Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking. Dies sind Hautmelozyten. Die schwarz gefärbten Organellen, die Sie in den Zellen sehen, werden Melanosomen genannt.
Melanosomen sind als eine Klasse von Organellen bekannt, die als Lysosom-verwandte Organellen oder LRO bezeichnet werden. Recycling-Endosomen sind röhrenförmige vesikuläre Organellen aus frühen oder sortierenden Endosomen in allen Zelltypen. Diese Organellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Biogenese von Melanosomen, einer Lysozom-verwandten Organelle, die von Melanozyten produziert wird.
Recycling-Endosomen liefern die Melanozyten-spezifische Fracht während ihrer Bildung an vorzeitige Melanosomen. Die Erzeugung von Recycling-Endosomen, die bei mehreren Syndromen beobachtet wird, sind Zellen in der Hyperpigmentierung von Haut, Haaren und Auge. Daher ist die Untersuchung der Dynamik des Recyclings von Endosomen nützlich, um die Funktion dieser Organellen unter normalen und Krankheitsbedingungen zu verstehen.
Diese Studie zielt darauf ab, die Dynamik der Recycling-Endosomen unter Verwendung der blockierenden SNARE-Syntaxin-13 zu messen. Der erste Schritt ist die Aussaat von Mausmelozyten auf vorbehandelten Deckgläsern. Beschichten Sie die Glasdeckgläser in der Petrischale im Basalmembranmatrixmedium.
Und trocknen Sie es in der Gewebekulturhaube für 15 Minuten. Waschen Sie die Deckgläser vor Gebrauch einmal mit 1X PBS. Säen Sie die Zellen auf der Basalmembran medium beschichtete Deckgläser mit 50 bis 60% Kompetenz.
Geben Sie der plattierten Zellsuspension immer 200 Nanomolare PMA in vollständigen RPMI-Medien hinzu. Nachdem Sie die Zellen ausgesät haben, inkubieren Sie die Schale mit den Zellen im CO2-Inkubator für 12 bis 24 Stunden. Der zweite Schritt ist die Transfektion von Zellen mit Syntaxin-13-Plasmiden.
Die DNA- und Transfektionsreagenzien enthaltenden Spitzen inkubieren, fünf Minuten mischen und ohne wiederholtes Pipettieren mischen. Klopfen Sie mit der Hand alle zehn Minuten bei Raumtemperatur 30 Minuten lang auf die Tube. Waschen Sie die Zellen während der Inkubation zweimal mit 1X PBS, einmal mit OPTI-MEM und geben Sie dann 1 mil OPTI-MEM zu den Zellen.
Nach 30 Minuten Inkubation die Transfektionsreagenzien-DNA-Mischung tropfenweise zu den Zellen geben, indem Sie die Schale abdecken. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden. Aspirieren Sie das OPTI-MEM-Medium mit Transfektionsreagenz und fügen Sie ein vollständiges RPMI-Medium hinzu, das mit 200 Nanomolaren PMA ergänzt wird.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Der dritte Schritt ist die Fixierung der Zellen. Bitte beachten Sie, dass das folgende Verfahren außerhalb der Gewebekulturhaube durchgeführt wird.
Nach 48 Stunden Transfektion die Zellen zweimal mit 1X PBS waschen und dann die Zellen mit 3% Formaldehyd für 30 Minuten fixieren. Nach der Fixierung die Zellen zweimal mit 1X PBS waschen und die Deckgläser bis zur weiteren Verwendung in 1X PBS aufbewahren. Alternativ können Zellen auf Glasplatten montiert oder bei vier Grad Celsius gelagert werden.
Der vierte Schritt ist die Immunfärbung der Zellen. Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor. Legen Sie parafilmgeschnittenes Stück auf ein Mausfilterpapier in eine Petrischale.
Abdeckung mit Aluminiumfolie. Bereiten Sie 25 Mikroliter primäre Antikörperlösung vor. Fügen Sie Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 200 hinzu.
Fügen Sie diese Lösung als Tropfen auf den Parafilm in der Feuchtkammer hinzu. Heben Sie den Deckstab vorsichtig mit einer Pinzette an. Kehren Sie es auf dem Tropfen der primären Antikörperfärbelösung um und bedecken Sie dann den Deckel der Feuchtkammer.
Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. In ähnlicher Weise die sekundäre Antikörperlösung in einer Verdünnung von eins bis 500 herstellen und auf den Parafilm neben dem Deckglas in der Feuchtkammer legen. Um den Kern zu färben, fügen Sie DAPI in einer Verdünnung von 120.000 bis 130.000 zur Lösung hinzu.
Nehmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Deckslip von der primären Antikörperlösung auf und tauchen Sie ihn zweimal in 1X PBS. Tippen Sie auf das Deckglas auf Seidenpapier, um das überschüssige PBS auf dem Deckglas zu entfernen. Legen Sie es auf die sekundäre Antikörperfärbelösung in der Feuchtkammer und setzen Sie es aufgrund des Vorhandenseins fluoreszierend gefärbter Antikörper in der Lösung nicht dem Licht aus.
Nehmen Sie nach der Inkubation vorsichtig den Deckglas von der sekundären Antikörperlösung auf und tauchen Sie ihn dann zweimal in 1X PBS. Tippen Sie außerdem auf das Deckglas auf Seidenpapier, um das überschüssige PBS auf dem Deckglas zu entfernen. Legen Sie 12 Mikroliter bildgebendes Reagenz auf einen Glasobjektträger und legen Sie den gefärbten Deckglas vorsichtig auf das Montagereagenz.
Drehen Sie den Glasträger auf das Seidenpapier und drücken Sie ihn dann vorsichtig an. Als nächstes bilden Sie den Deckglas mit einem Fluoreszenzmikroskop ab und analysieren Sie die Bilder mit ImageJ. Der sechste Schritt ist die Quantifizierung der Überlappung zwischen den lokalisierten Proteinen des Recycling-Endosoms und melanosomen.
Quantifizierung der Syntaxin-13-Delta-129-Kolokalisation mit den Melanosomen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie von Syntaxin-13 in Maus-Wildtyp-Melanozyten zeigte GFP-Syntaxin-13-Wildtyp, lokalisiert als vesikuläre und tubuläre Strukturen. Und GFP-syntaxin-13 delta-129 lokalisiert neben der Zelloberfläche auch ringartige Strukturen.
Darüber hinaus zeigte intrazelluläre ringförmige GFP-Syntaxin-13 delta-129 eine Kolokalisierung mit dem Melanosomenprotein TYRP1 in hellfeldbildenden Melanosomen. Wie bereits gezeigt, wird eine Kohorte des überexprimierten GFP-Syntaxin-13-Wildtyps in Melanosomen beobachtet. Um die relative Lokalisierung von GFP-Syntaxin-13 Wildtyp und GFP-Syntaxin-13 Delta-129 zu Melanosomen zu messen, wurde Fidschi-Software verwendet und die Analyse mit dem JACOP-Plugin durchgeführt.
Der gemessene Mander-Überlappungskoeffizient, also MOC, zwischen GFP-Syntaxin-13 Delta-129 mit TYRP1 ist etwa 1,5-fach höher als GFP-Syntaxin-13 Wildtyp mit TYRP1. Interessanterweise zeigte TYRP1 mit GFP-syntaxin-13 delta-129 2,9-fach höhere MOC-Werte als GFP-syntaxin-13 wild type. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Lokalisation von GFP-Syntaxin-13-Delta-129-Melanosomen im Vergleich zum GFP-Syntaxin-13-Wildtyp im Steady State relativ höher ist.
Quantifizierung der Syntaxin-13-Wildtyplokalisierung der Recycling-Endosomen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie des GFP-Syntaxin-13-Wildtyps zeigte eine Kolokalisierung mit dem bekannten recyclingenden endosomalen Protein Rab11. Der MOC zwischen GFP-syntaxin-13 wild type mit mCherry-Rab11 ist ca. 1,4-fach höher als mCherry-Rab11 mit GFP-syntaxin-13 wild type.
Um die Anzahl und Länge der GFP-Syntaxin-13-Wildtyp-positiven endosomalen Tubuli zu messen, wurde die Fidschi-Software wie im Protokollabschnitt beschrieben verwendet. mCherry-Rab11 wird in den Experimenten als Positivkontrolle verwendet. Melanozyten, die mit dem GFP-Syntaxin-13-Wildtyp transfiziert wurden, zeigten eine höhere Anzahl von Tubuli pro Zelle im Vergleich zu Zellen, die mCherry-Rab11 exprimieren.
Die Tubuli sind jedoch bei Koexpression sowohl des GFP-Syntaxin-13-Wildtyps als auch des mCherry-Rab11 in den Zellen reduziert. Der siebte Schritt ist die Quantifizierung der Anzahl und Länge des Recyclings von Endosomen. Die Tubuli werden bei Koexpression sowohl des GFP-Syntaxin-13-Wildtyps als auch des mCherry-Rab11 in den Zellen reduziert.
Interessanterweise ist die durchschnittliche Tubulilänge sowohl vom GFP-Syntaxin-13-Wildtyp als auch von mCherry-Rab11 in Zellen, die sich einzeln oder zusammen exprimieren, miteinander vergleichbar. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass GFP-Syntaxin-13 Wildtyp für das Recycling von Endosomen ähnlich wie Rab11 lokalisiert ist. Diese Studie zeigte, dass die N-terminale Abgabe von Syntaxin-13-Mutante, d.h. GFP-Syntaxin-13 Delta-129, auf Melanosomen lokalisiert ist GFP-Syntaxin-13 delta-129 kann möglicherweise als Reporter für den vesikulären Transport von Recycling-Endosomen zur Zelloberfläche und LRO verwendet werden.
Im Gegensatz dazu lokalisiert GFP-Syntaxin-13 Wildtyp das Recycling von Endosomen ähnlich wie Rab11. Diese Studie zeigte, dass der GFP-Syntaxin-13-Wildtyp auch zur Markierung von Recycling-Endosomen in Melanozyten verwendet werden könnte. Der GFP-Syntaxin-13-Wildtyp könnte ein besserer endosomaler Marker für das Recycling sein als Rab11, da Rab11 die endosomale Dynamik verändert.
Insgesamt wirkt der GFP-Syntaxin-13-Wildtyp als potenzieller endosomaler Recycling-Marker, um die Dynamik unter stationären Bedingungen zu untersuchen.
