Das Cecal-Slurry-Modell für polymikrobielle Sepsis ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um einzigartige neonatale Pathophysiologie zu sezieren. Es kann variabel sein, und humane Endpunkte sind nicht gut beschrieben. Hier stellen wir Ihnen unser hochstandardisiertes Verfahren zur Herstellung einer Cecal-Schlämme vor und injizieren Versuchstiere.
Darüber hinaus verwenden wir einen datengesteuerten Ansatz, um moribunde Welpen zu einem frühestmöglichen Zeitpunkt zu identifizieren. Beginnen wir mit der Zubereitung eines gefrorenen Cecal-Slurry-Lagerbestands. Dies geschieht durch Das Pooling von Cecal Concent von mindestens fünf erwachsenen Mäusen, Das Aussetzen in sterilem Dextrosewasser und die Lagerung bei minus 80 für die spätere Verwendung.
Sie können Männchen oder Weibchen verwenden, aber das Geschlecht, alter und Hintergrund von Mäusen für Ihre Experimente sollten konstant gehalten werden. Lassen Sie uns zunächst unsere Werkzeuge für die Zerlegung vorbereiten. Dazu gehören eine Schere und Zange für die Haut und ein zweites Set für die inneren Organe.
Schalten Sie den Heißperlensterilisator mindestens 30 Minuten vor Gebrauch ein. Tauchen Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol und tauchen Sie sie dann in den heißen Perlensterilisator für mindestens eine Minute. Sprühen Sie eine Matte mit Papiertüchern mit 70% Ethanol, dann entfernen Sie die Werkzeuge aus dem Sterilisator, ohne den sterilisierten Teil des Werkzeugs auf die nicht-sterilen Griffe anderer Werkzeuge zu berühren.
Legen Sie sie auf das Papiertuch, um abzukühlen. Sezieren Sie die Mäuse in einem biologischen Sicherheitsschrank. Pin die Beine der Maus auf einem Styropor-Board mit 23 Gauge Nadeln, so dass die Maus ist Bauch nach oben.
Den Bauch mit 70% Ethanol besprühen. Mit sterilen Zangen und Scheren, durch die Haut schneiden, lösen Sie die Haut aus dem Peritonealfutter mit der Schere, und schneiden Sie einen rechteckigen Bereich von der Leistengegend bis zum Brustbein und von links nach rechts. Entfernen Sie alle Felle um das Peritoneum.
Wechseln Sie zu einem neuen Paar steriler Werkzeuge, um das Peritoneum zu durchschneiden, wodurch auch eine rechteckige Öffnung entsteht. Identifizieren Sie das Cecum, das von der linken zur rechten Seite über den Körper verlaufen sollte. Unterbrechen Sie Bindegewebe, um die Cecum-Zweige aus dem Darm zu identifizieren und schneiden Sie das Cecum aus dem Darm.
Legen Sie es auf ein sterilisiertes Blatt Wägepapier. Mit sterilen Werkzeugen, durchschneiden sie beide Enden des Cecums. Halten Sie die Mitte des Cecums mit Zangen und verwenden Sie einen flachen Metallspachtel, um den Cecal-Inhalt mit einer rollenden Bewegung sanft aus den Enden zu schieben.
Sammeln Sie den Inhalt und legen Sie sie in einem vorgewogenen 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Pool Cecal Inhalt von maximal fünf Mäusen in die gleiche Röhre. Gewichten Sie die Röhre erneut, sobald alle Inhalte hinzugefügt wurden.
Um das Volumen des Dextrose-Wassers zu berechnen, um den Cecal-Gehalt in jedem Rohr hinzuzufügen, dividieren Sie das Gewicht des Cecal-Gehalts in der Röhre durch Ihre gewünschte Konzentration in Milligramm pro Milliliter. Halten Sie ein Aliquot von Dextrose-Wasser auf Eis für die Wiederaufhängung von Cecal-Gehalt. Fügen Sie die benötigte Menge Dextrosewasser in das 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit Cecal-Inhalt.
Wirbeln Sie das Rohr vertikal und horizontal für etwa 30 Sekunden. Beobachten Sie das Vorhandensein von Partikeln über ein paar Millimeter Im Durchmesser, und wenn vorhanden, weiter Wirbeln, bis alle Partikel sichtbar verschwunden ist. Legen Sie ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr auf Eis, um das Filtrat zu sammeln und ein steriles 70-Mikrometer-Zellsieb darüber zu installieren.
Vier Milliliter resuspendierte Gülle aus einem 15-Milliliter-Rohr über das Zellsieb und in das Sammelrohr pfeifen. Den Partikel wieder aufhängen, indem sie zwei- bis dreimal nach oben und unten pfeifen. Extrudieren Sie Blasen, um die Filtergeschwindigkeit zu erhöhen, während Sie den Inhalt mit der Pipettenspitze rühren, bis keine Flüssigkeit mehr gefiltert wird.
Dies sollte etwa 30 Sekunden dauern. Ändern Sie Die Zellensiebe zwischen jedem Rohr der Cecal-Schlämme, aber bündeln Sie alle Inhalte in der gleichen 50 Milliliter Sammelröhre. Wenn Ihr Lager 40 Milliliter überschreitet, dann wirbeln Sie ihn für 15 Sekunden, und legen Sie 20 Milliliter in ein neues Zentrifugenrohr.
Teilen Sie die Gülle in kryogene Fläschchen mit jeweils 500 Mikroliter-Aliquots auf. Wirbel die Gülle zwischen allen drei Durchstechflaschen. Halten Sie den Master-Bestand in Fläschchen auf Eis.
Durch die Lagerung von Aliquots bei minus 80 ändert sich die aeroben Koloniebildung in einer Cecal-Güllezubereitung über einen Zeitraum von sechs Monaten nicht. Nun, da die Cecal-Schlämme vorbereitet ist, können wir sie verwenden, um einen Wurf von sieben bis acht Tage alten Mäusen mit einer gewichtsbereinigten Dosis Cecal-Schlämme herauszufordern. Die Letalität der Gülle ist dosisabhängig.
Sie müssen die gewünschte tödliche Dosis in Ihrer Anlage für jeden neuen Bestand mit einer neuen Dosistitration bestimmen. Pro Wurf wird eine Cecal-Gülleinjektion aliquot hergestellt. Wir normalisieren das Inokulum auf ein Volumen von 100 Mikrolitern und runden uns auf die nächsten 10 Mikroliter für jedes Tier im Wurf ab.
Die Vorbereitung der Herausforderung aliquot erfordert drei Berechnungen, das Volumen des Güllebestands erforderlich, zusätzliche Menge an Dextrose Wasser, und das abgerundete Volumen für jeden Welpen in der Wurf. Einzelheiten zur Durchführung der einzelnen Berechnungen finden Sie in Abschnitt 3 des Protokolls. Die Durchführung dieser Berechnungen von Hand für jedes Experiment kann zeitaufwändig sein und zu experimentellen Fehlern beitragen, so dass eine Tabelle zusammen mit dem Protokoll heruntergeladen werden kann, in dem Sie Ihre Lagerkonzentration, die gewünschte Dosis und das Gewicht Ihres Wurfs eingeben, und die Menge an Gülle, das Volumen des Dextrosewassers und das tatsächliche Volumen pro Welpen automatisch zurückgegeben wird.
Sie können dieses Blatt drucken und mitnehmen, wenn Sie bereit sind, Ihre Tiere herauszufordern. Bereiten Sie die Injektion aliquot in einem biologischen Sicherheitsschrank vor und halten Sie sie auf Eis. Mischen Sie vor dem Beladen der Spritze das Mikrozentrifugenrohr, indem Sie 20 Mal flicken.
Welpen werden mit einer 28 Gauge Insulinspritze herausgefordert. Vor der Gülleherstellung das Aliquot mischen, indem man 300 bis 500 Mikroliter der Herausforderung aliquot in und aus dem Mikrozentrifugenrohr inspiriert und ausgestoßen. Dann erstellen Sie etwa 150 Mikroliter der Herausforderung aliquot.
Dies sollte größer sein als das Injektionsvolumen für jeden sieben bis acht Tage alten Welpen. Flick an der Spritze, um Blasen aus dem Kolben zu lösen und ziehen Sie leicht auf der Spritze zurück, um Luftblasen zu vertreiben. Berühren Sie dabei nicht die Nadel oder die Kolbenwelle.
Geben Sie die überschüssige Cecal-Schlämme wieder in das Mikrozentrifugenrohr, bis die berechnete Menge an Cecal-Schlämme für die Maus in die Spritze geladen wird. Cecal Gülle wird mit einer intraperitonealen Injektion verabreicht. Führen Sie dies gemäß dem Protokoll in Ihrer Tierpflegeeinrichtung durch.
Um Leckagen zu minimieren, neigen Sie den Welpen nach unten und setzen Sie die Nadel zwischen das Bein und die Genitalien ein, wobei die Nadel flach und subkutan bleibt. Nach dem Einsetzen der Nadel etwa einen Zentimeter, drücken Sie nach unten und nach vorne, bis Sie spüren, dass die Nadel das Peritoneum punktiert, dann langsam den Kolben drücken. Ziehen Sie vorsichtig die Nadel nach dem gleichen Weg zurück, in dem Sie gegangen sind, und entspannen Sie Ihren Mittelfinger dabei.
Beachten Sie alle Lecks in Ihrem Labor-Notebook und erwägen Sie, Tiere mit erheblichen Lecks aus Ihrem Endergebnis zu unterlassen. In diesem Abschnitt werden wir die verschiedenen Gesundheitsniveaus skizzieren, die wir bei Mäusen beobachten, die mit polymikrobieller Sepsis und ihrem entsprechenden humanen Endpunkt herausgefordert werden. Für alle Eingriffe mit Neonatalmäusen übertragen wir das Einstreumaterial in einen neuen Käfig.
Dies überträgt den Geruch der Dame auf Ihre Handschuhe und reduziert die Belastung der Dame durch wiederholtes Betreten ihres Käfigs. Wir machen ein zweites Nest im neuen Käfig, um die überwachten Welpen bis zum Ende des Verfahrens oder Überwachung zu halten, wenn der gesamte Wurf bereit ist, in den Käfig der Dame zurückgebracht zu werden. Legen Sie eine Maus auf den Rücken und überwachen Sie die Möglichkeit, innerhalb von vier Sekunden nach rechts zu fahren.
Wenn es richtig ist, warten Sie acht weitere Sekunden, um den Grad der Mobilität zu bestimmen. Eine unangefochtene oder sich erholende Maus ist am häufigsten in der Lage, ihre Umgebung zu verbessern und zu erkunden, indem sie mehrere Schritte hintereinander unternimmt. Gruppieren Sie Mäuse neu, die in der Lage sind, sich selbst zu rechtzumachen und ein paar Schritte zu unternehmen, um ihre Umgebung als rechtelethargische zu erkunden.
Diese Mäuse können umfallen, während sie einen Schritt machen und auf ihren Füßen wackelig aussehen. Eine Maus, die nicht in der Lage ist zu recht und hat Hüftbewegung, die 90 Grad von horizontal enden wir gruppieren als nicht rechts-mobil. Diese Maus wird schließlich richtig, kann aber nicht innerhalb von vier Sekunden.
Aufgrund seiner Hüftbewegungen wird er als nicht rechtsmobil gruppiert. Welpen, die nicht richtig sein konnten und Hüftbewegungen unter 90 Grad von der Horizontalen haben, werden als nicht rechtslethargisch gruppiert. Dies ist ein weiteres Beispiel für eine Maus, deren Hüften 90 Grad von der Horizontalen nicht überschreiten und als nicht rechts-lethargisch gruppiert sind.
Ein nicht-nicht-mobiler Pup hat Beine, die schütteln oder vibrieren können, aber keine Hüftbewegung haben. Gliedmaßen können sich ausdehnen und zurückziehen, haben aber keine seitliche Bewegung. Der Pup ist sichtbar krank und hat den humanen Endpunkt erreicht.
Dies ist ein weiteres Beispiel für ein Fail-to-Right-non-mobile-Pup. Seine Hüften schütteln nicht von links nach rechts, aber seine Pfoten vibrieren. Beim Umgang mit dem Käfig der Dame können Welpen aus dem Nest gezogen werden, wenn die Pflegedame läuft.
Wir ersetzen diese und suchen dann nach anderen verstreuten Welpen, die von ihren Nestgefährten entfernt sind. Wenn diese verstreuten Welpen nicht rechts-lethargisch sind, befinden sie sich an einem humanen Endpunkt. Hier ist eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve unseres Sepsis-Modells.
Die Überwachungszeitpunkte finden Sie im beigefügten SOP. An jedem Punkt entlang der Überlebenskurve, wenn festgestellt wird, dass eine Maus nicht rechts-nicht-mobil ist, ist sie an ihrem humanen Endpunkt und eingeschläfert. Zwischen 12 und 21 Stunden nach der Herausforderung werden Mäuse krank erscheinen und etwa die Hälfte der Mäuse wird auf der einen Seite nach rechts sein können, während die andere Hälfte auf einer ihrer Seiten nicht richtig ist.
Dies ist der Zeitrahmen, in dem die Mäuse beginnen, im Gesundheitsscore abzuschweifen und den humanen Endpunkt des Fail-to-Right-Nonmobilzuschlagens zu erreichen. Dies sind repräsentative Ergebnisse von Gesundheitsergebnissen, die in diesem Zeitraum beobachtet wurden. Die Überlebenden- und Nicht-Überlebendengruppen können zu diesem Zeitpunkt nicht anhand ihrer Gesundheitsergebnisse unterschieden werden.
In diesem Krankheitsstadium, 21 bis 48 Stunden nach der Herausforderung, beobachten wir den höchsten Anteil an humanen Endpunkten. Wir haben auch festgestellt, dass die überwiegende Mehrheit aller Mäuse, die nicht in der Lage sind, sich auf beiden Seiten zu recht zu erholen, sich nicht von krankheiten erholen wird, was daher zu einem neuen Kriterium für einen humanen Endpunkt wird, zusätzlich zu den nicht-rechts-nichtbeweglichen Kriterien. Die beobachteten Gesundheitswerte in diesem Krankheitsstadium führten zu einer Trennung von Überlebenden und Nicht-Überlebenden.
Die überwiegende Mehrheit der Mäuse, die nicht in der Lage waren, auf beiden Seiten richtig zu recht zu bekommen, erholte sich nicht von der Krankheit. Diese Daten unterstützen, dass ein neues Kriterium für einen humanen Endpunkt ab 21 Stunden nach der Herausforderung darin bestehen sollte, Mäuse einzuschläfern, die auf beiden Seiten nicht richtig sind. Über 48 Stunden nach der Herausforderung werden viele Mäuse beginnen, mehr Aktivität und einen besseren Rechtsetzungsreflex zu zeigen.
Auch wenn der Anteil der humanen Endpunkte in diesem Zeitraum geringer ist, können die Mäuse immer noch abschweifen und kränker werden, und sie müssen immer noch auf humane Endpunkte überwacht werden. Während dieses Zeitraums hatten einige der Mäuse, die schließlich als Nicht-Überlebende gruppiert wurden, an einem Punkt eine erhöhte Aktivität gezeigt, aber später schlechter emittiert und einen humanen Endpunkt erreicht. Dies erfordert eine kontinuierliche Überwachung kranker Tiere mit zunehmender Häufigkeit, wenn sie beginnen, schlechtere gesundheitliche Ergebnisse zu zeigen.
Unabhängige Experimentatoren, die keine persönlich geschulte Ausbildung erhalten haben und die nur dieses Lehrvideo beobachten, wurden in ihrer Fähigkeit getestet, die gleiche Punktzahl wie die Ermittler mit aufgezeichneten Testvideos zuzuweisen. Dieses Lehrvideo führt zu einer genauen Verhaltensklassifizierung. Die Fähigkeit, rechtsunbeweglichen neonatalen Mäusen, die ein Maß für einen humanen Endpunkt sind, die richtige Punktzahl zuzuweisen, wurde von 60 neonatalen Mäusen bestimmt, und durchschnittlich 97% der Verhaltensweisen wurden genau unterschieden, wobei nur 3% falsch identifiziert wurden.
Als nächstes wurde die Fähigkeit getestet, neonatale Mäuse zu unterscheiden, die nicht richtig waren oder innerhalb von vier Sekunden richtig waren. Dies ist ein weiteres Maß für einen humanen Endpunkt und wurde bei 97% der neonatalen Mäuse genau zugewiesen, während 3% der Welpen fälschlicherweise als Rechte zugeordnet wurden. Hier sind repräsentative Ergebnisse für die prozentuale Gewichtsänderung von Mäusen im Vergleich zu ihrer Zeit der Herausforderung.
Die durchschnittliche Gewichtsänderung zwischen Überlebenden und Nicht-Überlebenden begann sich nach der Challenge 24 Stunden lang zu trennen, aber es gibt eine Menge Überschneidungen zwischen den Gruppen. Es gab einige Überlebende, die mehr als 20% Gewicht verloren, aber immer noch von der Krankheit erholt. Die Gewichtsänderung war nicht so effizient bei der Vorhersage des Ergebnisses im Vergleich zu den Unterschieden in den Gesundheitsbewertungen, weshalb sie nicht als Kriterium für die Bestimmung verwendet wird, ob Mäuse an einem humanen Endpunkt sind.
Abschließend möchte ich sagen, dass Sie nun in der Lage sein sollten, einen Vorrat an gefrorener Kalkschlämme zuzubereiten, die gewichtsbereinigte Dosis zu berechnen. Und injizieren und überwachen Neugeborene Mäuse für humane Endpunkte. Wir hoffen, dass dies eine wertvolle Ressource für Ihre Mausforschung sein wird.
