Epilepsie ist eine weit verbreitete neurologische Erkrankung. Rhinale Kortex-Hippocampus-organotypische Scheiben zeigen sich entwickelnde epileptische Ereignisse, die einer In-vivo-Epilepsie ähneln und daher als Ex-vivo-Modell der Epileptogenese verwendet werden können. Dieses System ist in der Tat ein hervorragendes Werkzeug zur Überwachung der Dynamik und des Fortschreitens der Epileptogenese sowie zum Screening potenzieller therapeutischer Ziele für diese Hirnpathologie.
Die Verfahren mit mir demonstrieren meine Studenten Francisco Meda und Mafalda Carvalho. Um das Gehirn von einem postnatalen Tag sechs bis sieben Sprague-Dawley-Welpen zu ernten, waschen Sie den Kopf zuerst dreimal in fünf Milliliter GBSS. Setzen Sie in einer Biosicherheitswerkbank eine scharfe Zette fest in die Augenhöhlen ein, um den Kopf an Ort und Stelle zu halten, und schneiden Sie die Kopfhaut mit einer dünnen Spitzenschere entlang der Mittellinie vom Wirbelforamen bis zu den Frontallappen.
Schneiden Sie den Schädel auf die gleiche Weise und entlang der zerebralen Querrest und verwenden Sie eine gekrümmte lange Pinzette, um die Schädelstücke auseinander zu bewegen. Verwenden Sie einen Spatel, um die Riechkolben zu entsorgen und die Rückenseite des Gehirns in eine 60-Millimeter-Platte mit fünf Millilitern kaltem GBSS zu übertragen. Setzen Sie eine feine Zette in das Kleinhirn ein und führen Sie den Spatel entlang der Mittellinie ein, um die Hemisphäre vorsichtig zu öffnen.
Verwenden Sie eine kurze gekrümmte Ziffe, um das überschüssige Gewebe, das den Hippocampus bedeckt, vorsichtig zu entfernen, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren, und schneiden Sie dann unter jeden Hippocampus. Übertragen Sie jeweils eine Hemisphäre des Hippocampus mit der Seite nach oben und parallel zueinander auf ein Stück Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier auf einen Tissue Chopper mit den Hemisphären senkrecht zur Klinge und schneiden Sie die Hemisphären in 350 Mikrometer Scheiben.
Übertragen Sie das geschnittene Gewebe in eine neue Petrischale mit fünf Millilitern kaltem GBSS und verwenden Sie rundspitzenelektroden, um die Scheiben sorgfältig zu trennen, wobei nur die Proben mit einem strukturell intakten Rhinalkortex und Hippocampus gehalten werden. Die DG- und CA-Bereiche sollten ebenso perfekt definiert sein wie die entorhinalen und perirhinalen Kortexregionen. Verwenden Sie einen Spatel und eine Rundspitzenelektrode, um bis zu vier intakte Scheiben auf einzelne Einsätze in der entsprechenden Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,1 Millilitern Kulturmedium pro Vertiefung zu legen.
Verwenden Sie eine P20-Pipette, um überschüssiges Dissektionsmedium von jeder Scheibe zu entfernen. Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.
Verwenden Sie eine Zette, um den Einsatz anzuheben. Saugen Sie das Medium aus der entsprechenden Vertiefung ab und setzen Sie den Einsatz wieder an ort und stelle. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um jedem Bohrplatz einen Milliliter frisches 37-Grad-Celsius-Medium hinzuzufügen.
Bereiten Sie den elektrophysiologischen Aufbau in einem geschlossenen Kreislauf vor. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate der Schnittstellenkammer auf zwei Milliliter pro Minute eingestellt ist, und öffnen Sie das Carb-Ox-Ventil. Überprüfen Sie den Wasserstand im System und legen Sie ein Stück Filterpapier in die Aufzeichnungskammer der Schnittstelle, um überschüssiges Medium abzulassen.
Legen Sie ein Stück Linsenreinigungspapier unter den Rahmen, um die Scheibe mit Medium zu versorgen, und schalten Sie den Temperaturregler, die Verstärker und die Mikromanipulatoren ein. Verwenden Sie eine Spritze, um eine Glaselektrode mit frisch zubereiteter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu beladen. Legen Sie die Glaselektrode in die Empfangselektrode und warten Sie, bis sich die Temperatur in der Grenzflächenkammer bei 37 Grad Celsius stabilisiert hat.
Legen Sie den Einsatz in einer Biosicherheitswerkbank in eine 60-Millimeter-Platte mit einem Tropfen Medium. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um eine Scheibe aus dem Einsatz zu schneiden, und legen Sie die Scheibe in die Grenzflächenkammer mit dem Hippocampus unten rechts, legen Sie dann die Empfangselektrode in die CA3-Pyramidenzellschicht, initiieren Sie das kontinuierliche Erfassungsprotokoll und zeichnen Sie die Scheibe für 30 Minuten auf. Um den Propidiiumiodid-Aufnahmetest durchzuführen, arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank.
Heben Sie den Einsatz aus dem Bohrbrunnen und fügen Sie Propidieniodid in Medium zu einer Endkonzentration von zwei Mikromolaren pro Vertiefung hinzu. Rühren Sie die Platte langsam auf, bevor Sie den Einsatz wieder in den Brunnen legen, und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen unter den Scheiben befinden. Wenn alle Scheiben behandelt wurden, bringen Sie die Platte in den Zellkulturinkubator zurück.
Für die Immunfärbung der Scheiben am Ende der Propidieniodid-Inkubation das Medium von der Unterseite jeder Vertiefung absaugen und einen Milliliter 4% Paraformaldehyd an die Ober- und Unterseite jedes Einsatzes geben. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Scheiben zweimal für 10 Minuten und einen Milliliter PBS pro Waschgang waschen und mit einem hydrophoben Stift zwei Rechtecke auf Mikroskopobjektträger zeichnen. Verwenden Sie eine scharfe Klinge, um die Scheiben aus den Einsätzen zu schneiden, und legen Sie eine Scheibe in jedes Rechteck.
Fügen Sie permeabilisierungsblockierende Lösung auf jede Scheibe für eine dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Inkubation fügen Sie die primären Antikörper von Interesse zu jeder Scheibe hinzu, um über Nacht eine Inkubation von vier Grad Celsius zu erhalten. Am nächsten Morgen die Scheiben dreimal für 10 Minuten pro Waschgang mit PBS-Tween waschen und die Scheiben mit den entsprechenden sekundären Antikörpern vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
Anschließend die Scheiben wie gezeigt waschen und jeder Scheibe 50 Mikroliter Hoechst-Lösung für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur zuweisen. Nach der Inkubation von Hoechst die Scheiben erneut waschen und jeweils 50 Mikroliter Montagemedium hinzufügen, dann einen Abdeckverschluss über die Scheiben legen und mit Nagellack versiegeln. Nachdem Sie die Objektträger 24 Stunden bei Raumtemperatur trocknen lassen, visualisieren Sie die immunhaltige und Propidieniodidaufnahme durch konfokale Mikroskopie.
Rhinale Kortex-Hippocampus-organotypische Scheiben zeigen gemischte interiktale und iktal-ähnliche Aktivität nach sieben Tagen in vitro. Nach 14 Tagen in vitro ist die spontane Aktivität durch iktale Entladungen gekennzeichnet, die sich nach 21 Tagen in vitro zu einer überwältigenden iktalen Aktivität entwickeln, wobei die iktalen Ereignisse länger als eine Minute dauern. Propidieniodidaufnahme und Immunhistochemie gegen den neuronalen Marker NeuN zeigten einen neuronalen Tod in sieben Tagen in vitro-Scheiben, der nach 14 Tagen in vitro in allen Bereichen des Hippocampus erheblich erhöht ist.
Nach sieben Tagen in vitro sind verzweigte Mikroglia mit einer niedrigen CD68-Expression häufiger als Iba1-positive CD68-positive reaktive Mikroglia. Während nach 14 Tagen in vitro in allen Bereichen des Hippocampus Iba1-positive CD68-positive amöboide M1-Mikroglia Mikroglia mit einer niedrigen CD68-Expression überschreiten. Nach 14 Tagen in vitro können einige Iba1-positive CD68-positive Zellen mit einem hyperverzweigten Aussehen lokalisiert werden, was auf die Möglichkeit eines entzündungshemmenden M2-Mikroglia-Phänotyps hindeutet.
Nach sieben Tagen in vitro ist die Expression von CD3 kaum nachweisbar, während in 14-tägigen In-vitro-Scheiben hypertrophe Gliafibrillär-saure Protein-positive CD3-positive Astrozyten beobachtet werden können, was auf eine fortschreitende Aktivierung von A1-Astrozyten hindeutet. Bereiten Sie rhinale Kortex-Hippocampus-Scheiben mit äußerster Sorgfalt vor. Stellen Sie sicher, dass Sie das überschüssige Gewebe über dem Hippocampus entfernen, da dies die Integrität der Scheiben während des Schneidens beeinträchtigen kann.
Das strukturelle Defizit wirkt sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Scheiben aus. Zusätzlich zu den demonstrierten Ansätzen kann eine Vielzahl von Assays wie Western Blot-Analyse, Real-Time-PCR und ELISA auf dieses System angewendet werden, um spezifische Fragen zur Epileptogenese zu beantworten.
