Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
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Wir danken Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, jetzige Zugehörigkeit: Novartis Institute for Biomedical Research) für die Entwicklung dieser Analyse und Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara und Dongsook Kim für ihre kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden mit der Genehmigung des Tsukuba Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) durchgeführt. 1. Dissektion <ol><li> Zur Vorbereitung embryonalen Tag 13-14 ICR oder C57BL / 6 Föten, euthanisieren schwangere Mäuse durch zervikale Versetzung. Entfernen Sie den Uterus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Spülen Sie es gut, um das Blut zu entfernen. </li><li> Mit Pinzette, übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit 70% Ethanol zu sterilisieren. </li><li> Übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie die Föten aus dem Uterus mit sterilisierten Sezierzangen und chirurgischen Scheren. </li><li> Entschlüsseln Sie die Föten mit chirurgischen Scheren. Legen Sie sie in eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Entfernen Sie die Haut und den Schädel und nehmen Sie die Gehirne mit sterilisierter Sezierzange heraus. Setzen Sie sie in eine Petrischale mit HBSS. HINWEIS: Von diesem Schritt an ist es am besten, das Verfahren auf einem sauberen durchzuführenBank. </li><li> Entfernen Sie die Meninges mit sterilisierter Sezierzange unter einem Stereomikroskop. Schneide die Basalganglien, Hippocampus und Kleinhirn mit Pinzette ab. Mit gebogenen Pinzetten, übertragen Sie die Cortices auf eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Sammeln Sie alle Cortices mit einer Einweg-Tropfmaschine oder einer 25-ml-Pipette. Setzen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und entfernen Sie dann die HBSS durch Pipettieren. </li><li> Füge 3 ml der zerebralen kortikalen Enzymlösung zu dem Röhrchen hinzu, das die Cortices enthält. Setzen Sie diese Röhre in ein Wasserbad und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturenzyms, bestehend aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA. Sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. </li><li> Fügen Sie weitere 3 ml zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen hinzu, das die Kortizes enthält, und bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 5 min inkubieren. </li><li> Entfernen Sie die zerebrale kortikale Enzymlösung mit einer 5-ml-Pipette und fügen Sie 5 ml Dulbe hinzuCco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Dissoziieren Sie die Cortices durch sanftes Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette mit einer sterilen P1000-Spitze. Mit einer 5-ml-Pipette mit einer P200-Spitze erneut pipettieren. </li><li> Setzen Sie ein 40 μm Nylon-Zellsieb auf ein 50 mL-Röhrchen und filtrieren Sie die Suspension, um den Schmutz zu entfernen. </li><li> Bei 420 xg für 5 min bei RT zentrifugieren und dann das DMEM-Medium entfernen. </li><li> Fügen Sie 5 ml zerebrales kortikales Kulturmedium hinzu und lassen Sie das Zellpellet vorsichtig resuspendieren. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturmediums, bestehend aus Neuron-Basalmedium, ergänzt mit 1x B-27 Ergänzungen, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und stellen Sie die Zellkonzentration (wie gewünscht) mit dem zerebralen kortikalen Kulturmedium ein. </li><li> Tafel 3,0 × 10 6 kortikale Neuronen in 2,0 ml pro beschichtetem 35 mm Glasboden. HINWEIS: Vor dem Überziehen, beschichten35mmm Glasboden mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid (PDL) oder 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubieren für 3 h - O / N bei 37 ° C und Waschen mit PBS mindestens 3x. </li></ol> 2. Imaging Vesicle Motility <ol><li> Bereiten Sie die Plasmide, die jede Art von Vesikel zu etikettieren. Verwenden Sie zum Beispiel EGFP-Rab5 für frühe Endosomen, EGFP-Rab7 für späte Endosomen, LAMP-EGFP für Lysosomen und EGFP-LC3 für Autophagosomen 8 , 13 . HINWEIS: Diese Plasmide sind auf Anfrage von tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp erhältlich. Typischerweise können 3 -5 Tage in vitro (DIV) Neuronen mit diesen Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien transfiziert werden. </li><li> Mischen Sie 4,0 μg Plasmide mit 200 μl serumfreiem Medium durch Pipettieren. In einem separaten Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien ) in 200 μl serumfreies Medium verdünnen . 5 min bei RT inkubieren. </li><li> Mischen Sie die Plasmidlösung und die Transfektionsregentlösung in Schritt 2.2 durch Pipettieren. Inkubieren für 20 min bei RT. </li><li> Fügen Sie serumfreies Medium und 400 μl der Plasmidlösung aus Schritt 2.3 zu jeder beschichteten Glasbodenschale hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 30 min. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml zerebrales kortikales Kulturmedium. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 1-2 Tage. </li><li> Nach 1 - 2 d Transfektion wählen Sie die transfizierten Zellen zur Bildaufnahme aus. HINWEIS: Vorzeitige Neuronen weniger als 7 DIV neigen dazu, dynamische Vesikelmotilität zu zeigen. Wählen Sie Neuronen aus, die die Fluoreszenzsonde mäßig exprimieren, da keine klare Bilder erhalten werden können, wenn ein hochexprimierendes Neuron ausgewählt wird. Wählen Sie auch eine typische neuronale Form, wie zyramidenförmige Neuronen, die lange Axone und komplizierte Dendriten aufweisen, um die Identifizierung des Axons und der Dendriten zu erleichtern (siehe Abbildung 1A)). </li><li> Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem: Für die Bildgebung, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Charge-Coupled Device (CCD) Kamera mit 40X Plan Apo 0.95NA oder 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv Linsen ausgestattet. Kontrollieren Sie die Temperatur bei 37 ° C mit einem Inkubationssystem. Erwerben Sie Neuronenbilder an einem Rahmen / 5 s über einen Zeitraum von 100 s, der von der Bilderfassungssoftware gesteuert wird. Alternativ können Bilder in kürzeren Intervallen und für längere Zeiträume, wie z. B. bei einem Rahmen pro 2 s über einen Zeitraum von 300 s, aufgenommen werden. HINWEIS: Für die Aufnahme von aufeinanderfolgenden Bildern stehen viele Anwendungen zur Verfügung, von denen viele für diese Methode geeignet sind. Daher wird keine besondere Anwendung empfohlen; Vielmehr sollte jeder Forscher verwenden, welche Anwendung verfügbar ist. </li></ol> 3. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie alle aufeinanderfolgenden Bilder in der ImageJ Software mit manueller Tracking 14 . HINWEIS: Bisher war das manuelle Tracking mit wiDie in den Verfolgungsversuchen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 verwendet wurden . Manuelles Tracking wurde von Dr. Fabrice Cordelières entwickelt. Detaillierte schriftliche Anweisungen sind online verfügbar 20 . Für die Analyse wird die Qualität der Bilddaten mit einer ausreichenden Anzahl von Bildern verbessert. Es wird empfohlen, mehr als 20 Bilder zu verwenden. </li><li> Um die sequentiellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie &lt;Bild&gt; → &lt;Stapel&gt; → &lt;Bilder zum Stapeln&gt;. Klicken Sie auf &lt;OK&gt;. </li><li> Wählen Sie &lt;Plugins&gt; → &lt;Manual Tracking&gt;; Ein Tracking-Fenster wird auftauchen. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen &lt;Parameter anzeigen&gt; und definieren Sie die Verfolgungsparameter im Parameterbereich. HINWEIS: Es können mehrere Parameter eingestellt werden, einschließlich Zeitintervall, x / y-Kalibrierung, z-Kalibrierung, Suchquadratgröße für MitteIng, Punktgröße, Linienbreite und Schriftgröße. In diesem vereinfachten Assay wurden sowohl das Zeitintervall als auch die x / y-Kalibrierung definiert. Unter anderen experimentellen Umständen kann es notwendig sein, auch andere Parameter zu definieren. Die hier verwendeten Parameter sind wie folgt: Das &lt;Zeitintervall&gt; ist 5 s und die &lt;x / y-Kalibrierung&gt; ist entweder 0,2662 μm für eine 40X Plan Apo 0,95NA Objektiv oder 0,10657 μm für einen 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektivlinse. </li><li> Nachdem die Parameter definiert sind, klicken Sie auf &lt;add Track&gt;, um einen neuen Track zu starten. </li><li> Nach der Bestimmung der Vesikel von Interesse ( z. B. die Vesikel , die durch blaue und rote Pfeilspitzen in Abbildung 1A (rechte Seite) angezeigt werden, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequentiellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Die Ergebnisse der aufgezeichneten xy-Koordinaten, Entfernung und Geschwindigkeit erscheinen in einem neuen Fenster. HINWEIS: Im Falle von Lysosomen werden große helle Fluoreszenzsignale ( z. B. AbbUre 1A (rechte Tafel), orange Pfeilspitze) werden oft in Neuronen beobachtet. Da diese Signale gelegentlich entweder akkumulierte Vesikel oder pathologische Variationen aufweisen, sollten diese Signale zur Quantifizierung der Motilität vermieden werden. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6, um die xy-Koordinaten der Vesikel aus allen sequentiellen Bildern zu sammeln; Jedes Bild wechselt automatisch zum aufeinanderfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt ist. </li><li> Exportieren Sie diese Daten in eine neue Tabelle ( zB eine Tabellenkalkulation). Verwenden Sie eine entsprechende Software, um einen geeigneten Graphen zu erstellen (siehe Tabelle der Materialien ). HINWEIS: Um die Daten zu analysieren, wählen Sie die Spalte &lt;Abstand&gt;, summieren alle Werte dieser Spalte und zeigen einen Motilitätsabstand als Balkendiagramm wie in Abbildung 1B . Zusätzlich wiederholen Sie diesen Schritt, berechnen Sie den Durchschnitt des gesamten Motilitätsabstandes und zeigen Sie als Balkendiagramm wie in Abbildung 1C . Die Software zur Erstellung eines Balkendiagramms und Wellenformdaten wird angezeigtDie Tabelle der Materialien. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll führt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Vesikelmotilität ein. In primären Neuronen, Endosomen und Lysosomen neigen dazu, hohe Motilität in jüngeren Neuronen (4-6 DIV) zu zeigen. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen einige Komponenten an die Vorderkanten liefern müssen, um neuronale Prozesse zu verlängern, sollte der Membranhandel in diesem Stadium dynamisch auftreten. So ist es wichtig, jüngere Neuronen zu verwenden, um die dynamische Motilität in neuronalen Dendriten zu beobachten. ...

Die präzise Kontrolle des Endosom-Lysosomen-Traffickings ist für die Regulierung der neuronalen Funktion unentbehrlich. Bemerkenswerterweise sind die dynamischen Bewegungen dieser Vesikel ein Schlüsselfaktor für die Regulierung der neuronalen Morphologie, der Entwicklung und des Überlebens. Defekte in diesem System verursachen schwere neuronale Störungen 1 , 2 . Die molekularen Mechanismen, die den Vesikelhandel mit neuronalen Erkrankungen verknüpfen, gelten als kompliziert, und mehrere Gruppen haben versucht, diese Relevanz zu untersuchen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die gestörte späte Endosom-Motilität signifikant mit der Niemann-Pick-C-Krankheit 3 assoziiert ist, einer erblichen neurodegenerativen Störung, die durch Lysosomendefekte verursacht wird. Ein weiteres Beispiel ist eine Mutation in einem lysosomalen Ca 2+ -Kanal, trpml 1, der die lysosomale Motilität beeinträchtigt, was zu lysosomalen Speicherkrankheiten 4 , 5 , </Sup&gt; 6 Unsere Gruppe hat berichtet, dass die Dysregulation des PtdIns (3,5) P 2 Umsatzes die Endosom- und Lysosommotilität in Neuronen unterdrückt, was zu einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber der Stressreaktion 7 , 8 führt . Die metabolische Regulation von PtdIns (3,5) P 2 , die sich meist auf späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert, spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Funktionen, darunter Vesikelhandels- und Fusionsspaltungsverfahren 9 , 10 . Da beeinträchtigte PtdIns (3,5) P 2 -Verwender eine schwere Neurodegeneration 11 , 12 verursachen , könnte die abweichende Regulation der Endosom-Lysosom-Motilität ein Schlüsselfaktor für das Verständnis der Pathogenese der Neurodegeneration sein. Eine Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Vesikelmotilität zugrunde liegen, kann so vielversprechende Hinweise liefern, die unsere Ungerechtigkeit vertiefen könnenVerständnis von mehreren neuronalen Störungen. In dieser Arbeit stellen wir eine wertvolle Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen mit einem kostenlosen Softwarepaket namens Manual Tracking vor. Ziel war es, eine schnelle Quantifizierungsmethode zur Analyse der Vesikelmotilität zu entwickeln. Diese Quantifizierung wird durch einen Standardansatz des Klickens auf einen Referenzpunkt in jedem Rahmen eines Zeitrafferfilms gelenkt. Die Verwendung der manuellen Tracking-Software macht diesen Ansatz im Gegensatz zu anderen Anwendungen ganz einfach und von weitem Nutzen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch auf andere Zellen, wie Gliazellen, anwendbar. Obwohl diese Methode primitiv ist, kann sie auf verschiedene Analysen angewendet werden, einschließlich der zellulären Motilität und der morphologischen Veränderung. Beispielsweise können nach der Definition eines Referenzpunktes über eine Sequenz von Bildern Informationen über die Positionen der Referenzpunkte und die Zeit an jeder Position aus sequentiellen Bildern unter Verwendung von Datenanalyse und Bildverarbeitung weich extrahiert werdenWare. Zusammengenommen ist diese Methode einfach, aber leistungsfähig und trägt zur Entwicklung einer verbesserten Effizienz in Studien auf der Grundlage von Membran-Trafficking, wie die untersucht Endosom-Lysosom-Funktion.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td>Serum free medium</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin Streptmycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplements</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine &quot;Max&quot; (PEI)</td><td>polysciences</td><td>24765</td><td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/mL Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td></tr><tr><td>BIOREVO BZ-9000</td><td>Keyence</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubation system INUG2-K13</td><td>Tokay Hit</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism version 6.0</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Excel version 15</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ verion 1.47</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

Im Gehirn spielen Membran-Trafficking-Systeme eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Funktionen wie neuronaler Morphologie, synaptischer Plastizität, Überleben und Glia-Kommunikation. Bisher haben zahlreiche Studien berichtet, dass Defekte in diesen Systemen verschiedene neuronale Erkrankungen verursachen. So kann das Verständnis der Mechanismen, die der Vesikeldynamik zugrunde liegen, einflussreiche Hinweise liefern, die bei der Behandlung von mehreren neuronalen Störungen helfen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Vesikelmotazitäten, wie Motilitätsabstand und Bewegungsgeschwindigkeit, mit einem Software-Plug-In für die ImageJ-Plattform. Um Bilder zur Quantifizierung zu erhalten, markierten wir neuronale Endosom-Lysosomenstrukturen mit EGFP-markierten Vesikelmarkerproteinen und beobachteten die Bewegung von Vesikeln mit einer Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ist sehr nützlich und vereinfacht die Messung der Vesikelmotilität in Neuriten wie Axonen und Dendriten sowie im Soma von Neuronen und Gliazellen. WeiterDiese Methode kann auf andere Zelllinien, wie Fibroblasten und Endothelzellen, angewendet werden. Dieser Ansatz könnte einen wertvollen Fortschritt für unser Verständnis des Membranhandels darstellen.

Dieser Assay wurde entwickelt, um die Vesikeldynamik in der in vitro Kultur zu messen. Dieser Assay wurde verwendet, um die Vesikelmotilität zu bestimmen, die mit der neuronalen Morphologie und dem Überleben assoziiert ist. Abbildung 1A und B zeigen repräsentative Daten, die die Lysosomenmotilität in Neuronen zeigen. Kortikale Neuronen wurden mit dem Lysosommarker, LAMP-EGFP, transfiziert und unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzmikros...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

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JoVE Journal

Neuroscience

8.0K Aufrufe.  University of Tsukuba.  Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann. 

Serie: Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real time and dissecting the different steps of exo-endocytosis at the single-vesicle level are crucial for understanding synaptic functions in health and disease.
Genetically-encoded pH-sensitive probes directly targeted to synaptic vesicles and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) provide the spatio-temporal resolution necessary to follow vesicle dynamics. The evanescent field generated by total internal reflection can only excite fluorophores placed in a thin layer (&#60;150 nm) above the glass cover on which cells adhere, exactly where the processes of exo-endocytosis take place. The resulting high-contrast images are ideally suited for vesicles tracking and quantitative analysis of fusion events.
In this protocol, SH-SY5Y human neuroblastoma cells are proposed as a valuable model for studying neurotransmitter release at the single-vesicle level by TIRFM, because of their flat surface and the presence of dispersed vesicles. The methods for growing SH-SY5Y as adherent cells and for transfecting them with synapto-pHluorin are provided, as well as the technique&#160;to perform TIRFM and imaging. Finally, a strategy aiming to select, count, and analyze fusion events at whole-cell and single-vesicle levels is presented.
To validate the imaging procedure and data analysis approach, the dynamics of pHluorin-tagged vesicles are&#160;analyzed under resting and stimulated (depolarizing potassium concentrations) conditions. Membrane depolarization increases the frequency of fusion events and causes a parallel raise of the net fluorescence signal recorded in whole cell. Single-vesicle analysis reveals modifications of fusion-event behavior (increased peak height and width). These data suggest that potassium depolarization not only induces a massive neurotransmitter release but also modifies the mechanism of vesicle fusion and recycling.
With the appropriate fluorescent probe, this technique can be employed in different cellular systems to dissect the mechanisms of constitutive and stimulated secretion.

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organell-Transport in kultivierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Biologie

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verbesserung der axonalen Transportanalyse in lebenden C. elegans mit GFP-markiertem RAB-3

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. Consequently, loss of axonal transport impairs neuronal growth and function. Studying axonal transport therefore improves our understanding of neuronal cell biology. With recent improvements in CRISPR Cas9 genome editing, endogenous labeling of axonal cargos has become accessible, enabling to move beyond ectopic expression-based visualization of transport. However, endogenous labeling often comes at the cost of low signal intensity and necessitates optimization strategies to obtain robust data. Here, we describe a protocol to optimize the visualization of axonal transport by discussing acquisition parameters and a bleaching approach to improve the signal of endogenous labeled cargo over diffuse cytoplasmic background. We apply our protocol to optimize the visualization of synaptic vesicle precursors (SVPs) labeled by green fluorescent protein (GFP)-tagged RAB-3 to highlight how fine-tuning acquisition parameters can improve the analysis of endogenously labeled axonal cargo in Caenorhabditis elegans (C. elegans).

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortgeschrittene Techniken zur Visualisierung der endogenen axonalen Transportdynamik

The paper describes the optimization of fluorescence microscopy acquisition parameters to visualize the axonal transport of endogenous labeled cargos at single-neuron resolution in a living nematode.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Zusammenfassung

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