Unser Protokoll ermöglicht die bakterielle Verbreitung und Lastverfolgung in einem experimentellen neonatalen Sepsismodell in Echtzeit und die Fähigkeit, andere Krankheitsmarker mit der Krankheitserregung zu korrelieren. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Sepsis bei einzelnen neonatalen Mäusen längs zu analysieren und die Möglichkeit zu bieten, Infektionsdynamik und bakterielle Verbreitung in Echtzeit zu beobachten und zu vergleichen. Mit dieser Methode können präklinische Tests von Eingriffen auf neonatale Sepsis durchgeführt werden, die die Überwachung der Auswirkungen der Wirtskontrolle der Bakterien ermöglichen.
Beginnen Sie damit, altersgerechte Welpen in entweder hoch- oder niedrig dosierte Wurfgruppen innerhalb eines Schranks der Biosicherheitsstufe zwei zu platzieren. Zeichnen Sie am postnatalen Tag drei oder vier die Gewichte aller Welpen vor der Impfung auf. Insulinspritzen mit PBS oder dem hoch- oder niedrig dosierten E.coli lux Inoculum in den Biosicherheitsschrank laden und die geladenen Spritzen auf Eis legen.
Legen Sie das Neugeborene auf eine saubere Oberfläche innerhalb des Biosicherheitsschranks und heben Sie die Haut am Nacken, als ob sie den Welpen zerschwirre. Legen Sie die Nadel ab schräg unter der Haut in den Raum zwischen der Haut und dem Muskel erstellt. Wenn die Nadel unter der Haut gefühlt werden kann, injizieren Sie 50 Mikroliter des Inokants und geben Sie gleichzeitig den eingeklemmten Teil der Haut frei, um einen Rückfluss zu verhindern, und entfernen Sie die Nadel dann langsam und mit Sorgfalt.
Wenn alle Welpen auf die gleiche Weise injiziert wurden, kehren Sie die Welpen zu ihren Dämmen zurück. Unmittelbar nach der Injektion und zu den entsprechenden Versuchszeitpunkten danach den Käfig mit E.coli lux infizierten Neonatalen Mäusen und Damm in eine Biosicherheitsstufe zwei laminare Strömungshaube legen und die Software im Mikro-CT-Computer öffnen. Nachdem Sie das System initialisiert und darauf gewartet haben, dass die Bühnentemperatur bei 37 Grad Celsius und die CCD-Temperatur bei minus 90 Grad Celsius verriegelt wird, legen Sie bis zu vier anästhesierte Welpen in der Bildgebungsbox in der anfälligen Position auf die Bildbox.
Schließen Sie die Bildkammertür und wählen Sie die Lumineszenz-Bildgebungsoption. Wählen Sie den öffnenden Filter und als nächstes aus, und stellen Sie den zu blockierenden Anregungsfilter und den zu öffnenden Emissionsfilter ein. Wählen Sie 500, 520, 560, 580, 600 und 620 Nanometer.
Dann stellen Sie die Welpen vor der Rückkehr in den Käfig mit dem Damm mit Überwachung bis zur Anästhesie Erholung. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt, in einem Biosicherheitsschrank, das eingeschläferte Neugeborene mit 70% Ethanol dosieren, um eine Kontamination zu verhindern und das Tier auf die rechte Seite zu stellen. Verwenden Sie Zangen, um die Haut zwischen dem Bauch und dem hinteren linken Bein zu erfassen und verwenden Sie eine chirurgische Schere mit feiner Spitze, um einen Hautschnitt zu machen.
Dann weiter Einschnitt in Richtung des Rückens des Tieres, bis die gesamte Milz ausgesetzt ist. Verwenden Sie die Zange und die Schere, um die Milz aus dem Bauch zu entfernen und legen Sie sie in die Lösung, die für ihre nachgeschaltete Anwendung geeignet ist. Um die Lunge zu erhalten, schälen Sie die Haut der Brust vollständig und treten sie an der Basis des Brustbeins mit der Schere vertikal gehalten, nach oben schneiden, bis der Rippenkäfig gespalten ist.
Verwenden Sie Zangen, um die rechte und linke Lunge einzeln zu erfassen und die Lunge aus der Brusthöhle zu entfernen. Entfernen Sie das Herz mit einer Schere aus dem Lungengewebe. Dann legen Sie die Lunge in die Lösung, die für ihre nachgelagerte Anwendung geeignet ist.
Um einen in vitro bakteriellen Tötungstest durchzuführen, legen Sie die nicht infizierte Milz in ein 40 Mikrometer Nylonsieb innerhalb einer sterilen 60-Millimeter-Petrischale mit fünf Milliliterpbs, ergänzt mit 10%fetalem Rinderserum, und verwenden Sie einen sterilen Drei-Milliliter-Spritzenkolben, um das Gewebe zu einer einzelzelligen Suspension zu zerlegen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr und sammeln Sie sie durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter roter Blutzelllysepuffer pro drei bis vier Milz aus.
Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Milz in PBS waschen und das Pellet in 250 Mikroliter PBS, ergänzt mit Rinderserumalbumin und zwei Millimolaren EDTA, zum Zählen wieder aufhängen. Als nächstes isolieren Sie die Ly6 B2-positiven Zellen mit den entsprechenden immunmagnetischen Perlen nach Herstellerprotokoll und säen die angereicherten Ly6 B2-positiven Zellen mit einem mal 10 zu den fünf Zellen pro 100 Mikroliter komplettem Medium pro Brunnendichte in einer schwarzen oder weißen 96-Well-Platte. Bereiten Sie das bakterielle Inokulum bei der gewünschten Vielzahl der Infektion in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Brunnen vor und fügen Sie 100 Mikroliter bakterielles Inokulum oder Medium allein zu jedem Brunnen für eine einstündige Inkubation im Zellkultur-Inkubator hinzu.
Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch 200 Mikroliter frisches komplettes Medium, ergänzt durch 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin, um die verbleibenden extrazellulären Bakterien zu entfernen und die Zellen für weitere zwei Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurückzugeben. Am Ende der Inkubation und zu jedem versuchsweise Zeitpunkt danach verwenden Sie einen Plattenleser, um die Lumineszenz in jedem Brunnen der Deckelkulturplatte zu messen, bevor Sie die Platte bis zur nächsten Lesung an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Während die meisten Tiere zeigen hohe Konzentrationen von Bakterien im Blut bei 24 Stunden nach der Infektion, einige Welpen haben niedrige oder nicht nachweisbare Bakterien im Blut, was darauf hindeutet, dass die Infektion zu diesem Zeitpunkt frei.
Darüber hinaus drückten neonatale Ly6 B2-positive Milzzellen, die eine Stunde vor der Entfernung extrazellulärer Bakterien und der anschließenden Gentamycin-Behandlung mit biolumineszierenden E.coli infiziert waren, eine hohe Lumineszenz nach drei Stunden aus, die im Laufe der Zeit abnimmt und auf eine bakterielle Clearance hindeutet. Die Live-Tierbildgebung der leuchtmbischen Bakterien bestätigt die Zunahme der Verbreitung und des Wachstums von Bakterien bei neugeborenen Welpen im Laufe der Zeit nach 10 und 24 Stunden nach der Infektion. Intravitale Bildgebung in Verbindung mit Mikro-CT erleichtert die Identifizierung von Infektionsherden im Gehirn, in der Lunge und anderen peripheren Geweben.
Die Lunge einiger hochinfizierter Mäuse zeigt undurchsichtige Regionen, die mit der entzündlichen Konsolidierung übereinstimmen, die zu leuchtenden bakteriellen Signalen kolokalisiert ist. Diese Regionen mit vermutetem entzündlichem Exuldate werden in nicht infizierten Kontrolllungen nicht beobachtet. Eine signifikante Zunahme der entzündlichen Zytokinexpression im Vergleich zu Kontrollen wird auch bei niedrigen und hohen Inokulumgruppen beobachtet, die mit einer bemerkenswerten Verdickung der Alveolarwand, vermehrten Alveolarblutungen und entzündlicher Infiltration bei diesen Tieren korrelieren.
Die wichtigsten Dinge zu erinnern sind, die richtige Technik bei der Durchführung der Injektionen auszuführen und bei der Verabreichung der Anästhesie strikt auf die Neonate zu achten. Mit dieser Technik können wir neonatale Sepsis in Echtzeit visualisieren, um Interventionen zu studieren und gezielte Therapien zu hosten, die auf die Verbesserung der Immunantwort abzielen.
