This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Synthese von 10 nm Goldnanopartikel (Gold-Nanopartikel) 15 <ol><li> Bereiten Lösung A: 2 ml 1% ige wässrige Goldchlorid in 160 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Bereiten Lösung B: 8 ml 1% Trinatriumcitrat x 2 H 2 O und 160 ul 1% Gerbsäure in 32 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Warm up-Lösung A und B auf 60 ° C und mischen sie unter Rühren. Beachten Sie eine dunkelblaue Farbe sofort. Beachten rot nach ca. 15 min. Dann heizen bis zu 95 ° C, 5 Minuten zu halten und die Lösung auf RT. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen des NP Suspension auf eine kohlenstoffbeschichteten Netz und lassen an der Luft trocknen. Überprüfen Sie die Größe und Morphologie der NPs durch Transmissionselektronenmikroskopie. </li></ol> 2. Beschichtung von Gold-Nanopartikel, die mit BSA und Markierung mit Rhodamin N-Hydroxysuccinimidylester (NHS) 16 <ol><li> Hinzufügen 900 ul NPs in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 15.000 × g für 30 min. Opnational, bereiten mehrere Rohre auf einmal. </li><li> Überstand verwerfen, resuspendieren Sie das Pellet in 900 ul sterilisiert Milli-Q-Wasser und fügen Sie 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, Mischen auf einem Vortex bei 800 Upm für 30 min. </li><li> So entfernen Sie überschüssiges BSA, zentrifugieren Sie das Präparat bei 15.000 · g für 60 min. </li><li> Überstand verwerfen und neu zu suspendieren die Gold-BSA-Nanopartikel in 125 ul PBS, fügen 12,5 ul 1 M Bicarbonat. </li><li> Unmittelbar vor der Anwendung bereiten eine 10 mg / ml-Lösung von Rhodamin NHS / DMSO, fügen Sie 30 ul Rhodamin NHS / DMSO-Lösung des Gold-BSA-Nanopartikel-Suspension 1 ml. Inkubieren Sie die Reaktion für 2 Stunden (oder O / N) bei RT bei 800 Umdrehungen pro Minute Misch, vermeiden Belichtung. </li><li> Reinigung der Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel durch Dialyse gegen PBS bei 4 ° C mit 5 Pufferänderungen über den Zeitraum von 36 bis 48 h. </li><li> Zur Stabilisierung NPs, fügen Sie 10 ul der 200 mg / ml BSA / PBS in jeden 1 ml Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Um die freien oder frei BSA-Rhodamin, Zentrifuge bei 15 zu entfernen,000 × g für 60 min. Das Pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, messen OD 520, und bei 4 ° C, vermeiden Belichtung. </li><li> Verdünnen Sie die NPs 10 mal mit Milli-Q bzw. doppelt destilliertes Wasser, einen Tropfen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter, und lassen Sie sie an der Luft trocknen lassen. Prüfen Größe und Morphologie der Nanopartikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Hinweis: alle für NP Herstellung verwendeten Materialien wurden sterilisiert und der Vorgang wurde in einem Zellkulturhaube oder auf einer Bank neben einer Flamme durchgeführt. </li></ol> 3. Kultur von HeLa-Zellen <ol><li> HeLa Zellen LAMP1-GFP exprimieren, sind dauerhaft in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5% CO 2 gezüchtet. </li><li> Samen, die Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Vertiefung in einem 8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi) und Inkubation O / N. </li></ol> 4. Kultur von Bakterien <ol><li> Verwenden Salmonella enterica Serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-Typ (WT) Belastung. Zum Vergleich verwenden Mutantenstämmen Δ ssaV im SPI2-T3SS und Δ SIFA defekt fehlt Schlüssel Effektor SIFA für SIF. Verwenden Stämme Plasmid pFPV25.1 für konstitutive Expression verstärkt GFP. HINWEIS: Die Bakterienstämme sind routinemßig gezüchtet in Luria-Bertani-Brühe (LB), mit Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin (WT) und LB unter Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin und / oder 50 &amp; mgr; g / ml Kanamycin (Δ ssaV, Δ Şifa ) der erforderlich ist, um Plasmide zu erhalten. </li><li> Impfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB mit geeigneten Antibiotika und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen für die Belüftung, dann verdünnen 01.31 in frischem LB und das Wachstum weiterhin 3,5 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt, erreichen die Kulturen der späten log-Phase und Bakterien sehr invasiv. A &#39;Bandage &quot;ist bequem, Reagenzglas Kulturen mit Belüftung inkubiert. </li></ol> 5. Die Infektion von HeLa-Zellen durchSalmonellen and Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel Pulse Chase-Kennzeichnung (siehe Abbildung 1 für Schema) <ol><li> Messen OD 600 der Unter kultivierten Bakterien und verdünnt in 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml) OD 600 = 0,2, fügen geeignete Mengen von Bakterien an HeLa-Zellen in 8-Well-Kammerobjektträgern, eine Vielzahl von zu erzielen Infektion (MOI) von 100. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten in der Zelle Inkubator, waschen 3 Mal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen (dieser Zeitpunkt wurde als 0 Stunden nach der Infektion oder 0 h pi festgelegt). Werden 300 ml frisches Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin und aufrechtzuerhalten für 1 h. Dann ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit. </li><li> Nach Inkubation mit Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin für 1 h wird das Medium durch Abbilden Medium ersetzt (Eagles MEM ohne FCS, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumbicarbonat, mit 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml Gentamicin. Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel werden in HeLa-Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von OD 520 = 0,1 erhalten. HINWEIS: Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel können auch auf Zellen vor der Infektion, oder zu verschiedenen Zeitpunkten zugegeben werden pi </li><li> Nach 1 h Inkubation Entfernen des Mediums, Waschen 3x mit PBS, und 300 ml frisches Bilderzeugungsmedium, enthaltend 10% FCS und 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit. HINWEIS: Dauer der Inkubationszeit kann je nach Konzentration von Nanopartikeln und Zelllinien variieren. Für Makrophagen RAW264.7 beobachteten wir, dass 30 min Inkubation mit Nanopartikeln in einer Konzentration von OD 520 = 0,05 erhalten ausreichend Internalisierung. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems, wie einem konfokalen Laser-Scanning (CLSM) oder Spinnscheibe (SD) Mikroskop mit einer feuchten Umgebung Kammer hochauflösende Abbildung zu unterschiedlichen Zeitpunkten. </li><li> Schalten Sie den Temperatur control System und warten, bis er stabil ist. Optimieren Sie die Bildeinstellungen, wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stapel usw. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions Einstellungen für GFP und Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Aus diesem Protokoll, mit einem 400 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 512 x 512 Bildpunkten und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Erregt GFP und Gold-BSA-Rhodamin Verwendung eines Ar-Lasers (488 nm) und einen HeNe-Laser (543 nm) sind. Fügen Sie eine Hellfeld (BF) Kanal für die Beobachtung der Form der Zellen. Bei anderen Mikroskopsystemen und Infektionsbedingungen die Einstellung muss entsprechend angepasst werden. HINWEIS: Die gleichen Ar-Laser als die Lichtquelle der BF Kanal und Signal wurde mit einem Photomultiplier (PMT) Detektor erfaßt. </li><li> Bei der angegebenen Zeitpunkten pi, montieren Sie die 8-Well-Kammer-Objektträgern, die infizierten Zellen auf dem Mikroskoptisch und speichern. </li></ol> 7. Analyse der Bilder <ol><li> Verwenden Mikroskopie Bildanalyse-Software (siehe <strong&gt; Materialien und Geräte der Tabelle), um den Umbau des Endo-lysosomalen System durch intrazelluläre Salmonellen zu untersuchen. Öffnen Sie die Daten, indem Sie auf &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie die Datei. HINWEIS: Alternativ können Open-Source-Softwarepakete wie ImageJ oder FIJI quantitative Bildanalysen verwendet werden. </li><li> In der Symbolleiste Objekte des auf das Icon Surpass Sicht <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> um eine neue Oberfläche Artikel hinzuzufügen. Klicken Sie auf <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Nächster). </li><li> So analysieren Sie eine Region of Interest (ROI), wählen Sie Segment ein ROI. In einer Bildfläche wird ein Rechteck umrandeten Abschnitt Bild überlagert, die den ROI. Geben Sie die Werte in der entsprechenden x-, y- und z-Felder, oder klicken Sie direkt auf die Pfeile in der Vorschau Rechteck, um Größe und Position der ROI ändern. Klicken Sie dann auf <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (Next). </li><li> Als Quellkanal, wählen Sie Kanal 3 (Signal for Gold-BSA-Rhodamin NPs). Überprüfen Sie die glatte Option zum Einrichten der Glätte der resultierenden Fläche. Wert manuell festlegen oder den automatisch generierten Wert zu übernehmen. Für Threshold, wählen Sie die Option Absolute Intensität. </li><li> Für die Schwelleneinstellung, wählen Sie die manuelle Option wählen und Wert. Im Anzeigebereich wird eine Oberflächengrenze Vorschau grau dargestellt. </li><li> Auf der Registerkarte Classify Oberflächen können die resultierende Oberfläche nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist &quot;Anzahl der Voxel&gt; 10 &#39;und andere Filter können auch durch Klicken auf&quot; Hinzufügen &quot;aufgenommen werden. Wenn eine Filterung nicht notwendig ist, dann alle Filter zu löschen, indem Sie auf die Schaltfläche Löschen. Klicken <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Nächster). </li><li> Um Oberflächen Erstellung abzuschließen, klicken Sie auf/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Fertig stellen). In der Liste Objekt jetzt deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Element Volume und erstellt neue Oberfläche in Sichtbereich angezeigt. </li><li> Exportieren Sie die Statistiken. Jetzt, in der Surpass Ansicht die Farbe der Themen variieren von violett bis rot nach ihrem Bereich. Und die &quot;Plot Zahlen Raums&quot; Tabelle zeigt die Statistikinformationen (zB ID-Nummer und Fläche von Objekten). Exportieren Sie alle Statistiken der Oberfläche 1 in eine Excel-Datei durch Klick <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (Speichern). </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation 17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in ze...

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten 1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität 3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Nanopartikel durch Elektronenmikroskopie (EM) zu sehen, ihre Verwendung zur korrelierten mikroskopische Analyse, die Kombination von Live-Cell-Tracking mit Lichtmikroskopie (LM) und eine höhere Auflösung bei ultrastruktureller Ebene mit EM 5 ermöglicht die Erleichterung. So wurden beispielsweise Gold-Nanopartikel lange Zeit effizient als Biosensoren in lebenden Zellen für empfindliche Diagnose sowie auf dem Gebiet der Immunmarkierung 6 verwendet wurde. Neueste sTUDIEN zeigen, dass Gold-Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe und Form kann leicht sein, die Aufnahme durch eine Vielzahl von Zelllinien und routinemäßig durch den endosomalen Weg zu transportieren, daher haben ein großes Potenzial für die intrazelluläre Vesikel Befinden Transportverfolgung und der endo-lysosomalen System Kennzeichnung angewandt 7,8 . Mikrobiellen Krankheitserregern wie Salmonella enterica, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes, wurden verschiedene Mechanismen entwickelt, um nicht-phagozytischen Wirtszellen 9 einzudringen. Nachdem sie verinnerlicht, die Erreger entweder im Cytosol lokalisiert oder in membrangebundene Kompartimente abgesondert, interagieren intensiv mit ihrer Host-Umgebungen und moduliert diese auf ihr eigenes Überleben 10 begünstigen. Zum Beispiel befindet sich Salmonella enterica und repliziert in ein intrazelluläres phagosomalen Raum bezeichnet die Salmonellen-haltigen Vakuole (SCV) nach Infektion 11. Die Reifung SCVVerkehre zu den Golgi-Apparat, das fortlaufend Wechselwirkungen mit dem endocytischen und induziert die Bildung von ausgedehnten röhrenförmige Strukturen, wie Salmon -induzierte Filamente (SIF), Sortierung nexin Tubuli, Salmon -induzierte sekretorischen Trägermembranprotein 3 (SCAMP3) Tubuli, usw. . 12-14. Studium, wie diese bakterielle Erreger manipulieren Wirtszellsignalwege ist wesentlich für das Verständnis von Infektionskrankheiten. Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System kennzeichnen, und der menschlichen Magen-Erreger Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Salmonella) wurde als Modellbakterium verwendet, um die Wechselwirkungen des Erregers mit dem Studium Gastgeber endocytischen. Intrazellulären Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel in nichtinfizierten Zellen und Zellen, die mit WT oder Mutante Salmonella-Stämmen infiziert wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) abgebildet.Dann wurde Imaris Software verwendet, um die Verteilung von Nanopartikeln zu quantifizieren, was anzeigt, daß Salmonella-Infektion induzierten extreme Umlagerung der Endosomen / Lysosomen. Nach der Beschreibung dieser Methode kann analoge Experimente entwickelt, um langfristige Schicksal der internalisierten NPs zu verfolgen und um den Einfluss der verschiedenen exogenen Substanzen oder endogenen Faktoren auf die endocytischen von eukaryontischen Zellen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.

Gold-Nanopartikel wurden durch ein gut etabliertes Verfahren durch Reduktion von Chlorwasserstoffsäure von Citrat und Gerbsäure erzeugt. Wie in 2A gezeigt, waren die synthetisierten NPs quasi-kugelförmiger Gestalt mit einer Größe von etwa 10 nm. BSA-Beschichtung und Rhodamin-Markierung nicht beeinflussen die Morphologie und Größe (2B). Es wurde berichtet, dass die Gold-Nanopartikel können leicht von verschiedenen Säugerzellen aufgenommen und am Ende...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  Universität Osnabrück.  Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt. 

Serie: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

Entwicklung eines wirtschaftlich DNA Delivery System von „Acufection“ und seine Anwendung auf die Hautforschung

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic purposes. However, the visualization and quantification of multiple antigens in a single tissue section using conventional chromogenic IHC is challenging. Multiplexed imaging is especially relevant in lymphoma research and diagnostics, where markers have to be interpreted in the context of a complex tumor microenvironment. Here we describe a protocol for multiplexed fluorescent IHC staining to enable the quantitative assessment of multiple targets in specific cell types of interest in lymphoma.The method covers aspects of antibody validation, antibody optimization, the multiplex optimization with markers of lymphoma subtypes, the staining of tissue microarray (TMA) slides, and the scanning of the slides, followed by data analysis, with specific reference to lymphoma. Using this method, scores for both the mean intensity of a marker of interest and the percentage positivity are generated to facilitate further quantitative analysis. Multiplexing minimizes sample utilization and provides spatial information for each marker of interest.

Here we describe a protocol for multiplex fluorescent immunohistochemical staining and imaging for the simultaneous localization of multiple cancer-associated antigens in lymphoma. This protocol can be extended to the colocalization analysis of biomarkers within all tissue sections.

Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

Modelle der murinen vaginalen Besiedlung durch anaerob gezüchtete Bakterien

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...