Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 und P3013330 von den National Institutes of Health. Wir möchten Michele Houston, Elena Dhima und Dr. Anna Velcich für ihre wertvollen Kommentare bei der Entwicklung der Krypta Isolierungsprotokoll danken. Wir danken auch den Diabetes-Schulungen und Forschungszentrum in der Albert Einstein College of Medicine vom NIH P60DK20541 unterstützt, und Dr. Michael Brownlee und Dr. Xue-G. Richter, der direkt und Betrieb der Seahorse Anlage verbunden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt. 1. Crypt Isolierung und Kultur <ol><li> Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm: <ol><li> Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) mit 2x Antibiotika-Antimykotika (anti-anti). Rasch zu isolieren Dünndarm. </li><li> Gründlich sezieren frei von mesenterialen Fett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu perforieren - jederzeit feucht mit eiskaltem PBS halten das Gewebe. Öffnen Sie inteStine längs und gründlich mit eiskaltem PBS. </li><li> Schneiden Sie Dünndarm in zwei Abschnitte und flach aus mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig abkratzen Zotten mit einem vorgekühlten Rutsche. Kräftig in eiskaltem PBS mehrmals waschen. </li><li> Inkubieren 3 min in 20 ml 1x PBS pro 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) /0.5 mM Dithiothreitol (DTT) für nicht-enzymatische Dissoziation des Gewebes. </li><li> Geschnitten Gewebe in kleine Stücke (2-4 mm) mit einer Rasierklinge auf einem vorgekühlten Folie. Übertragen Sie die Stücke in einen 50-ml-Tube mit 20 ml eiskaltem PBS. </li><li> Pipette nach oben und unten vorsichtig 10x mit einem 10 ml sterile Einwegpipette. Lassen Gewebefragmente zu sedimentieren durch die Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie drei weitere Male; stellen Sie sicher, Überstand klar ist. </li><li> 20 ml PBS pro 2 mM EDTA. Swirl und Inkubation bei 4 ° C für 30 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Lassen Gewebe Sediment und Überstand verwerfen. 15 ml eiskaltem PBS und Pipettennach oben und unten 5x mit einer 10 ml Pipette. Lassen Sie die Gewebefragmente Sediment zu sammeln und das Überstand als Fraktion 1 (F1). Wiederholen Sammeln F2-F5, jede Fraktion getrennt gehalten. </li><li> 15 ml eiskaltem PBS und diesmal unter kräftigem Schütteln für 15 Sekunden. Sammeln Sie F6 und wiederholen Sie für F7, F8. Wenn Gewebestücke beginnen zu schweben, tippen, um ihnen helfen zu begleichen. </li><li> Untersuchen Sie ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop. Pool jene Fraktionen, die Krypten. </li><li> Übergeben Sie die gesammelten Fraktionen durch einen 70 &amp; mgr; m Nylon Zellsieb, Sammeln Krypten in einem 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge bei 100 xg für 5 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml eiskaltem PBS mit 2x Anti-Anti und Transfer Krypten in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie den Wasch noch einmal. </li><li> 2x Anti-Anti - einmal mit 10 ml eiskaltem ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) Waschen Sie die Krypten. </li><li> Waschen Sie die Krypten einmal mit 10 ml ADF - 1x Anti-Anti. </li><li> Zählen Sie die Krypten mit einer Zählkammer. Passen Sie die Krypta Lösungsvolumen und Transfer zu einem 1,5-ml-Röhrchen, so dass die endgültige Krypta Konzentration bei resuspendiert wird 100-500 Krypten pro 50 ul gallertartige Proteinmischung (Matrigel) sein. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren Krypten im gelartigen Proteingemisch. </li><li> Platte 50 ul Krypta - gallertartig Proteingemisch Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (Wachstumsbereich: 2 cm 2), sorgfältig Platzierung der Aufhängungseinbruch in der Mitte jeder Vertiefung. Pflegen Sie die Platte in einem CO 2, 37 ° C Inkubator für ~ 30 min, bis die Suspension verfestigt. </li><li> In 500 ul eiskaltem komplette Kulturmedien (Advanced DMEM / F12 mit 1x Anti - Anti, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 50 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Rekonstitution Wachstumsfaktoren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt Organoide Kultur und Passage: <ol><li> Passage Krypta Organoiden 14-21 Tage nach der Aussaat (oder nach Bedarf) wie folgt: <ol><li> Ändern Medien jeden Freitag und Montag. Mittwochs, ersetzen die Hälfte der Medien mit frischem Medium. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe zweimal Waschen mit 500 ul PBS bei 5-Minuten-Intervallen. </li><li> Entfernen PBS und sanft brechen die gallertartige Proteinmischung mit einem sterilen P1000 Mikropipettenspitze. </li><li> 1 ml komplettes Kulturmedien auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Sanft stören die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x (Check unter dem Mikroskop für die ordnungsgemäße Organoid Dissoziation mit einer guten Ausbeute Krypta bis eine einheitliche Technik wird entwickelt). </li><li> Übertragen Sie die Krypten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen;Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Split in einem Verhältnis von 1: 3 oder 1: 6 wie erforderlich, Resuspendieren Krypten in 50 &amp; mgr; l Matrigel pro Vertiefung. Gehen Sie wie oben (Abschnitt 1.1.16-18) beschrieben. </li></ol></li><li> Crypt Organoide Freezing: <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe in 500 ul PBS waschen. </li><li> Verteilen das gallertartige Proteinmischung mit einem P1000 Pipettenspitze. </li><li> 1 ml Medium auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Vorsichtig brechen die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x. </li><li> Übertragen Sie die Organoiden in ein 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Resuspendieren Krypten in 500 ul gefrierenden Medien. </li><li> Transfer Krypten zu einem Kryoröhrchen, den Schlauch in einem Gefrierbehälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank overnight. </li><li> Übertragen Krypten zu flüssigem N 2 Tank. <ol><li> Recover gefrorenen Krypta Organoiden durch schnelles Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Waschen mit 500 ul komplettem Kulturmedium einmal, Zentrifuge bei 100 × g, 5 min und resuspendieren in gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur wie oben beschrieben. Für bessere Erholung, fügen ROCK-Inhibitor (Y-27632) mit dem gefrierenden Medien. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt Organoide Stoffwechsel Assay <ol><li> 24-Well-Platte Zubereitung: <ol><li> Isolieren und zählen Krypten nach dem Protokoll (siehe Abschnitt 1.1 für crypt Isolation und Abschnitt 1.2 für crypt Durchgang). </li><li> Resuspendieren Krypten in gallertartigen Proteinmischung (100-200 Krypten pro 20 ul). </li><li> Platte Krypta-gallertartige Proteingemisch Suspension in einem 24-Well-Assayplatte (stellen Sie sicher, es gibt mindestens dreifacher Ausführung für jede Probe) und lassen Sie die Suspension bei 37 ° C in einem CO 2 zu verfestigenInkubator; fügen Sie dann 500 ul komplette Kulturmedien. </li><li> Kultur Krypten (wie in Abschnitt 1.1 beschrieben) und beobachten unter dem Mikroskop bis Krypten in voll entwickelten Organoiden wachsen. </li></ol></li><li> Extracellular Flux Assay: <ol><li> Hydrat Patrone über Nacht in einem Nicht-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C Inkubator. </li><li> Entfernen des Kulturmediums und waschen Organoiden zweimal mit 500 &amp; mgr; l DMEM (ohne: Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, und mit: Phenolrot). Warten Sie 5 min. </li><li> Gib 675 &amp; mgr; l pro Vertiefung Testmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 mM D-Glucose) in jede Vertiefung. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopische Morphologie, um sicherzustellen, dass Organoiden und die gallertartige Proteinmischung intakt nach den Wäschen sind. Inkubieren für 1 Stunde in einer nicht-CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; M injizierbaren Verbindungen (Oligomycin, Carbonylcyanid-p-Trifluor-methoxy-phenyl-Hydrazon (FCCP), rotenone) in Testmedium. </li><li> Set-up die Patrone durch das Laden 75 ul 10 uM injizierbaren Verbindungen in die Häfen der Kartusche nacheinander: Port A - Oligomycin; Port B - FCCP; und Port C - Rotenon (Die Endkonzentrationen während des Assays wird 1 &amp; mgr; M). </li><li> Inkubieren Kassette 30 min - 1 h bei 37 ° C in einer nicht-CO 2 -Inkubator. </li><li> Gleichzeitig schalten Sie den XF Analyzer und erstellen Sie die Assay-Protokoll-Vorlage. </li><li> Zeigen Patrone und Gebrauchsplatte in XF Analyzer und führen Sie &quot;Kalibrieren&quot; Patrone. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopisch sicherstellen, dass sie auf die gallertartige Proteingemisch gebunden sind. </li><li> Lastzellkulturplatte in Instrument und führen Testprotokoll. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

Es sind keine Angaben.

Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander. 29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am 29. min, O...

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (&gt; 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster 1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation 3-5 gestatten und vielleicht fahren . Studien von Darmkrebs sowie anderen gastrointestinalen Tumoren einschließlich Dünndarm Krebsarten liefern wichtige Einblicke in die Ursache der Tumorbildung. Untersuchung der Stoffwechselunterschiede zwischen normalen, pro-tumor und tumorerzeugende Staaten von gastrointestinalen Organsysteme kann det unterstützenermination des relativen Risikos für die Tumorentwicklung sowie Früherkennung von Neoplasien. Darüber hinaus verstehen bioenergetischen Stoffwechsel mit mitochondriale Atmung und Glykolyse liefert grundlegende Einblicke in die Zellphysiologie, Altern und Krankheitszustand stört Darm Homöostase. Nutzung der Bioenergetik Assay-Technologie für extrazelluläre Flussanalyse können die Preise der mitochondrialen Atmung und Glykolyse gleichzeitig in wachsenden Zellen in Kultur in Echtzeit 6,7 bewerten. Bis vor kurzem wurden in vitro Untersuchungen von Dünndarmzelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren 8,9 abgeleitet sind und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Im Jahr 2009, Sato et al. 10 führte eine ex vivo Kultursystem zur dreidimensionalen (3D) Maus Darmepithelzellen Organoiden wachsen oder epithElial &quot;Mini-Mumm&quot;, geeignet für experimentelle, diagnostische und therapeutische Untersuchungen 10,11. Außerdem Krypten von kalorisch eingeschränkt Mäusen isoliert behalten ihre veränderte Wachstumseigenschaften wie Organoiden in solchen Kulturen 12. Im Vergleich zu transformierten Zelllinien können Krypta organoide Kulturen verwendet, um physiologisch relevante Daten präsentiert ein weit besseres Modell für die in vivo-Zustand zu verstehen erzeugen. Wir angepasst Bioenergetik-Analyse-Technologie, um den Energiestoffwechsel der Darm Krypta Organoiden testen. Maus Darm Krypta Organoiden kultiviert wurden ex vivo zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel Studien vorgestellt zu entwickeln. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) der Krypta Organoide wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Stoffwechselinhibitoren (Oligomycin, Rotenon) und ein Ionenträger (Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) gemessen. Die Krypta organoid metabolische Reaktion auf diese chemischen Verbindungen wurden erfolgreich durch wechselnde ECAR und OCR-Werte wider. Cellular bioenergetischen Untersuchungen werden die gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Stoffwechsellage und Krankheitsrisiko und Phänotyp bei Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Stoffwechselstörungen und mitochondrialen Erkrankungen aufzuklären und helfen Voraus Screening-Methoden mit unmittelbaren Auswirkungen für translationale Medizin. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für kleine Darmkrypten isolieren und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kulturen für metabolische Assays verwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen. <p class="jove_con...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine.  Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert. 

Serie: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...