Koo BK und Mustata RC werden von der Sir Henry Dale-Stipendium der Wellcome Trust und Andersson-Rolf A unterstützt wird von der Medical Research Council (MRC) unterstützt. Fink J wird von der Wellcome Trust 4-Jahres-PhD-Programm unterstützt.

Alle Mäuse in dem folgenden Protokoll verwendet, wurden in spezifischen Pathogen-freien Bedingungen gehalten und alle Verfahren wurden nach den United Kingdom Home Office Bestimmungen durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Medien 1 Stunde im Voraus zu verwenden (siehe Tabelle 1 und Werkstoffliste für weitere Details) und Pre-warm in einem 37 ° C Wasserbad mindestens 10 min vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Die Züchtung des Dünndarms (SI) Organoide Hinweis: Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator durchgeführt. Geräte und Reagenzien in Kontakt mit lebenden Zellen müssen steril sein. Vorwärmen der Gewebekulturplatte ist wichtig, da es verhindert, dass der Keller Matrix (Matrigel oder BME) fällt von Ausbreitung, wenn der Aussaat. Auch sollte die Keller Matrix auf Eis aufbewahrt werden. Lagerung bei -20 ° C und Auftauenauf Eis vor dem Gebrauch. <ol><li> Isolieren Krypten <ol><li> Zur Isolierung des Dünndarms zu opfern Sie die Maus nach den nationalen Regeln und Vorschriften, dann das Tier auf den Rücken und den Bauch waschen mit 70% Ethanol. Durchführen einer Längsmittelschnitt von der Leiste bis zum Brustbein. Zuerst schneiden Sie die Haut und dann das Unterhautgewebe. Entfernen Sie den Dünndarm aus dem Blinddarm in den Magen. Krypten von Zwölffingerdarm, Leerdarm und Krummdarm isoliert für Organoid Kultur verwendet werden. </li><li> Ohne Calcium oder Magnesium (PBS0) Waschen der isolierten Dünndarm mit vorgekühlten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in 3-5 cm lange Stücke schneiden und mit einer Schere schneiden Sie es in Längsrichtung zu öffnen. Verbreiten Sie das Gewebe mit einer Pinzette. </li><li> Abkratzen Zotten mit einem Deckglas. Vorsicht, zu viel Kraft das Gewebe zu zerreißen verursachen und die Ausbeute der Krypten in folgenden Schritten zu reduzieren. </li><li> Übertragen des Gewebes in ein 50 ml Röhrchen, das vorgekühlte PBS0 using Pinzette. Die Gewebefragmente durch kräftiges Schütteln waschen und ändern Sie die PBS0. Wiederholen Sie 2-3 x oder bis die PBS0 dreht sich weniger bewölkt. </li><li> Inkubieren des Gewebes in einem 50-ml-Röhrchen mit 30 ml PBS0 mit 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 30 min bei 4 ° C auf einer Rohrwalze. </li><li> Kräftig schütteln das Rohr und übertragen das Gewebe zu einem anderen 50-ml-Tube mit 30 ml PBS0 mit 5 mM EDTA. Die 1 mM EDTA-Lösung (zuvor mit dem Gewebe) wird eine Mischung aus Krypten und Zotten enthalten. Diese Fraktion eignet sich nicht für die Aussaat von Organoiden, wie es enthält oft einen hohen Anteil an Zotten. </li><li> Bebrüten das Gewebe weiter für 1 h bei 4 ° C auf einem Rohrwalze. </li><li> Kräftig schütteln den Schlauch und sammelt die Lösung in einem sauberen 50-ml-Tube. Bestätigen das Vorhandensein der Krypten und schätzen die Zahl, beispielsweise durch Zählen Krypten in 50 ul durch Lichtmikroskopie. Berechnen Sie die benötigt wird, um 50-100 Krypten erhalten und übertragen sie in ein 1,5 ml t Volumenube. </li><li> Spin bei 300 g für 5 min. Überstand verwerfen, das Pellet in 50 ul Keller Matrix und Saatgut in einem vorgewärmten Platte mit 24 Vertiefungen. Die Platte in einem Brutschrank für 5-15 Minuten, so dass die Keller Matrix polymerisiert. </li><li> Overlay mit 500 ul ENR-Medium (siehe Tabelle 1). Etwa 24 Stunden nach der Aussaat der Organoide eine kleine runde zystische Form zeigen und nach weiteren 2-3 Tagen angehende Strukturen werden sichtbar. Ändern Sie die frische ENR Medien alle 3 Tage. </li><li> Passage organoiden Kulturen alle 7 Tage. </li></ol></li><li> Passagieren und Warten Organoide <ol><li> Pflegen Sie die Organoide durch die Aktualisierung der Medien alle 3 Tage und Durchgang 1: 3 oder 1: 5, wie das Lumen wird mit toten Zellen, etwa alle 7 Tage gefüllt. </li><li> Brechen die Keller Matrix Kuppel mit Medium mit 1 ml Pipetman Spitze und überträgt es aus dem Brunnen in ein 1,5-ml-Tube. </li><li> Mechanisch distanzieren die Organoide durch Pipettieren eintwa 50x mit einer feinen (zB 200 ul) Spitze. </li><li> Spin bei 300 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 150-250 ul Keller Matrix. Saatgut in einem vorgewärmten Platte mit 24 Vertiefungen (50 ul Keller Matrix / Vertiefung). Vor der Aussaat Pipette der Keller-Matrix auf und ab, sobald die Beschichtung der Wand der Spitze. Pipette langsam auf Blasen und Saaten in der Mitte des Bohrlochs, um den Keller Matrix der Ausbreitung zu hindern. Es ist erwünscht, eine Kuppel aus Keller-Matrix in der Mitte des Bohrlochs zu erhalten. </li><li> Inkubieren in einer Gewebekultur-Inkubator für 5-15 Minuten, so dass die Keller Matrix polymerisiert. Overlay mit 500 ul ENR Medien pro Vertiefung. </li></ol></li></ol> 3. Pre-Infektion Behandlung von SI Organoide ANMERKUNG: Abbildung 1 veranschaulicht die Übertragungsprozedur. <ol><li> Austausch ENR zu ENRWntNic (siehe Tabelle 1) mittlere und wachsen die Organoide in tsein Medium für mindestens 3 Tage oder bis sie eine zystische Morphologie angenommen. Wnt3a erhöht die Anzahl der Stamm-und Paneth-Zellen während Nicotinamid (Nic) verbessert die Effizienz Kultur. </li></ol> 4. Virusproduktion <ol><li> Ein 150-mm-Schale von Platinum-E-Zellen pro Infektion benötigt. Samen etwa 5 x 10 6 Zellen mit 15-18 ml Medium (DMEM + 10% FBS) in Gegenwart von Puromycin (1 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Transfektion von Zellen nach 2-3 Tagen, wenn sie 70-80% Konfluenz erreicht haben. Ändern das Medium DMEM + 10% FBS ohne Puromycin und Blasticidin vor der Transfektion. </li><li> Werden 30 ug von retroviralen DNA-Konstrukt, und 240 ul von Polyethylenimin (PEI) in Röhrchen gegeben, 1 ml Opti-MEM trennen. Mischen und bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Bündeln die beiden Lösungen und bei Raumtemperatur für 20-30 min. Fügen Sie die komplette Mischung auf das Medium der Platinum-E-Zellen und vorsichtig schütteln plate die Gleichverteilung der DNA-PEI-Komplexe gewährleisten. </li><li> Die Platinum-E-Zellen mit der Transfektion Mischung über Nacht inkubieren und aktualisieren das Medium am nächsten Tag. Halten der Zellen in dem neuen Medium für 2 Tage. </li><li> Sammeln nur das Medium in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen, führt es durch einen 0,45 um Filter und Zentrifuge bei 8.000 × g bei 4 ° C für 12-16 Stunden. Überstand verwerfen und das Pellet in 250 ul Transduction Medium (siehe Tabelle 1). </li></ol> 5. Organoide Fragment Vorbereitung <ol><li> Für eine Infektion ein gut von einer 24-Well-Platte benötigt wird. Brechen die Keller Matrix Kuppel mit Medium mit 1 ml Pipetman Spitze und überträgt es auf einem 1,5-ml-Tube. </li><li> Verwenden Sie ein feiner Spitze Volumen (zB 200 ul Tipps) mechanisch stören die Organoide durch Pipettieren (30-50x). Die Lösung wird trüb und keine ganze Organoide sichtbar sein soll. </li><li> Zentrifuge bei Raumtemperatur 900 g für 5 min<html> . </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ul Zellkultur rekombinanten Protease (zB TrypLE). Bei 37 ° C für 5 min. Nach der Inkubation überprüfen Sie die Größe der Fragmente Organoid mittels Lichtmikroskopie, Zählen der Anzahl der Zellen pro Fragment. Fragmente mit 5-10 Zellen eignen. Wenn die Mehrheit der Fragmente eine höhere Anzahl von Zellen enthalten, die Inkubationszeit kann von 2 min zu einem Zeitpunkt erhöht werden. </li><li> Beenden Sie die Dissoziation durch Zugabe von 500 ul ENR Medium. </li><li> Zentrifuge bei Raumtemperatur 900 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und halten das Pellet auf Eis oder 4 ° C. </li></ol> 6. retrovirale Transduktion <ol><li> Kombinieren Organoid Fragmente mit 250 ul des retroviralen Lösung (aus Abschnitt 4.5) in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte. Vorsichtig mischen durch langsames Pipettieren mit 1 ml Pipetman Spitze. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation und Oberflächen <ol><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 32 ° C, 600 g, für 1 Stunde. Entfernen Sie vorsichtig das Parafilm und Inkubation der Platte in eine Gewebekultur-Inkubator für 6 Stunden. </li></ol> 8. Setzen von Infizierte Organoide Fragmente <ol><li> Übertragen Sie die infizierten Organoid Fragmente und Übertragungsmedien aus dem Brunnen in ein 1,5-ml-Röhrchen und Spin bei 900 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen, das Glas, das die Pellets auf Eis für 5 min abkühlen. 100 l Keller Matrix und das Pellet durch Pipettieren langsam auf und ab. </li><li> Samentropfen 50 ul &quot;Keller Matrix -Cell mixe in einem neuen 24-Well-Platte. Die Platte bei 37 ° C für 5-15 Minuten, bis die Keller Matrix erstarrt. </li><li> Fügen Transduktion Medien ohne Polybren zu den Vertiefungen pipettieren und die Platte in einer Gewebekultur-Inkubator. Medien ändern alle 2-3 Tage. </li></ol> 9. Auswahl <ol><li> Starten sewahl nach 2-3 Tagen durch Zugabe von Puromycin (1 ug / ml) zu den Medien. </li><li> Wenn die Fragmente beginnen zu bilden Organoiden ersetzen Transduktion Medien ENR Medien mit Puromycin (1 ug / ml) ergänzt. </li></ol> 10. Post-Infektion Behandlung von SI Organoide <ol><li> Kultur transduziert Organoide nach dem &quot;Passagierung und Pflege Organoide&quot;-Protokoll (Abschnitt 2.2.1). Nach 1-2 Wochen werden die SI Organoide ihre angehenden Strukturen wieder zu erlangen. </li><li> Nach Auftreten der angeh Strukturen induzieren die Expression der miRNA oder cDNA durch Zugabe von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) in einer Arbeitskonzentration von 1 uM. Beachten Sie, dass dieser Schritt ist nur gültig, wenn mit Hilfe von retroviralen Vektoren Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) und pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) und Organoide exprimieren Cre-ERT2. </li></ol> 11. Bestätigung der Infektion und Expression / Unterdrückung der Gen von Interesse <ol><li> Bei der Verwendung von retroviralen Vektoren Addgene (32702, 32703 und 32704) Transduktionseffizienz kann durch Beobachtung der dsRed Ausdruck bestätigt werden. Ferner kann die Expression oder Suppression des Gens von Interesse durch Western-Blot bestätigt werden, unter Verwendung des GFP oder 3xHA Epitop (für die Gen-Überexpression) und qPCR (Gene Knockdown), wie in Koo et al 4 veranschaulicht. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Um das zu erreichen hohe Transduktionseffizienz bestimmte Aspekte sind kritisch. Eine davon ist die Vorbehandlung von Organoide mit ENRWntNic Medien, bis sie eine runde Form zystischer erlassen. Dies erhöht die Anzahl von Stammzellen, und dadurch die Möglichkeit zu erhalten, die eine stabile Integration des Transgens, sowie die Erhöhung der Überlebensrate der SI Organoiden gesamten Übertragungsverfahren. Ein weiterer Parameter ist die Inkubationszeit folgenden spinoculation. Zu kurz oder zu lange Inkubationszeit führt zu einer schlechten Transduktionseffizienz und schlechte Überleben der Organoide sind. Die spinoculation Schritt ist nicht wesentlich, obwohl es den Prozentsatz der transduzierten Organoiden deutlich erhöht. Schließlich ist mit hohem Titer Virus Schlüssel für eine erfolgreiche Transduktion. Dies ist abhängig von der Art der Verpackungszelllinie und Viren. Die Kombination von Platin-E-Zellinie murinen Stammzellvirus (MSCV), zeigte einen Titer hoch genug für die Transduktion von Organoiden zu erzeugen. ve_content &quot;&gt; Hier finden Sie Tipps für die Fehlersuche, die helfen können, erfolgreich Übertragung zu erreichen. Erstens, wenn die Transfektion der Verpackungszelllinie ist schlecht, stellen Sie sicher, dass die Konfluenz der Zellen liegt zwischen 70-80%, und dass die Inkubationszeit der gepoolten PEI-DNA Gemisch wird 20-30 min. Das Überleben der Organoide während Übertragung hängt stark von der Fragmentgröße. Zu lange Trypsinbehandlung bewirkt, dass die Mehrzahl der Fragmente von weniger als 3 Zellen bestehen, und verringert dadurch die Überlebens organoiden. Ein weiterer Faktor ist die Aktivität des Wnt-konditionierten Medium, wenn die Tätigkeit zu gering steigern sie durch Zugabe von CHIR99021 in einer Arbeitskonzentration von 5 um das Überleben zu erhöhen. CHIR99021 hemmt GSK3, was zu erhöhten Wnt-Signal. Außerdem Y-27362, die verhindert, Anoikis an die Übertragungsmedien hinzugefügt, um die Überlebensfähigkeit Organoid zu verbessern, da die Organoide sind Fragmente (mit 1-10 Zellen) vor der Weiterleitung gestört. Als60, oben erwähnt, sollte die Inkubationszeit nach spinoculation 6 Stunden nicht überschreiten. Schließlich, wenn schlechte Übertragungs beobachtet die oben genannten Faktoren, die die virale Titer und die Größenbeschränkung des Einsatzes für den retroviralen Vektor in Betracht gezogen werden. Die Effizienz des Zuschlags ist stark abhängig von der miRNA. Da der Wirkungsgrad variiert mit der Kombination des Zielgens und miRNA es lohnt Führen einer Effizienz Bildschirm zu denen, die am besten zu erkennen. Die Technik basiert auf der epithelialen Phänomene des organoiden System beschränkt. In der Zukunft kann es möglich sein, infektiösen oder Autoimmunerkrankungen, durch Co-Kultivierung von Pathogenen oder Rekonstitution mit Komponenten des Immunsystems abgeleitet untersuchen sind. Darüber hinaus kann nur Retroviren tragen Einsätze aus einem relativ kleinen Größe. Folglich natürlich vorkommende regulatorische Regionen ausgeschlossen werden und somit die Expression des Transgens nicht zu imitieren, dass derdas endogene Gen. Wie oben erwähnt, ist der Zuschlags Effizienz abhängig von der Ziel-Gen und miRNA. Wenn keine miRNA mit geeigneten Zuschlags Effizienz gefunden werden kann es die Verwendung der Technik für diese spezielle Zielgens zu begrenzen. Theoretisch sind mit allen standardisierten Organoide manipulative Techniken zur Zelllinien verwendet werden, kompatibel. Retrovirale Transduktion war die erste Methode gemeldet werden 4, und vor kurzem BAC (Bacterial Artificial Chromosome) -transgenesis verfügbar geworden 5. Mit insgesamt Generationszeit von 2-3 Wochen nach der Transfektion der viralen Plasmid in die Verpackungszelllinie, es ist deutlich schneller als die Erzeugung einer transgenen (tg) der Maus. Durch die Aufrechterhaltung der in-vivo-Krypta-Zotten Architektur, während Stammzellen enthält, sowie alle differenzierten Zelllinien des Darmepithels überbrückt die Organoid Kultursystem die Lücke zwischen Tier tg und frühere Zellkultur. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode, um phänotypische Analyse von endodermalen Epithel in vitro durch GAIN- durchführen und Verluste von Funktionsprüfungen. Dies macht es möglich, physiologisch relevanten Fragen in adulten Stammzellen Biologie anzugehen, mit einem minimalen Bedarf an tg Mäusen. Zum Beispiel könnte die Erzeugung von Knockout-Mäusen unter Verwendung von Organoiden Neugeborenen Mutanten mit perinatale Letalität 6 abgeleitet vermieden werden. Darüber hinaus kann das Verfahren auf Organoide von vorher fest Knockout-Mäusen, die Rolle Paraloge durch Ausführen einer zusätzlichen Zuschlags 7,8 studieren angewendet werden. Nach der Gründung der kleinen Darm Organoide, hat die Anpassung der ursprünglichen Kultur Protokoll Kultivierung von Bauchspeicheldrüsen, Leber, Dickdarm-und Magen Epithelien 9-11 erlaubt. Darüber hinaus haben menschlichen Darm-und Tumor Organoide Organoide aus normalen menschlichen Biopsien abgeleitet, primäre adenoma und Darmkrebs Biopsien 10. Die virale Infektion Protokoll kann leicht auf diese Art von Organoiden verlängert und bietet eine beispiellose Möglichkeit zum Durchführen funktioneller Studien in menschlichen Geweben stammen. Zusammengenommen ist retroviralen Transduktion von Dünndarm Organoide eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von Stammzellen Wartung, Differenzierung und Zellschicksal Entscheidung, sowie Zellsignalisierung und Zell-Zell-Interaktionen.

Hochdurchsatz-Genetik ist notwendig, um unsere biologische Verständnis des Körpers zu erhöhen, die Verbesserung des derzeitigen Grundlagenforschung und Medizin. Mausgenetik der Goldstandard für die Untersuchung von Gen-Funktion in vivo, obwohl es sowohl zeitaufwendig und kostspielig ist. Zelllinien, wobei die andere gemeinsame Wahl, eine höhere Durchsatzleistung, während sie weniger teuer. Sie werden jedoch durch ihre Unfähigkeit, die richtige Mikro und dadurch die physiologischen Reaktionen in vivo gesehen reproduzieren behindert. Daher besteht ein eindeutiger Bedarf an einem einfach zu handhabenden Modellsystem, das Kosten / zeiteffiziente Hochdurchsatzanalyse, während ermöglicht Nachahmung der in vivo in transgenen (tg) Mausexperimenten beobachtet physiologischen Reaktionen. Für die endodermalen Epithel erschien eine solche Modellsystem im Jahr 2009 1. Unter die Erkenntnisse aus der Entdeckung der Lgr5-positiven Darm Stammzellen wurdeInformationen über die Nische, die den extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren für die Stammzell Wartung notwendig. Unter Verwendung dieser Informationen es möglich, &quot;Mini-Mumm &#39;auch als Organoide 2 bekannt zu etablieren wurde. Vor kurzem wurde ein Konsens Nomenklatur für in vitro-Kulturen, in denen Organoide werden als &quot;enteroids&quot; genannt, wurde 3 vorgeschlagen. Wie Zelllinien sind die Organoide ständig wachsenden und leicht, mit Liganden und Inhibitoren zu behandeln. Jedoch anstatt zweidimensional sind dreidimensionale selbstorganisierenden Strukturen, die Krypta-Zotten Organisation beizubehalten sowie Stammzellen und differenzierten Zelllinien des Dünndarms (SI). Organoide bestehen aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen, die eine luminale Fläche umgeben. Vorstehende angehende Strukturen entsprechen Dünndarm Krypten, die die Stammzellraum. Ausgehend von der Spitze des angehenden Struktur Vorläuferzellen differenzieren, wie sie miRost in Richtung des Epithels, wo terminal differenzierten Zellen in das Lumen zu vergießen. Im Vergleich zu Zelllinien, diese ex vivo-System näher rekapituliert die normale Physiologie und ist daher ein vielversprechendes Modellsystem für die Dünndarm-Epithel. In diesem Video-Protokoll von retroviralen Transduktion, präsentieren wir eine Methode, die Ex-vivo-Studien Genfunktion in diesem Roman Organoid Kultursystem ermöglicht. Wir beginnen mit der Beschreibung organoiden Kultur in einer Schritt-für-Schritt-Weise, und weiter durch den Nachweis der Erzeugung von Retroviren, gefolgt von der Übertragungsprozedur. Schließlich gibt es einen Abschnitt für zusätzliche Hinweise für die Fehlersuche. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass sie mit Echtzeit-Bildgebung oder Drogenscreening kombiniert, um die Homöostase, Zellschicksal Entscheidungen und Zell-Zell-Interaktionen im Darmepithel zu untersuchen. Aufgrund ihrer einfachen Architektur und schnelle Fluktuation, Organoide stellen eine ideale Model System für das Studium der Biologie mit adulten Stammzellen. Darüber hinaus können retrovirale Transduktion zu Organoide von vorher festgelegten transgene Mäuse sowie menschliche Patientenproben abgeleitet angewendet werden. Als Knock-in-und Knock-out-Ansätze können nicht auf den Menschen ausgeweitet werden, die menschlichen SI Organoide bilden eine attraktive Alternative. Zusammenfassend Genmanipulation durch retrovirale Transduktion ermöglicht phänotypische Analyse im Dünndarm von Mäusen Organoide oder menschliche Gewebeproben stammen, ergänzt somit Mausgenetik und Zelllinien, während die Eröffnung neuer Wege für die Studien in menschlichen Geweben abgeleitet. Retrovirale Transduktion ermöglicht GAIN- und Verlust-Funktions-Studien in der organoiden Kultursystem 4 durchgeführt werden. Damit ist es eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von Gen-Funktion, mit adulten Stammzellen Biologie und Krankheit, während sie in Übereinstimmung mit den drei Rs (Reduzierung, Verfeinerung und Ersatz).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Lgr5-positiven Stammzellen können mit der wesentlichen Wachstumsfaktoren ergänzt werden EGF Noggin, und R-Spondin, die uns die Kultur ständig wachsende primäre epitheliale Strukturen 3D in vitro ermöglicht. Sowohl die Architektur und physiologischen Eigenschaften dieser &quot;Mini-Mumm&quot;, auch genannt Organoide, ähneln ihre in-vivo-Pendants. Dies macht sie zu einem attraktiven Modellsystem für die Dünndarm-Epithel. Verwendung von retroviralen Transduktion können funktionelle Genetik jetzt bedingten Gen-Überexpression oder Knockdown durchgeführt werden. Dieses Video zeigt den Vorgang des organoiden Kultur, die Erzeugung von Retroviren und den retroviralen Transduktion von Organoiden phänotypische Analyse Dünndarmepithels in vitro zu unterstützen. Diese neuartige organotypischen Modellsystem in Kombination mit retroviralen vermittelte Genexpression bietet ein wertvolles Werkzeug für die schnelle Analyse von Genfunktionen in vitro ohne die Notwendigkeit costly und zeitaufwendige Erzeugung transgener Tiere.

Organoide bereit zu spalten, wenn die zentrale Lumen durch das Vorhandensein von toten Zellen (Figur 2) verdunkelt werden. Nach 2-3 Tagen der Vorbehandlung Organoide sollte eine runde zystische Morphologie (Abbildung 3) erlassen. Dies erhöht die Anzahl von Stammzellen, die Verbesserung der Aussichten auf stabile Integration. Die Größe des viralen Pellet nach Zentrifugation des viralen Überstand aufgrund der unterschiedlichen Beitrag der Zelltrümmer auf die Pelletgröße zu variieren, wahrscheinlich. Keine klare Korrelation zu Transduktionseffizienz wurde beobachtet. Während des Auswahlverfahrens nicht-transduzierten Organoide sterben wird, während die, die mit einem stabilen Integration wird bleiben. Das fluoreszierende Protein von MSCV-eGFP-Retrovirus kann in Zellen überleben Organoiden, die eine cystische Morphologie innerhalb von 2-3 Tagen nach der Transduktion (Abbildung 4) Ursprung beobachtet werden. <img alt<html> = &quot;1&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Abbildung 1 ist eine schematische Zeichnung der retroviralen Transduktion Verfahren. Vor der Infektion Organoide werden vorbehandelt mit ENRWntNic bis sie eine zystische Struktur (Schritt 1) anzunehmen. Platin-E-Zellen werden als Verpackungszelllinie verwendet werden, und kultiviert, bis sie 70-80% Konfluenz erreichen. Danach werden sie mit dem retroviralen Konstrukt mit PEI transfiziert. Viren gibt 2 Tage später (Schritt 2) geerntet. Organoide werden trypsiniert, um Fragmente mit 1-10 Zellen (Schritt 3) zu erhalten, und dann infiziert sind (Schritt 4). Nach spinoculation die Infektionseffizienz (Schritt 5) zu erhöhen, werden die infizierten Organoid Fragmente für positive Klone ausgesät (Schritt 6) und 2-3 Tage später die Auswahl mit stabilen Integration kann (Schritt 7) durchgeführt werden. 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 2. Repräsentatives Bild Organoide nach 4-6 Tagen Kultur. Das Lumen ist mit toten Zellen gefüllt, so dass es zu dunkel erscheinen. Organoide in diesem Stadium sind bereit, agiert werden. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Repräsentative Bild der kleinen Darm Organoide in ENRWntNic Medien für 3-4 Tage kultiviert. Die Organoide nehmen eine zystische Morphologie. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Repräsentative Bild der kleinen Darm Organoide (a), die virale Transgen-Expression (b, eGFP) zu zeigen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Lagerung bei 4 ° C für 4 Wochen </td></tr><tr><td> Erweiterte DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic Medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Lagerung bei 4 ° C für 2 Wochen </td></tr><tr><td> Erweiterte DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> B27 Supplement (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 Zuschlag (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Maus EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Mäuse-Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-Spondin Conditioned Medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a konditionierte Medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Übertragungsmedium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Frisch zubereiten </td></tr><tr><td> ENRWntNic Medium </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polybren (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR-Medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Lagerung bei 4 ° C für 4 Wochen </td></tr><tr><td> Erweiterte DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> B27 Supplement (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 Zuschlag (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein (500 mM) </td><td> 50 ul </td&gt; </tr><tr><td> Maus EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Mäuse-Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-Spondin konditionierte Medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Medien für Platinum-E-Zellen (für 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Lagerung bei 4 ° C für 12 Wochen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449.45 ml </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycin (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Medien Zusammensetzung für Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic Medium, Transduktion Medium, ENR Medium und Medium für Platinum-E-Zellen.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Dieses Protokoll erklärt primären Lgr5-positve Organoid Kultur und die anschließende Leistung der retroviralen Transduktion. Dies ermöglicht Cre-induzierbare Überexpression oder Knockdown der gelieferten Transgen und ermöglicht funktionelle Studien im organotypischen neues in vitro durchgeführt werden Modellsystem.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Aufrufe.  University of Cambridge.  Dieses Protokoll erklärt primären Lgr5-positve Organoid Kultur und die anschließende Leistung der retroviralen Transduktion. Dies ermöglicht Cre-induzierbare Überexpression oder Knockdown der gelieferten Transgen und ermöglicht funktionelle Studien im organotypischen neues in vitro durchgeführt werden Modellsystem. 

Serie: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Forschung

Biologie

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...