Wir danken Dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, jetzige Zugehörigkeit: Novartis Institute for Biomedical Research) für die Entwicklung dieser Analyse und Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara und Dongsook Kim für ihre kritische Lektüre des Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden mit der Genehmigung des Tsukuba Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) durchgeführt. 1. Dissektion <ol><li> Zur Vorbereitung embryonalen Tag 13-14 ICR oder C57BL / 6 Föten, euthanisieren schwangere Mäuse durch zervikale Versetzung. Entfernen Sie den Uterus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Spülen Sie es gut, um das Blut zu entfernen. </li><li> Mit Pinzette, übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit 70% Ethanol zu sterilisieren. </li><li> Übertragen Sie den Uterus auf eine neue Petrischale mit HBSS. Entfernen Sie die Föten aus dem Uterus mit sterilisierten Sezierzangen und chirurgischen Scheren. </li><li> Entschlüsseln Sie die Föten mit chirurgischen Scheren. Legen Sie sie in eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Entfernen Sie die Haut und den Schädel und nehmen Sie die Gehirne mit sterilisierter Sezierzange heraus. Setzen Sie sie in eine Petrischale mit HBSS. HINWEIS: Von diesem Schritt an ist es am besten, das Verfahren auf einem sauberen durchzuführenBank. </li><li> Entfernen Sie die Meninges mit sterilisierter Sezierzange unter einem Stereomikroskop. Schneide die Basalganglien, Hippocampus und Kleinhirn mit Pinzette ab. Mit gebogenen Pinzetten, übertragen Sie die Cortices auf eine neue Petrischale mit HBSS. </li><li> Sammeln Sie alle Cortices mit einer Einweg-Tropfmaschine oder einer 25-ml-Pipette. Setzen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und entfernen Sie dann die HBSS durch Pipettieren. </li><li> Füge 3 ml der zerebralen kortikalen Enzymlösung zu dem Röhrchen hinzu, das die Cortices enthält. Setzen Sie diese Röhre in ein Wasserbad und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturenzyms, bestehend aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,25% Trypsin und 1 mM EDTA. Sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. </li><li> Fügen Sie weitere 3 ml zerebrale kortikale Enzymlösung in das Röhrchen hinzu, das die Kortizes enthält, und bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 5 min inkubieren. </li><li> Entfernen Sie die zerebrale kortikale Enzymlösung mit einer 5-ml-Pipette und fügen Sie 5 ml Dulbe hinzuCco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Dissoziieren Sie die Cortices durch sanftes Pipettieren auf und ab mit einer 5-ml-Pipette mit einer sterilen P1000-Spitze. Mit einer 5-ml-Pipette mit einer P200-Spitze erneut pipettieren. </li><li> Setzen Sie ein 40 μm Nylon-Zellsieb auf ein 50 mL-Röhrchen und filtrieren Sie die Suspension, um den Schmutz zu entfernen. </li><li> Bei 420 xg für 5 min bei RT zentrifugieren und dann das DMEM-Medium entfernen. </li><li> Fügen Sie 5 ml zerebrales kortikales Kulturmedium hinzu und lassen Sie das Zellpellet vorsichtig resuspendieren. ANMERKUNG: Vorbereiten eines zerebralen kortikalen Kulturmediums, bestehend aus Neuron-Basalmedium, ergänzt mit 1x B-27 Ergänzungen, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und stellen Sie die Zellkonzentration (wie gewünscht) mit dem zerebralen kortikalen Kulturmedium ein. </li><li> Tafel 3,0 × 10 6 kortikale Neuronen in 2,0 ml pro beschichtetem 35 mm Glasboden. HINWEIS: Vor dem Überziehen, beschichten35mmm Glasboden mit 0,1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid (PDL) oder 0,01% Poly-L-Ornithin (PLO). Inkubieren für 3 h - O / N bei 37 ° C und Waschen mit PBS mindestens 3x. </li></ol> 2. Imaging Vesicle Motility <ol><li> Bereiten Sie die Plasmide, die jede Art von Vesikel zu etikettieren. Verwenden Sie zum Beispiel EGFP-Rab5 für frühe Endosomen, EGFP-Rab7 für späte Endosomen, LAMP-EGFP für Lysosomen und EGFP-LC3 für Autophagosomen 8 , 13 . HINWEIS: Diese Plasmide sind auf Anfrage von tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp erhältlich. Typischerweise können 3 -5 Tage in vitro (DIV) Neuronen mit diesen Plasmiden unter Verwendung von Transfektionsreagenzien transfiziert werden. </li><li> Mischen Sie 4,0 μg Plasmide mit 200 μl serumfreiem Medium durch Pipettieren. In einem separaten Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien ) in 200 μl serumfreies Medium verdünnen . 5 min bei RT inkubieren. </li><li> Mischen Sie die Plasmidlösung und die Transfektionsregentlösung in Schritt 2.2 durch Pipettieren. Inkubieren für 20 min bei RT. </li><li> Fügen Sie serumfreies Medium und 400 μl der Plasmidlösung aus Schritt 2.3 zu jeder beschichteten Glasbodenschale hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 30 min. Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml zerebrales kortikales Kulturmedium. Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator für 1-2 Tage. </li><li> Nach 1 - 2 d Transfektion wählen Sie die transfizierten Zellen zur Bildaufnahme aus. HINWEIS: Vorzeitige Neuronen weniger als 7 DIV neigen dazu, dynamische Vesikelmotilität zu zeigen. Wählen Sie Neuronen aus, die die Fluoreszenzsonde mäßig exprimieren, da keine klare Bilder erhalten werden können, wenn ein hochexprimierendes Neuron ausgewählt wird. Wählen Sie auch eine typische neuronale Form, wie zyramidenförmige Neuronen, die lange Axone und komplizierte Dendriten aufweisen, um die Identifizierung des Axons und der Dendriten zu erleichtern (siehe Abbildung 1A)). </li><li> Bildaufnahme mit einem Zeitraffer-Bildgebungssystem: Für die Bildgebung, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Charge-Coupled Device (CCD) Kamera mit 40X Plan Apo 0.95NA oder 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektiv Linsen ausgestattet. Kontrollieren Sie die Temperatur bei 37 ° C mit einem Inkubationssystem. Erwerben Sie Neuronenbilder an einem Rahmen / 5 s über einen Zeitraum von 100 s, der von der Bilderfassungssoftware gesteuert wird. Alternativ können Bilder in kürzeren Intervallen und für längere Zeiträume, wie z. B. bei einem Rahmen pro 2 s über einen Zeitraum von 300 s, aufgenommen werden. HINWEIS: Für die Aufnahme von aufeinanderfolgenden Bildern stehen viele Anwendungen zur Verfügung, von denen viele für diese Methode geeignet sind. Daher wird keine besondere Anwendung empfohlen; Vielmehr sollte jeder Forscher verwenden, welche Anwendung verfügbar ist. </li></ol> 3. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie alle aufeinanderfolgenden Bilder in der ImageJ Software mit manueller Tracking 14 . HINWEIS: Bisher war das manuelle Tracking mit wiDie in den Verfolgungsversuchen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 verwendet wurden . Manuelles Tracking wurde von Dr. Fabrice Cordelières entwickelt. Detaillierte schriftliche Anweisungen sind online verfügbar 20 . Für die Analyse wird die Qualität der Bilddaten mit einer ausreichenden Anzahl von Bildern verbessert. Es wird empfohlen, mehr als 20 Bilder zu verwenden. </li><li> Um die sequentiellen Bilder zu kombinieren, wählen Sie &lt;Bild&gt; → &lt;Stapel&gt; → &lt;Bilder zum Stapeln&gt;. Klicken Sie auf &lt;OK&gt;. </li><li> Wählen Sie &lt;Plugins&gt; → &lt;Manual Tracking&gt;; Ein Tracking-Fenster wird auftauchen. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen &lt;Parameter anzeigen&gt; und definieren Sie die Verfolgungsparameter im Parameterbereich. HINWEIS: Es können mehrere Parameter eingestellt werden, einschließlich Zeitintervall, x / y-Kalibrierung, z-Kalibrierung, Suchquadratgröße für MitteIng, Punktgröße, Linienbreite und Schriftgröße. In diesem vereinfachten Assay wurden sowohl das Zeitintervall als auch die x / y-Kalibrierung definiert. Unter anderen experimentellen Umständen kann es notwendig sein, auch andere Parameter zu definieren. Die hier verwendeten Parameter sind wie folgt: Das &lt;Zeitintervall&gt; ist 5 s und die &lt;x / y-Kalibrierung&gt; ist entweder 0,2662 μm für eine 40X Plan Apo 0,95NA Objektiv oder 0,10657 μm für einen 100X Plan Apo VC NA1.4 Objektivlinse. </li><li> Nachdem die Parameter definiert sind, klicken Sie auf &lt;add Track&gt;, um einen neuen Track zu starten. </li><li> Nach der Bestimmung der Vesikel von Interesse ( z. B. die Vesikel , die durch blaue und rote Pfeilspitzen in Abbildung 1A (rechte Seite) angezeigt werden, klicken Sie auf die Mitte der Signale in den sequentiellen Bildern, um die xy-Koordinaten aufzuzeichnen. Die Ergebnisse der aufgezeichneten xy-Koordinaten, Entfernung und Geschwindigkeit erscheinen in einem neuen Fenster. HINWEIS: Im Falle von Lysosomen werden große helle Fluoreszenzsignale ( z. B. AbbUre 1A (rechte Tafel), orange Pfeilspitze) werden oft in Neuronen beobachtet. Da diese Signale gelegentlich entweder akkumulierte Vesikel oder pathologische Variationen aufweisen, sollten diese Signale zur Quantifizierung der Motilität vermieden werden. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6, um die xy-Koordinaten der Vesikel aus allen sequentiellen Bildern zu sammeln; Jedes Bild wechselt automatisch zum aufeinanderfolgenden Bild, nachdem der Referenzpunkt ausgewählt ist. </li><li> Exportieren Sie diese Daten in eine neue Tabelle ( zB eine Tabellenkalkulation). Verwenden Sie eine entsprechende Software, um einen geeigneten Graphen zu erstellen (siehe Tabelle der Materialien ). HINWEIS: Um die Daten zu analysieren, wählen Sie die Spalte &lt;Abstand&gt;, summieren alle Werte dieser Spalte und zeigen einen Motilitätsabstand als Balkendiagramm wie in Abbildung 1B . Zusätzlich wiederholen Sie diesen Schritt, berechnen Sie den Durchschnitt des gesamten Motilitätsabstandes und zeigen Sie als Balkendiagramm wie in Abbildung 1C . Die Software zur Erstellung eines Balkendiagramms und Wellenformdaten wird angezeigtDie Tabelle der Materialien. </li></ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll führt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Vesikelmotilität ein. In primären Neuronen, Endosomen und Lysosomen neigen dazu, hohe Motilität in jüngeren Neuronen (4-6 DIV) zu zeigen. Angesichts der Tatsache, dass Neuronen einige Komponenten an die Vorderkanten liefern müssen, um neuronale Prozesse zu verlängern, sollte der Membranhandel in diesem Stadium dynamisch auftreten. So ist es wichtig, jüngere Neuronen zu verwenden, um die dynamische Motilität in neuronalen Dendriten zu beobachten. ...

Die präzise Kontrolle des Endosom-Lysosomen-Traffickings ist für die Regulierung der neuronalen Funktion unentbehrlich. Bemerkenswerterweise sind die dynamischen Bewegungen dieser Vesikel ein Schlüsselfaktor für die Regulierung der neuronalen Morphologie, der Entwicklung und des Überlebens. Defekte in diesem System verursachen schwere neuronale Störungen 1 , 2 . Die molekularen Mechanismen, die den Vesikelhandel mit neuronalen Erkrankungen verknüpfen, gelten als kompliziert, und mehrere Gruppen haben versucht, diese Relevanz zu untersuchen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die gestörte späte Endosom-Motilität signifikant mit der Niemann-Pick-C-Krankheit 3 assoziiert ist, einer erblichen neurodegenerativen Störung, die durch Lysosomendefekte verursacht wird. Ein weiteres Beispiel ist eine Mutation in einem lysosomalen Ca 2+ -Kanal, trpml 1, der die lysosomale Motilität beeinträchtigt, was zu lysosomalen Speicherkrankheiten 4 , 5 , </Sup&gt; 6 Unsere Gruppe hat berichtet, dass die Dysregulation des PtdIns (3,5) P 2 Umsatzes die Endosom- und Lysosommotilität in Neuronen unterdrückt, was zu einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber der Stressreaktion 7 , 8 führt . Die metabolische Regulation von PtdIns (3,5) P 2 , die sich meist auf späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert, spielt eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von zellulären Funktionen, darunter Vesikelhandels- und Fusionsspaltungsverfahren 9 , 10 . Da beeinträchtigte PtdIns (3,5) P 2 -Verwender eine schwere Neurodegeneration 11 , 12 verursachen , könnte die abweichende Regulation der Endosom-Lysosom-Motilität ein Schlüsselfaktor für das Verständnis der Pathogenese der Neurodegeneration sein. Eine Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Vesikelmotilität zugrunde liegen, kann so vielversprechende Hinweise liefern, die unsere Ungerechtigkeit vertiefen könnenVerständnis von mehreren neuronalen Störungen. In dieser Arbeit stellen wir eine wertvolle Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen mit einem kostenlosen Softwarepaket namens Manual Tracking vor. Ziel war es, eine schnelle Quantifizierungsmethode zur Analyse der Vesikelmotilität zu entwickeln. Diese Quantifizierung wird durch einen Standardansatz des Klickens auf einen Referenzpunkt in jedem Rahmen eines Zeitrafferfilms gelenkt. Die Verwendung der manuellen Tracking-Software macht diesen Ansatz im Gegensatz zu anderen Anwendungen ganz einfach und von weitem Nutzen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz auch auf andere Zellen, wie Gliazellen, anwendbar. Obwohl diese Methode primitiv ist, kann sie auf verschiedene Analysen angewendet werden, einschließlich der zellulären Motilität und der morphologischen Veränderung. Beispielsweise können nach der Definition eines Referenzpunktes über eine Sequenz von Bildern Informationen über die Positionen der Referenzpunkte und die Zeit an jeder Position aus sequentiellen Bildern unter Verwendung von Datenanalyse und Bildverarbeitung weich extrahiert werdenWare. Zusammengenommen ist diese Methode einfach, aber leistungsfähig und trägt zur Entwicklung einer verbesserten Effizienz in Studien auf der Grundlage von Membran-Trafficking, wie die untersucht Endosom-Lysosom-Funktion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptmycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine &#34;Max&#34;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24765</td>
			<td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOREVO BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation system INUG2-K13</td>
			<td>Tokay Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel version 15</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ verion 1.47</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

Im Gehirn spielen Membran-Trafficking-Systeme eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Funktionen wie neuronaler Morphologie, synaptischer Plastizität, Überleben und Glia-Kommunikation. Bisher haben zahlreiche Studien berichtet, dass Defekte in diesen Systemen verschiedene neuronale Erkrankungen verursachen. So kann das Verständnis der Mechanismen, die der Vesikeldynamik zugrunde liegen, einflussreiche Hinweise liefern, die bei der Behandlung von mehreren neuronalen Störungen helfen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung von Vesikelmotazitäten, wie Motilitätsabstand und Bewegungsgeschwindigkeit, mit einem Software-Plug-In für die ImageJ-Plattform. Um Bilder zur Quantifizierung zu erhalten, markierten wir neuronale Endosom-Lysosomenstrukturen mit EGFP-markierten Vesikelmarkerproteinen und beobachteten die Bewegung von Vesikeln mit einer Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ist sehr nützlich und vereinfacht die Messung der Vesikelmotilität in Neuriten wie Axonen und Dendriten sowie im Soma von Neuronen und Gliazellen. WeiterDiese Methode kann auf andere Zelllinien, wie Fibroblasten und Endothelzellen, angewendet werden. Dieser Ansatz könnte einen wertvollen Fortschritt für unser Verständnis des Membranhandels darstellen.

Dieser Assay wurde entwickelt, um die Vesikeldynamik in der in vitro Kultur zu messen. Dieser Assay wurde verwendet, um die Vesikelmotilität zu bestimmen, die mit der neuronalen Morphologie und dem Überleben assoziiert ist. Abbildung 1A und B zeigen repräsentative Daten, die die Lysosomenmotilität in Neuronen zeigen. Kortikale Neuronen wurden mit dem Lysosommarker, LAMP-EGFP, transfiziert und unter Verwendung eines Standard-Fluoreszenzmikros...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.0K Aufrufe.  University of Tsukuba.  Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann. 

Serie: Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

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Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

Großflächige Aufnahme von Neuronen durch Movable Silicon Probes in Behaving Nagetiere

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen