (A) Grip die zentrale Masse des mesenterialen Lymphsystem mit feinen Sezierung Pinzette. (B) Grip der proximale Teil des Dünndarms, und ziehen in entgegengesetzte Richtungen. (C) Das GI-Trakt und mesenterialen Lymphsystem vollständig separate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Überleben der Neugeborenen Rattenjungen zwei Tage (P2) bis neun Tage (P9) im Alter nach oraler Verabreichung von E. coli A192PP, veranschaulicht die starke Altersabhängigkeit der systemischen Infektion. Jede Gruppe stellt 24 Neugeborenen. <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4. Fluoreszenzaufnahmen von E. coli A192PP Zellen in einem Blutausstrich von einer P2-pup Infizierten nach oraler Verabreichung von Bakterien. Das Lipopolysaccharid O-Antigen an der Bakterienoberfläche war stmit Kaninchen-Anti-O18 polyklonalen Antikörper und Alexa546-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Zweitantikörper ained. Die K1-Kapsel wurde mit EndoE-GFP Reagenz visualisiert. Praktisch alle in Blutproben nachgewiesen Bakterien angezeigt die Schutz K1-Kapsel. Die Bilder wurden von Dr. Andrea Zelmer gefangen genommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. E. coli A192PP Darmbesiedlung nach der Verabreichung des bakteriellen Inokulums. DNA wurde aus Gesamtdarm und E. extrahierten coli K1-Kolonie-bildenden Einheiten / g (KBE / g) durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestimmt gezielt den Polysialyl (neuS Gen) Gewebe wie an anderer Stelle beschrieben 17 </sup&gt;. LOD: Nachweisgrenze. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Feature </td><td> Gesund </td><td> Ungesund </td></tr><tr><td> Farbe der Haut </td><td> Rosa </td><td> Pale / Gelb </td></tr><tr><td> Agility (Aufrichtungsreflexes) </td><td> Pup kehrt sofort auf rückwärts Platzierung </td><td> Schwierigkeit bei der Umkehr rückwärts Platzierung (&gt; 3 s) oder nicht erreichen können </td></tr><tr><td> Sanfter Druck auf den Unterleib </td><td> Kein Ton </td><td> Sound of Agitation </td></tr><tr><td> Magen / Milchleitung </td><td> Sichtbare und weiß </td><td> Nicht sichtbar </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> Warm </td><td> Relativ kalt * </td></tr><tr><td> Gewicht </td><td> Gewinn von 1,5-2 g pro Tag </td><td> Keine Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust </td></tr><tr><td> Verhalten, wenn im Käfig </td><td> Schritte in Richtung Mutter und beginnt feeding </td><td> Kann nicht zur Mutter zu bewegen und zeigt Schwierigkeiten Fütterung </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sieben-Punkte-Bewertungssystem: Die ersten drei aufgeführten Partituren sind in der Regel die beobachteten Anzeichen. * Neugeborenen mit systemischen Infektion Erfahrung erhöhte Körpertemperatur (&gt; 2 ° C). Aufgrund des Mangels an Agilität der Tiere, um ihre Mutter zu erreichen, um die Körpertemperatur zu halten, kann ungesunden Tieren abgetrennten aus dem Wurf geworden und fühlen sich kalt an der bloßen Hand.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion in der neonatalen Ratten

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K Aufrufe.  University College London.  Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus. 

Serie: Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Nicht-invasive optische Abbildung des lymphatischen Gefäßsystem eines Maus

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Eine einfache Protokoll ortspezifisch generieren acetyliert Proteine in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...