Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Isolierung von BFU-E und CFU-E erythroiden Vorläuferzellen direkt aus frisch geerntetem Mausgewebe wie Knochenmark und Milz. Mit dieser Technik können wir reine Populationen von erythroiden Vorläuferzellen isolieren, was mit den bisherigen Flussprotokollen nicht möglich war. Diese Methode verbessert unsere Fähigkeit, Mausmodelle mit Erythroiden zu untersuchen, erheblich, indem sie die Isolierung von Vorläuferzellen für viele nachgelagerte Experimente ermöglicht.
Legen Sie zunächst die frisch präparierten Oberschenkelknochen und das Schienbein direkt in den Kaltfärbepuffer oder SB-5 und halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis Sie bereit sind, das Knochenmark zu extrahieren. Legen Sie einen sauberen sterilisierten Mörser auf Eis in einen Eimer und übertragen Sie die Knochen in den Mörser. Schneiden Sie mit der Dissektionsschere etwa 1 Millimeter Enden jedes Knochens ab.
Verwenden Sie eine 3-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel mit SB-5 ausgestattet ist, um das Knochenmark aus den Knochen zu spülen und in den Mörser zu sammeln, und wiederholen Sie den Vorgang 3 bis 5 Mal mit frischem Puffer, bis die Knochen farblos erscheinen. Filtern Sie das gespülte Knochenmark durch ein 100-Mikrometer-Netz und sammeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird. Als nächstes verwenden Sie den Mörser und den Stößel, um die gespülten Knochen in 5 bis 10 Milliliter SB-5 zu zerkleinern.
Filtern Sie die Mischung aus zerkleinerten Knochen und puffern Sie sie durch das 100-Mikrometer-Zellsieb, um sich mit den zuvor gesammelten Zellen zu sammeln. Stellen Sie einen 100-Mikrometer-Maschenfilter auf einem leeren 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf, das auf Eis gelegt wird. Legen Sie eine einzelne Milz auf den Netzfilter und fügen Sie der Milz 0,5 bis 1 Milliliter SB-5 hinzu, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknet.
Drücken Sie die Milz mit der Gummiseite eines 3- oder 5-Milliliter-Spritzenkolbens durch das Netz. Fügen Sie mehr SB-5, 5 Milliliter auf einmal, hinzu und pürieren Sie weiter, bis sich alle Zellen in der Tube gesammelt haben. Bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie die gesammelten Zellen mit 2 Millilitern SB-5 mit einer großen Öffnungsspitze auf und ab pipettieren.
Färben Sie die Fluoreszenz minus eins oder FMO-Kontrollen, indem Sie alle Antikörper mit Ausnahme des gleichnamigen Antikörpers des FMO in die Zellsuspension im FACS-Röhrchen geben. Um die einfarbigen Kontrollen zu färben, fügen Sie der Zellsuspension im FACS-Röhrchen einen einzelnen Antikörper hinzu. Jedes Steuerrohr für 2 bis 3 Sekunden bei 3000 U/min vorwirbeln und dann bei 4 Grad Celsius 2,5 Stunden im Dunkeln schaukeln inkubieren.
Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen mit SB-5 und füllen Sie das Volumen der Zellsuspension mit SB-5 auf 4 Milliliter auf. Schleudern Sie die Zellen bei 900 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius und saugen Sie den Überstand ab. Hängen Sie die ungefärbte und alle einfarbigen Kontrollen in 300 Mikroliter SB-5 und filtern Sie durch ein 40-Mikrometer-Filtergitter in neue FACS-Röhrchen.
Stellen Sie eine DAPI-SB-5-Lösung her, indem Sie den DAPI-Bestand in einem Verhältnis von 1 zu 10.000 in SB-5 verdünnen. Suspendieren Sie das FMOS in 1,8 Milliliter DAPI SB-5 und DAPI einfarbige Steuerung in 300 Mikroliter DAPI SB-5 und filtern Sie sie dann durch ein 40-Mikrometer-Filtergitter in neue FACS-Röhrchen. Nach Zugabe der Antikörper-Mastermischung zu jeder Probe werden die Röhrchen für 2 bis 3 Sekunden bei 3000 U/min gewirbelt, gefolgt von einer Inkubation bei 4 Grad Celsius im Dunkeln für 2,5 Stunden im Schaukelzustand.
Nach dem Waschen der Zellen, wie zuvor gezeigt, resuspendieren Sie die Proben in 1,8 Milliliter DAPI SB-5 und filtrieren Sie durch ein 40-Mikrometer-Filtergitter in ein neues FACS-Röhrchen und analysieren Sie die Proben mit einem Zystometer. Verwenden Sie die Vorwärtsstreuung, um die Trümmer basierend auf der Größe zu entfernen, und verwenden Sie dann das Histogramm Vorwärtsstreuhöhe versus Vorwärtsstreufläche, um Zellaggregate auszuschließen und einzelne Zellen auszuwählen. Wiederholen Sie den Ausschluss mit dem Histogramm Seitenstreuhöhe versus Seitenstreufläche.
Schließen Sie die toten Zellen aus, indem Sie die positiven Zellen für DAPI ausschließen. Wählen Sie die Abstammungslinie negative TUR eine 19 negative Kit-positive Zellen. Und wählen Sie aus diesen eine Subpopulation aus, die CD 55 exprimiert.
Unterteilen Sie die Abstammungslinie negative TUR 19, negatives Kit, positive, CD 55 positive Zellen in 2 Hauptpopulationen, P sechs und P sieben basierend auf der Expression von CD 49 F und CD 1 0 5. Basierend auf der Expression von CD 150 und CD 41 wird P 6 weiter unterteilt in P 3, P 4 und P 5. In ähnlicher Weise wird P 7 auf der Grundlage der Expression von CD 150 und CD 71 weiter unterteilt in BFUE, frühe CFUE und späte CFUE.
In der vorliegenden Studie wurden aus den frisch entnommenen Knochenmark- und Milzzellen platz- und koloniebildende Einheiten identifiziert. Nach 72 Stunden Erythropoietin oder Vehikelinjektion in die Mäuse zeigte die Erythropoetin-Stimulation eine Ausdehnung der frühen und späten koloniebildenden Einheitenpopulationen P 1 niedrig und P 1 hoch in den geernteten Knochenmark- und Milzzellen. Die Reaktion von Knochenmark- und Milzvorläuferzellen auf Erythropoietin in vivo zeigte auch eine höhere Anzahl von Zellen in den frühen und späten koloniebildenden Einheitenpopulationen P 1 niedrig und P 1 hoch im Vergleich zur Vehikelkontrolle.
Es ist am wichtigsten, eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen, bevor die Zellen mit Antikörpern markiert werden. Dies kann erreicht werden, indem wiederholt nach oben und unten pipettiert wird und EDTA in den Puffer aufgenommen wird. Die gereinigten Vorläuferzellen können für jede nachgeschaltete zelluläre und molekulare Analyse verwendet werden.
Zum Beispiel Einzelzell-Transkriptomik, Atesque, Kolonie-Assays und Biochemie. Diese Technik half uns, die Vorhersagen aus Einzelzell-RNA-seq-Experimenten zu testen.
