Wir präsentieren ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus Hirngewebe, das von lebenden menschlichen Spendern gesammelt wurde, die einer resekttiven Gehirnoperation unterzogen wurden. Diese Kultur ist für biochemische und zellbiologische Assays oder Immunhistochemie geeignet. Es wird erwartet, dass zur Aufklärung des Mechanismus, der Neurodegeneration bei assoziierten Gehirnerkrankungen.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine einfachere und kostengünstigere Alternative zum klassischen Slice-Kultur-Protokoll mit Membraneinsätzen ist. Obwohl das Gesamtprotokoll nicht komplex ist, lassen sich einige Schritte wie die Entfernung von Meningen, das Verkleben des Gewebes an der Vibram-Probenscheibe und die Resektion für die Immunhistochemie am besten verstehen, wenn sie visuell demonstriert werden. Mit helfen, das Verfahren zu demonstrieren, werden Niele Mendes und Glaucia Almedia, die Grad-Studenten sind, und Giovanna Nogueira, eine weitere Studentin.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie Salz zu einem Eimer Eis hinzu. Übertragen Sie die Schneidlösung auf diesen Eimer und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten vor dem Gebrauch unter Carbogen-Mischung sprudeln. Als nächstes bereiten Sie einen Block von 3%Agarose, die etwa zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter ist.
Super kleben Sie den Agarose-Block an die Vibram-Probenscheibe, um eine zusätzliche mechanische Unterstützung der Gewebeprobe beim Schneiden zu schaffen. Legen Sie beim Vibratom die Schnittdicke auf 200 Mikrometer, die Schwingungsfrequenz auf 100 Hertz fest, und wählen Sie eine Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,5 und 1,0 Millimeter pro Sekunde. Verriegeln Sie dann die Vibram-Pufferschale an der Vibrammebasis und fügen Sie Eis hinzu, um sie vor Erhalt der Schneidlösung und der Probe und während des gesamten Schneidvorgangs gekühlt zu halten.
Richten Sie zunächst ein Transportgerät ein, das aus einer tragbaren Gasflasche besteht, die ein Anmischgemisch mit Carbogen enthält, das mit einem Druckflussventil verbunden ist, das die Gasleistung steuert, die mit Silikonschläuchen verbunden ist, die diese Gasleistung mit dem Transportbehälter und dem Transportbehälter verbinden, der die Transportlösung und das Eis für die Probenkühlung während des Transports enthält. Sammeln und transportieren Sie das Exemplar und transportieren Sie, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Probe in eine Petrischale mit Schneidlösung geben.
Mit feinen chirurgischen Werkzeugen, sorgfältig entfernen Sie so viel der verbleibenden Meningen wie möglich. Wählen Sie die beste Probenausrichtung für die Herstellung von Scheiben mit den besonderen Eigenschaften des experimentellen Designs und verwenden Sie eine Skalpellklinge mit der Nummer 24, um eine flache Oberfläche als Basis zu trimmen, die auf die Probenscheibe geklebt wird. Mit einem Entsorgungslöffel und filigranen Pinsel, sammeln Sie das Fragment aus der Petrischale und trocknen überschüssige Lösung mit Filterpapier.
Als nächstes verwenden Sie Superkleber, um das Gewebe an der Vibram-Probenschale zu befestigen, bis es fest an der Schale und in Kontakt mit dem Agarose-Block befestigt ist. Legen Sie die Vibram-Probenscheibe in die Vibratom-Pufferschale. Verriegeln Sie den Messerhalter mit fest fest an der Rasierklinge.
Fügen Sie eine Schneidlösung hinzu und stellen Sie sicher, dass sie sowohl die Probe als auch die Klinge bedeckt. Dann beginnen Sie, die Probe in 200 Mikrometer Scheiben zu schneiden. Übertragen Sie die Scheiben aus der Pufferschale in eine Petrischale, die eine Schneidlösung enthält, und schneiden Sie lose Kanten und überschüssige weiße Materie auf einen Anteil von ca. 70% Kortex und 30% weißer Materie.
In einem laminaren Strömungsschrank 600 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzufügen und bei 36 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid mindestens 20 Minuten vor dem Beschichten der Scheiben brüten. Danach verwenden Sie einen Pinsel, um eine Scheibe in jedem Brunnen zu verblechen. Wenn sich ungenutzte Brunnen in der Platte befinden, füllen Sie sie mit 400 Mikroliter sterilem Wasser.
Inkubieren Bei 36 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ergänzen Sie 10 Milliliter des zuvor vorbereiteten Kulturmediums mit einem neurotrophen Faktor des Gehirns bei einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter. Nach acht bis 16 Stunden 333 Mikroliter des konditionierten Mediums aus jedem Brunnen entfernen und 133 Mikroliter frisches BDNF-Ergänzungsmedium hinzufügen.
Ersetzen Sie alle 24 Stunden ein Drittel des konditionierten Mediums durch frisches BDNF-Ergänzungsmedium. Übertragen Sie zunächst die Scheiben aus den Brunnen, die Kulturmedium enthalten, auf eine neue 24-Well-Platte, die PBS enthält. Entfernen Sie die PBS aus jedem Brunnen und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter 4%Paraformaldehyd.
Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag das Paraformaldehyd vorsichtig aus den Brunnen entfernen und durch einen Milliliter 30%Saccharoselösung ersetzen. 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach 48 Stunden stellen Sie das gefrierende Mikrotome auf negative 40 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Saccharosebasis auf der Mikrotome-Stufe vor, auf der die Scheiben platziert werden sollen. Nachdem es vollständig eingefroren ist, schneiden Sie einen Teil der gefrorenen Saccharose, um eine flache Oberfläche zu produzieren, auf der die Scheibe platziert wird.
Als nächstes legen Sie jede Scheibe über eine gestreckte Kunststofffolie und verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe abzuflachen. Übertragen Sie die gestreckte Scheibe in einem zugweise auf die gefrorene Saccharosebasis. Nachdem die Scheibe fünf bis zehn Minuten zum Einfrieren ausgeruht ist, schneiden Sie die Scheibe in 30 Mikrometer Abschnitte.
Übertragen Sie die 30 Mikrometer-Abschnitte auf eine Petrischale, die PBS enthält, und fahren Sie mit einem Histologieprotokoll fort, das für das experimentelle Design geeignet ist. Bei der Bestimmung der Qualität und Gesundheit von kultivierten Scheiben ist ein kritischer Aspekt, der zu bewerten ist, das Vorhandensein und die typische Morphologie der erwarteten neuronalen Zelltypen, Neuronen und Gliazellen. Die typische Architektur der menschlichen kortikalen Laminierung wird in einer Scheibe am Tag in vitro vier durch neuronale Immunlabeling offenbart beobachtet.
Darüber hinaus wird auch die erwartete Anwesenheit von Mikroglia und Astroglia beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Gewebearchitektur weder durch den chirurgischen Eingriff, die Probenverarbeitung noch durch die kurzfristige Phase in vitro signifikant beeinflusst wird. Die neuronale Reaktion auf Kaliumchlorid-induzierte Depolarisation wurde auch in kultivierten Scheiben nach ERK-Phosphorylierung quantifiziert.
Interessanterweise ist eine deutliche Zunahme der ERK-Phosphorylierung in Kaliumchlorid-behandelten Scheiben am Tag in vitro vier zu beobachten. Schließlich wird die Reaktion von Scheiben am Tag in vitro vier auf eine toxische Herausforderung mit einem bekannten oxidativen Stressinduktor Wasserstoffperoxid bewertet. Die Exposition der Scheiben in 300 Millimolar Wasserstoffperoxid für 24 Stunden führte zu einer robusten Abnahme der MTT-Reduktion.
Zusammengenommen deuten der massive Zelltod, der in Tag in vitro fünf Scheiben nach der Wasserstoffperoxid-Herausforderung beobachtet wurde, und die Ergebnisse der Kaliumchlorid-induzierten Depolarisation auf die erhaltene allgemeine Gesundheit von Scheiben am Tag in vitro vier, die auf einen toxischen Reiz wie oxidativen Stress reagieren. Dieses Protokoll ist hauptsächlich Studien gewidmet, die auf Mehr-Wochen-Tests basieren, wie z. B. der Untersuchung molekularer Mechanismen der Neurotoxizität und des Neuroprotektionsmechanismus durch Kandidatenmedikamente. Obwohl dieses Protokoll der Verwendung von kortikalem Gewebe gewidmet ist, das von Patienten gesammelt wurde, die einer chirurgischen Behandlung für mikroresistente temporale Lappenepilepsie unterzogen wurden, ist es wahrscheinlich, dass Gewebe, das aus anderen Hirnregionen oder -bedingungen gesammelt wird, auch Quellen sein könnte, um frei schwebende Scheibenkulturen zu produzieren.
Slice-Kulturen aus erwachsenen menschlichen Gehirn kann schlüsselin sein, um unser Verständnis der menschlichen Neuropathologien aufgrund ihrer einzigartigen zellulären Schaltung und molekularen Maschinerie fehlt in Scheiben aus Nagetier Gehirn produziert.
